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POKemon、p14ARF基因链在大肠癌细胞系的表达及其临床意义
目的 研究POKemon、p14ARF基因在结直肠癌细胞系中的表达情况.方法 采用反转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、细胞免疫化学技术检测POKemon、p14ARF在5种人类结直肠癌细胞中的表达.结果 POKemon在SW480、SW480/M5、LOVO、SW620中阳性表达,在HCT116阴性表达;p14ARF在HCT116阳性表达,其余细胞均阴性表达.结论 结直肠癌细胞系中存在POKemon的表达,且与p14ARF作用呈负相关.
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X射线对人肺腺癌A549细胞Pokemon基因表达的影响
目的 研究不同剂量X射线照射及照射后不同时间点对人肺腺癌A549细胞Pokemon基因表达的影响.方法 用吸收剂量分别为2、4、6和8 Gy的X射线照射体外堵养的人肺腺癌A549细胞,2、4、8、12、24、48和72 ha,用实时定量PCR技术检测其中的Pokemon mRNA表达水平,以未照射组为对照.结果 在2、4、6、8 Gy X射线照射后的早期(除2 Gy照射后的2和4 h外)Pokemon mRNA的表达降低,但在晚期(48 h以后)呈升高趋势,在大部分时间点实验组与对照组的差异有统计学意义(t=3.40～154.76,P<0.05).结论 较大剂量的X射线在早期可下调A549细胞Pokemon基因mRNA的表达,诱导肿瘤细胞凋亡;但在晚期又可诱导A549细胞高表达PokemonmRNA,这可能与辐射所致A549细胞的DNA损伤修复和细胞周期调控有关.
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Pokemon、c-myc在结直肠癌中的表达及意义
目的：探讨结直肠癌组织Pokemon和c-myc蛋白表达的变化和意义。方法：SP免疫组化法检测60例结直肠癌组织和癌旁正常组织Pokemon和c-myc蛋白的表达情况。结果：结直肠癌组织Pokemon和c-myc蛋白的阳性表达率均明显高于正常组织(P＜0.01)；结直肠癌组织Pokemon和c-myc蛋白的阳性表达与分化程度、Dukes分期和淋巴结转移有关(P＜0.01，P＜0.05)；结直肠癌组织中，Pokemon和c-myc蛋白的表达呈显著正相关(r=0.615，P＜0.05)。结论：Pokemon和c-myc对结直肠癌的诊断和预后评判具有一定的价值。
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Pokemon、Ki-67蛋白在胃癌中的表达和临床意义
目的 探讨Pokemon、Ki-67蛋白在胃正常黏膜与胃癌组织中的表达及其意义.方法 应用RT-PCR法检测25例胃正常黏膜及125例胃癌组织中Pokemon、Ki-67蛋白的表达,并联系临床病理学指标进行相关分析.结果 在正常胃黏膜中Pokemon和Ki-67不表达或弱表达,在胃癌组织中表达增高,并与TNM分期及有无淋巴转移有关,与年龄、性别、肿瘤大小无关.结论 Pokemon、Ki-67蛋白的表达与胃癌的发生、发展和转移密切相关,可能共同参与了胃癌的发生、发展.Pokemon有望成为胃癌治疗的一个有效靶基因,从而为胃癌基因治疗开辟新的途径.
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利用RNA干扰技术分析Pokemon对Lovo增殖过程的影响
目的 探索干扰Pokemon基因对大肠癌细胞系Lovo增殖和细胞周期的影响.方法 采用miRNA技术干扰Pokemon基因不同位点,运用q-PCR检测干扰后Lovo细胞中Pokemon mRNA的表达,MTT和流式细胞仪分析转染后细胞增殖和细胞周期的变化.结果 成功构建含miRNA片段的重组质粒,依次命名为mR22-1、2、3、4.转染Lovo细胞后,Pokemon基因的mRNA表达水平明显下调,以mR22-1强,干扰效率为50%±2.7%,对照组之间有统计学意义(P＜0.01).MTT显示mR22-1可明显抑制细胞增殖,24h、48h和72h的抑制率分别为23%±2.1%、47%±3.0%和69%±2.5%,呈时间依赖性;流式细胞仪测定转染后Lovo细胞周期阻滞在G1期.结论 采用RNAi技术可以特异性阻断Pokemon基因的表达;Pokemon基因有促进大肠癌细胞株Lovo增殖的作用.
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Pokemon基因在肝癌细胞中的表达及意义
目的 探讨Pokemon在肝癌细胞中的表达及意义,进一步阐明肝细胞癌发生发展过程中的分子机制.方法 选择肝癌细胞HepG2、SMMC7721和人胚胎肝细胞LO2细胞株,应用Western blot法检测Pokemon在不同细胞中的表达；应用基因沉默方法抑制Pokemon在肝癌细胞中的表达,应用流式细胞仪观察肝癌细胞的凋亡情况.结果 Pokemon在肝癌细胞HepG2、SMMC7721中的表达明显高于人胚胎肝细胞LO2；siRNA抑制Pokemon的表达后,肝癌细胞凋亡明显增加.结论 原癌基因Pokemon在肝癌细胞中表达明显增高,Pokemon可能在肝癌的发生、发展过程中起重要作用.
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沉默Pokemon基因对鼻咽癌细胞株CNE-2放射敏感性的影响
[目的]探讨沉默Pokemon基因对鼻咽癌细胞(CNE-2)放射敏感性的影响,寻求放射治疗鼻咽癌的新方法.[方法]首先利用siRNA预测软件得到3条siRNA序列,并制备合成siRNA片段,利用RT-PCR和免疫印迹法检测其沉默Pokemon基因的效果,筛选出沉默效果佳的siRNA片段,转染CNE-2细胞后观察其对CNE-2细胞p53基因表达的影响、MTT法检测细胞的增殖活性、流式细胞术检测细胞的凋亡、克隆形成法检测转染siRNA联合放射处理后细胞的放射增敏比.[结果]成功筛选出了沉默效应佳的siRNA片段,转染CNE-2细胞后能显著降低其Pokemon基因的表达、提高p53基因的表达、降低细胞的增殖活性、加速细胞的凋亡,同时增加了CNE-2细胞的放射敏感性.[结论]沉默Pokemon基因能增加鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性,这为临床鼻咽癌的放射增敏治疗提供了新思路.
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Pokemon基因siRNA逆转录病毒的制备及其对Hela细胞增殖的影响
目的 针对多种肿瘤细胞高表达Pokemon基因的特性,制备表达针对Pokemon基因的siRNA的逆转录病毒,研究其对感染肿瘤细胞中Pokemon基因沉默情况,探讨肿瘤防治的新方法.方法 首先利用siRNA预测软件得到4条siRNA编码DNA序列,再构建重组逆转录病毒siRNA表达质粒;利用RT-PCR技术筛选出高表达Pokemon基因的肿瘤靶细胞.然后,将重组质粒转染靶细胞,利用实时定量RT-PCR和MTT等方法筛选出沉默效果佳的siRNA.利用逆转录病毒包装细胞制备重组病毒,鉴定病毒滴度及其对体外培养细胞中Pokemon基因的沉默效应.结果 通过酶切鉴定和测序等方法证实了预测出的四条siRNA编码DNA片段成功地构建到逆转录病毒表达载体pSilencer 5.1-H1中.通过将这些重组质粒转入高表达Pokemon基因的Hela肿瘤细胞中,抗生素压力筛选出相应表达各种siRNA的细胞株,再从中筛选出了1个有50%以上沉默效应的候选siRNA.利用这一条siRNA表达质粒,在逆转录病毒包装细胞中制备出了滴度为105cfu/mL的重组病毒.此重组病毒感染Hela细胞后能显著降低其中Pokemon基因的表达.结论 成功制备了表达人Pokemon基因siRNA的重组逆转录病毒,并且在体外实验中证实了该病毒能对肿瘤细胞Hela的增殖产生明显的抑制作用,为下一步的体内抗肿瘤研究提供了有力的佐证.
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Pokemon基因siRNA逆转录病毒重组表达质粒的构建及鉴定
目的针对Pokemon基因对于许多肿瘤抑制基因和原癌基因上游的作用,将其作为RNAi的靶基因,构建表达这些siRNA的重组逆转录病毒表达质粒.方法利用Ambion公司的网上设计工具设计针对Pokemon肿瘤基因的4条siRNA序列,并化学合成4对互补的siRNA的DNA片段.将此双链DNA片段克隆到pSilencer 5.1-H1 Retro vector的BamHⅠ和HindⅢ位点,构建其逆转录病毒重组表达质粒.结果表达人类Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒构建成功.结论我们成功构建了人类Pokemon基因的重组逆转录病毒重组表达质粒,为下一步Pokemon基因的RNA干扰提供了实验依据,并且开辟了肿瘤基因治疗的新思路.
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Pokemon基因研究进展
Pokemon基因,即POK红系髓性致癌因子(POK erythroid myeloid Ontogenic factor),是近发现的一种抑癌基因,该基因参与一些细胞基因转录的调节及细胞分化,它也是重要抑癌基因-可变读框基因(alterative reading frame,ARF)的中心调节因子.现研究发现,Pokemon基因在多种人类肿瘤中过度表达,并且缺乏Pokemon基因的细胞对致癌转化不应答,它还能控制其他癌基因的活性,并对肿瘤细胞的一些重要特性产生影响,促进癌瘤发生.已经证实一些人类肿瘤如淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和膀胱癌中其表达水平很高,因此,对Pokemon基因的研究有可能为肿瘤的治疗提供新的途径和方法该基因在肿瘤发生过程中起着关键性作用,并有望成为肿瘤治疗的新靶点.
