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Vero细胞微载体放大培养技术研究
目前，国内大部分疫苗企业仍采用传统的转瓶细胞培养工艺来生产病毒性疫苗，该方法存在细胞密度低、病毒滴度低、劳动强度大等缺点。20世纪70年代，建立了微载体/生物反应器培养动物细胞的工艺[1]，把悬浮培养和贴壁培养两种培养工艺融合在一起，兼有两者的优点，使得动物细胞工业化的大规模、高密度培养，以满足生物技术发展的需要，而细胞微载体放大培养就是其中的关键技术之一[2]。
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干细胞转化技术是干细胞基础和未来临床移植研究的基石
背景：干细胞转化技术研究已成为干细胞研究的一个活跃领域，对干细胞基础研究及临床研究均产生巨大的推动作用。目的：对干细胞转化技术研究现状及进展做一综述。方法：在标题和摘要中，以“Stem cels,Transformation, differentiation”或“干细胞，转化，分化”为主题检索词，检索中国期刊全文数据库(CNKI)、PubMed数据库中2000年1月至2015年4月关于干细胞分化技术的文章。优先选择近期发有或发表在权威杂志上的文章。初检得到121篇文章，根据纳入标准，选择其中的64篇进行综述。结果与结论：干细胞转化技术近些年来取得了较大的进展，包括改进培养液的配比，增加特定的诱导因子、蛋白质、酶、受体，注射特定的基因，使用新氧化剂，改善培养微环境，在低氧环境下培养，使用支架，采用转基因技术，三维球形培养，共培养等。干细胞转化新技术的诞生和使用，显著提高了干细胞的转化率，为人类难治性疾病的治疗带来希望。
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转基因骨髓基质细胞治疗缺血性脑损伤的研究进展
一、骨髓基质细胞的概述骨髓基质细胞(marrow stromal cell,MSC)是骨髓内除造血干细胞之外的非造血干细胞,通常称之为间充质干细胞(mensenchymal stem cell),非造血干细胞(nonhematopoietic stem cell)或成纤维细胞形集落(colony-forming-unit fibroblast).早在1867年,德国病理学家Cohnheim在研究创伤愈合时就提出了骨髓中存在非造血干细胞的观点[1].20世纪70年代中期Friedenstein等[2]首先利用骨髓基质细胞贴壁生长的特性,通过贴壁培养的方法分离得到了骨髓基质细胞.
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悬浮培养CHO细胞生产重组人促红细胞生成素条件的优化
目的:通过对贴壁培养CHO细胞筛选驯化,得到高表达的细胞后进行悬浮培养生产重组人促红细胞生成素(rHuEPO).方法:利用96孔板和24孔板对CHO细胞进行筛选,得到高表达细胞株后进行驯化,使其适合悬浮培养,经过摇瓶扩增后接种到生物反应器中无血清培养,每天监测葡萄糖含量,测rHuEPO表达量.结果:悬浮培养CHO细胞生产rHuEPO,生产周期短,表达量比贴壁培养高出很多,操作方便,减少污染,易于放大,并建立了适合悬浮培养的CHO细胞株,为工业化悬浮培养CHO细胞生产rHuEPO提供了技术基础.结论:经过工艺优化后利用无血清悬浮培养生产促红细胞生成素平均表达量较贴壁培养高,生产周期短,有利于降低生产成本.
关键词： 重组人促红细胞生成素 悬浮培养 贴壁培养 -
EGF、bFGF、BDNF对大鼠海马神经干细胞增殖和分化的作用
目的探讨EGF、bFGF、BDNF对大鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和分化的作用.方法建立大鼠海马NSCs原代和克隆培养模型,将EGF、bFGF单独或联合加入培养基中,应用相差显微镜及Nestin、GFAP、NSE免疫组织化学方法观察其对NSCs克隆形成及分化的影响,取EGF、bFGF联合作用传3代的NSCs进行贴壁培养,同时加入BDNF,观察其对NSCs定向分化的影响.结果 EGF促进海马NSCs增殖,但迁移和分化少见;bFGF作用下NSCs迁移和分化明显;EGF、bFGF联合作用可形成大的NSCs克隆;EGF、bFGF、BDNF共同作用下可见典型的神经元样细胞,NSE染色阳性.结论 EGF促进大鼠海马NSCs的增殖,bFGF则主要促进其迁移和分化,BDNF可促进EGF、bFGF联合作用的NSCs定向分化为神经元.
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增殖型血管平滑肌细胞模型的培养改良
以往使用的血管平滑肌细胞(VSMC)模型是直接用正常血管贴壁培养传代细胞,并认为传至第5代以后即为分泌型[1].但我们通过检测特异性表型表达基因SM22α发现,按以往传代培养的VSMC仍有表达.
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骨髓间充质干细胞及其临床应用前景
干细胞是近年来生物学上具挑战性、也有吸引力的领域之一.其中造血干细胞(HSC)已经应用于临床,在治疗血液系统恶性疾病、遗传性免疫缺陷等方面取得了显著的成就.除了造血干细胞以外,在机体成熟组织中还存在非造血干细胞(如肌肉干细胞、神经元干细胞、表皮层干细胞等),在机体受到外伤、老化、疾病等损伤时,这些细胞就增殖分化,产生新的组织来替代它们,以保持机体的稳态平衡.骨髓间充质干细胞(MSC)位于骨髓的基质细胞系中,在体外可以通过贴壁培养加以分离,分裂增殖能力强,可以分化为多种结缔组织细胞(纤维、骨、软骨、腱、肌肉、脂肪),并易于被外源基因转染且稳定表达,被认为是组织工程、细胞及基因治疗理想的靶细胞.因此,骨髓MSC已成为该领域研究的热点之一.
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悬浮培养与贴壁培养方式神经干细胞分化表型特点
目的 观察神经干细胞在悬浮培养与贴壁培养方式下的形态学特点及分化表型.方法 新生6 h内的大鼠皮质应用无血清悬浮培养与贴壁培养神经干细胞(NSCs)技术培养,观察神经干细胞的形态学特点.体外胎牛血清(FBS)诱导NSCs分化,通过巢蛋白(Nestin)和GFAP免疫荧光染色鉴定分化表型.台盼蓝活细胞计数法比较细胞增殖能力.结果 新生大鼠皮质应用无血清悬浮培养可获得稳定的NSCs细胞球,应用贴壁培养形成长梭状NSCs,NSCs巢蛋白免疫荧光染色结果呈阳性.体外FBS诱导分化后,神经球内开始出现放射状的神经纤维丝,免疫荧光染色可见GFAP阳性细胞向外伸展以及Nestin阳性细胞边集.贴壁的NSCs分化成星形胶质细胞,免疫荧光染色可见Nestin和GFAP染色阳性细胞.在相同条件下,应用悬浮培养在第2~3d时增殖速度大,而以贴壁培养方式培养出的神经干细胞在第4~5 d时增殖速度大.结论应用无血清培养物B27与bFGF、EGF组合的NSCs完全培养基通过悬浮培养法与贴壁培养法,都可以成功在体外培养出NSCs;悬浮培养法培养NSCs在早期增殖速率上优于贴壁培养法.
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Bmi-1基因表达与人骨髓间充质干细胞增殖关系的探讨
目的:建立人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外培养体系,研究hMSCs表面抗原的表达情况,以及体外传代培养对Bmi-1基因表达变化的影响,为进一步探讨Bmi-1基因在hMSCs增殖中的作用及调控机制提供依据.方法:骨穿抽取骨髓,以1.077g/ml的Ficoll分离液梯度密度离心,收集单个核细胞进行培养和传代,观察细胞形态和生长周期.取P4代的hMSCs,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达情况.通过SA-β-gal的染色检测细胞的老化程度,通过抽提各代次细胞的RNA,逆转录PCR定量Bmi-1基因量的变化,分析与细胞倍增代数的关系.结果:体外培养的hMSCs贴壁生长,呈长梭形,可增殖形成克隆.经分离纯化培养后,流式细胞仪显示细胞表型为CD13,CD105,少量表达CD33,不表达造血细胞的标志CD34及CD117.SA-β-gal的染色显示随细胞培养时间延长,SA-β-gal染色更明显和清晰.逆转录PCR显示随传代次数的增加,hMSCs的增殖能力逐渐下降,Bmi-1基因表达随培养时间而减少.结论:本培养体系可获得纯度较高的hMSCs,具有强大的增殖能力.Bmi-1基因极可能是影响MSC增殖能力的一个重要基因.
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人脐带间充质干细胞分离和初步鉴定
目的 寻找一种高效获得稳定人脐带间充质干细胞的方法.方法 采集3例足月剖宫产健康胎儿脐带,剥离血管及外膜得到Wharton's胶.贴壁培养脐带Wharton's胶,收集爬出的细胞进行传代,观察细胞形态;取第3代细胞采用流式细胞学检测细胞表面抗原的表达情况;使用成骨、成脂诱导分化的方法对第3代细胞进行分化潜能的鉴定,成骨诱导细胞用茜素红染液染色,成脂诱导细胞用油红O染液染色,并与未诱导分化的细胞进行比较.结果 Wharton's胶培养10 d左右可见梭形细胞从脐带组织逸出,贴壁培养细胞,可见呈放射状或螺旋状生长;流式细胞仪检测结果显示细胞表面抗原CD29、CD44呈高表达,CD34、CD45呈低表达;成脂诱导培养基中细胞油红O染色可见红色脂滴,成骨诱导培养基中细胞茜素红染色可见红色钙质结节,未诱导的细胞未见脂滴及结节样改变.结论 贴壁培养的细胞符合间充质干细胞生长的形态,有向成骨、成脂分化的能力;贴壁法培养脐带Wharton胶可得到稳定的间充质干细胞.
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猪尾小组织块贴壁培养法分离培养成纤维细胞及转染效率的研究
目的 采取猪尾小组织块贴壁法成功分离培养出原代猪成纤维细胞并进行细胞不同时期的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性质粒转染效率的研究.方法 猪尾小组织块贴壁培养法分离培养出原代猪成纤维细胞后,传代并进行冻存和复苏,比较猪成纤维细胞原代培养、传代培养和复苏细胞存活率.绘制细胞原代培养、传代培养和复苏后的生长情况.分别在猪尾小组织块贴壁培养获得原代成纤维细胞,细胞传代和复苏后进行细胞GFP阳性质粒的Neon电转染,比较不同转染时期细胞存活率和生长情况,转染后24 h和48 h分别采用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞的GFP质粒阳性表达率.结果 猪尾小组织块贴壁培养可以成功分离培养出猪成纤维细胞,细胞冻存后复苏能保持原代细胞生物学特性,原代细胞活力很高,细胞存活率97.670％,传代培养后细胞存活率95.670％,复苏细胞存活率仍在90％以上.原代培养、传代培养和复苏培养细胞生长曲线均呈“S”型,复苏细胞生长略微缓慢.原代培养、传代培养和复苏细胞电转染后细胞存活率均有少许下降,细胞生长增殖能力减弱,但是细胞生长曲线仍呈“S”型曲线.Neon电转染后24 h均可获得GFP质粒阳性表达的猪成纤维细胞,荧光显微镜均检测到GFP质粒阳性表达的成纤维细胞,48h后流式细胞仪检测显示原代细胞阳性率8.01％,稍高于传代细胞的7.91％和复苏细胞的7.86％.复苏细胞存活率下降,转染后细胞活力下降,但转染后仍可得到7.86％GFP质粒阳性表达的猪成纤维细胞,原代培养细胞能够获得更高的阳性率,差异有统计学意义.结论 猪尾小组织块贴壁培养法可以成功分离培养出成纤维细胞,细胞传代会对细胞活力有影响,冻存后复苏也会影响细胞的存活率和细胞增殖能力.原代细胞、传代细胞和复苏细胞转染均能获得GFP阳性质粒表达.原代培养细胞具有更佳的细胞活力和阳性转染率,进行基因敲除或基因敲入等基因编辑和体细胞克隆研究,选择原代细胞作为转染对象能获得更好的基因编辑成功率.
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小鼠胚胎神经干细胞的分离及贴壁培养方法
目的 探索一种改进的贴壁培养神经干细胞的方法.方法 从胚胎期为15.5d的胎鼠大脑皮层中提取神经干细胞,在PO/FN(Poly-L-ornithine hydrochloride/Fibronectin)包被处理后的培养瓶中进行贴壁培养并传代,在倒置显微镜下观察神经干细胞的细胞形态,并通过免疫荧光法鉴定神经干细胞及其子代细胞进行分化操作之后的情况.结果 原代神经干细胞细胞形态清晰,免疫荧光标记物明显.结论 相对于传统神经球悬浮培养法该法处理简便,传代损耗低,容易观察到细胞形态和分化阶段,更有助于神经干细胞的培养和存储.
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异紫堇碱对SMC内游离钙浓度的影响
异紫堇碱是从罂粟科植物秃疮花、紫金龙中提取的一种生物碱,具有明显的镇痛、镇静、解除平滑肌痉挛等作用.文献报道,在整体动物和离体器官水平的研究,认为其扩血管作用机制与抑制钙内流和钙释放有关.本实验采用兔动脉血管组织贴块法,制备成可传代的血管平滑肌细胞(SMC).将所制备的贴壁培养的SMC制成细胞悬液,用Ca2+荧光探针Fu ra-2/AM孵化1h后,于RF-2000型双波段荧光扫描仪测定SMC内游离的游离钙离子浓度 [Ca2+]i.结果表明,异紫堇碱(isocorydine,Isoc)1μmol/L,10μmol/L,50 μmol/L和维拉帕米(verapamil)1μmol/L对静息状态下SMC的[Ca2+]i无明显影响,对高K+(50mmol/L)所致的[Ca2+]i增高则表现为抑制作用,与对照组比较,其抑制的幅度分别为8.2%、14.4%、21%,维拉帕米的抑制幅度则达48.8%.此外,上述浓度Isoc和Ver对去甲肾上腺素(NA,1μmol/L)所致[Ca2+]i增高的抑制率分别为11.2%、28.5%、37.1%和28%.结果提示:Isoc及Ver对SMC的电压依赖性钙通道和受体操纵性钙通道均有抑制作用,异紫堇碱的扩血管作用与其降低不同因子所致的[Ca 2+]i水平有关.
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产前诊断46,XX,t(5;6)平衡易位一例
携带者女,30岁.孕21周,因曾生过畸形儿要求产前诊断.曾自然流产两次,均于孕1+月时无任何诱因胎死宫内.1999年足月娩出一畸形男婴,脊柱裂.细胞遗传学检查:携带者核型为46,XX,t(5;6)(5pter→5p11∷6p11→6pter;5qter→5q11∷6q11→6qter).丈夫核型为46,XY.夫妇非近亲结婚,家族中无遗传病史. 查体:宫底脐下一横指,B超检查各项生长参数在正常值范围.2000年11月8日,B超监视下抽羊水64 ml,贴壁培养.7天收获,制片,G显带,计数50个分裂相,镜下分析10个分裂相,核型为:46,XY,t(5;6)(5pter→5p11∷6p11→6pter;5qter→5q11∷6q11→6qter)mat(图1).
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悬浮法与贴壁法提取脂肪组织分泌促成脂因子比较
目的 优化体外获取脂肪组织浸提液的提取方法,比较不同方法提取浸提液的成脂作用.方法 通过贴壁法和悬浮法培养脂肪组织获得浸提液,过滤、冷冻超离心浓缩浸提液,通过BCA试剂盒检测两种方式得到的浸提液分泌因子(secretory factors from adipose tissue explants,SFAE)蛋白总量及蛋白因子得率.等量蛋白成脂诱导第3代(P3)脂肪干细胞,诱导第7～13 d,显微镜下观察及进行油红染色,鉴定成脂情况.结果 贴壁法和悬浮法4次提取浸提液中蛋白含量的差异无统计学意义.但悬浮培养法4次重复实验蛋白因子得率更为稳定,贴壁法每次蛋白因子得率数据相差很大,每克脂肪组织获得分泌蛋白的量小时为7.3 mg,大可得到12.4 mg,而悬浮得到的蛋白因子几乎都趋近于8.7 mg.并且贴壁培养法与悬浮培养法相比,获取等量的SFAE需要T75培养瓶更多(10个),且需手工铺匀,贴壁后才能加入培养基,而悬浮培养法仅需悬浮培养瓶1个,加入脂肪组织后即可进行培养.两种方法得到的浸提液都具有促成脂效果,在等量蛋白诱导下的成脂效果差异无统计学意义.结论 悬浮和贴壁培养法得到的浸提液具有相同的促成脂能力,但是悬浮培养获得的浸提液更加省时省力且蛋白因子得率稳定,为后续研究和鉴定在SFAE中准确找到成脂因子奠定基础.
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胶质母细胞瘤中CD133+细胞的贴壁培养和乙醛脱氢酶1的表达
目的 探讨贴壁培养对获取胶质母细胞瘤中CD133+细胞的影响,观察细胞分化前后乙醛脱氢酶1(ALDH1)的表达情况.方法 采用贴壁培养法将7例胶质母细胞瘤组织行原代培养,使用免疫磁珠法分选出CD133+细胞.将部分细胞在血清条件下培养以诱导其分化,通过荧光免疫细胞化学染色观察细胞分化前后ALDH1与胚胎干细胞关键蛋白(Soχ2)的表达.结果 7例标本中,6例获得了CD133+细胞,并观察到典型的肿瘤球形成.诱导分化前肿瘤球ALDH1与Soχ2表达阳性,二者有共定位现象.诱导分化后上述抗体表达阴性.结论 贴壁培养法可有效获取CD133+细胞.ALDH1仅在分化前的细胞中表达,有可能成为今后研究胶质瘤干细胞的新标志物.
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多次贴壁法高效制备人脐带间充质干细胞
目的 建立一套简单、高效、稳定、规范的人脐带间充质干细胞体外制备与鉴定技术,为人脐带间充质干细胞库建设及临床应用提供技术规范.方法 改进前期技术方法,重复验证,建立规范化技术方法.无菌采集足月剖宫产分娩胎儿脐带,采用不剥离血管和包膜组织贴壁法培养脐带间充质干细胞.待原代细胞长出时,收集原本换液应丢弃的组织块,进行二次贴壁培养,如此反复,待二次贴壁组织块长出细胞时,收集组织块进行三次贴壁培养.对三次贴壁培养长出的第三代细胞进行生物学特性分析.结果 首次组织贴壁后10～12 d可见成纤维样细胞从组织块爬出,二次、三次贴壁后第2d就可见成纤维细胞样细胞爬出,且生长状况好,细胞形态更为均一.三次贴壁培养的第三代细胞都高表达CD29、CD44、CD90和CD105,不表达CD34和CD45.细胞生长曲线呈“S”型,均具有成脂、成骨、成软骨分化的能力.结论 采用多次贴壁法制备的人脐带间充质干细胞充分利用了脐带组织块,且得到的原代细胞数量翻倍,其生物学特性稳定.
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无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞
目的 用体外无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞.方法 取1例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带,采用组织块贴壁培养,使用无血清培养体系培养获得人脐带间充质干细胞.通过形态学观察,成脂、成骨、成软骨诱导分化能力检测及流式细胞术免疫表型检测进行鉴定.结果 组织块贴壁培养6天后可见细胞从组织块边沿爬出;培养15天后,达到80％汇合,生长状况良好,细胞呈梭形,为典型的成纤维细胞形态,极性整齐排列,集落呈涡旋状,形态较均一.传代培养的第三代细胞CD29、CD44、CD90、CD105均为阳性表达,不表达CD34和CD45,均具有成脂、成骨、成软骨分化的能力.结论 无血清培养体系组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞法成功率高,其生物学特性稳定,并能消除由未确定的病原体引起的风险.
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人脾脏巨噬细胞的分离与纯化
目的探索分离纯化大量人脾脏巨噬细胞(MΦ)的方法.方法选取10例手术切除的脾脏,机械研磨法获得脾脏组织细胞混悬液.采用贴壁培养的方法进行MΦ的分离与纯化,相差显微镜下动态观察,明确贴壁培养的合适时间,详细记录MΦ分离纯化过程各步骤所需时间.收获的MΦ,台盼蓝染色判定活力并计数,统计出平均每克脾脏组织收获的MΦ数及其纯度.相差显微镜、透射电镜观察分离纯化MΦ的形态特征.结果分析贴壁培养各时间段的细胞纯度及活力,确定MΦ培养的合适时间为2～3h.贴壁培养纯化后,平均从每克脾脏组织可收获(0.25±0.03)×108个MΦ,纯度为(90±5)%,细胞活力≥99%,细胞结构及各种细胞器结构均完整.结论贴壁培养方法分离纯化人脾脏MΦ是成功可行的,收获的MΦ数量大、纯度高、活力好,为脾脏MΦ功能的深入研究奠定了基础.
