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糖肾汤对氧化低密度脂蛋白诱导的系膜细胞血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1表达及细胞外基质分泌的影响
目的:观察糖肾汤对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的系膜细胞血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1(LOX-1)表达及转化生长因子-β1(TGF-β1)和细胞外基质分泌的影响,探讨其防治糖尿病肾病的机制.方法:培养大鼠系膜细胞,分为空白组、ox-LDL组、糖肾汤高、中、低剂量组和罗格列酮组,培养24h后,RT-PCR检测系膜细胞mRNA表达,ELISA技术检测细胞上清液中TGF-β1、四型胶原(ColⅣ)和纤黏连蛋白(FN)含量.结果:糖肾汤、罗格列酮含药血清均能抑制ox-LDI诱导的TGF-β1、LOX-1 mRNA表达上调,及TGF-β1、FN、ColⅣ的分泌,其中糖肾汤含药血清呈剂量依赖性作用,中浓度作用强.结论:糖肾汤可能通过降低ox-LDL受体LOX-1的表达以减少ox-LDL摄入及由此引起的细胞因子分泌和细胞外基质产生,从而起到防治糖尿病肾病的作用.
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介绍一种高压离体细胞培养装置
高血压病主要的临床特点是全身动脉血压升高,并伴有脉压差的变化.在高血压的病理状态下动脉内皮细胞、血管平滑肌细胞、肾小球毛细血管内皮细胞及肾系膜细胞所承受的机械力都发生了变化,从而使这些细胞的形态、功能都发生变化进而使靶器官(心、脑、肾)功能改变.为了研究机械力学对细胞功能的影响,我们在原有的工作基础上设计了一套高压培养细胞装置,模拟细胞在高血压病理状态下所承受的机械力学的变化.
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真核表达质粒pCMV-脂联素的构建及其转染对高糖环境下肾系膜细胞增殖影响的研究
目的 构建pCMV-脂联素(APN)真核表达质粒,观察转染小鼠肾系膜细胞后APN的表达以及对高糖环境下肾系膜细胞增殖的影响. 方法 通过RT-PCR扩增小鼠肾系膜细胞中APN基因片段,经酶切、纯化后与pcDNA3.1质粒连接构建pCMV-APN重组质粒.pCMV-APN重组质粒经酶切鉴定及DNA测序验证后,由脂质体转染将pCMV-APN真核表达质粒转导入肾系膜细胞中,Western blot检测转染后细胞中APN蛋白表达,MTT检测转染后细胞在高糖环境下增殖活性的变化. 结果 真核表达质粒pCMV-APN经酶切、测序鉴定后提示构建成功.转染后肾系膜细胞APN蛋白表达明显增高,且在高糖环境下的增殖活性较空载体转染组明显下降[(0.87±0.06) vs (0.60±0.01),P<0.05]. 结论 成功构建pCMV-APN真核表达质粒,能稳定表达于小鼠肾系膜细胞及抑制高糖的诱导增殖作用,为进一步研究APN的生物学功能奠定理论基础.
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高糖和泛素蛋白酶体抑制剂MG132对大鼠肾系膜细胞IκB-α蛋白表达的影响
目的 探讨泛素蛋白酶体途径对高糖刺激的肾系膜细胞IκB-α蛋白表达的影响.方法 体外培养大鼠HBZY-1肾系膜细胞,高糖作为刺激因子,MG132作为干预因素.分别设正常对照组、高糖组(10,20,30mmol/L葡萄糖)、甘露醇组以及MG132加高糖(30mmol/L)组,分别作用12、24、48小时,用Western blot法测各组IκB-α蛋白的表达.结果 (1)与正常对照组比较,高糖作用后IκB-α蛋白的表达呈时间、浓度依赖性下降.(2)与高糖组比较,高糖加入MG132后,IκB-α蛋白的表达下降被明显逆转.结论 高糖可通过泛素蛋白酶体途径促进肾系膜细胞IκB-α蛋白泛素化降解.
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血管紧张素Ⅱ及氯沙坦对肾系膜细胞蛋白激酶C亚型表达及转位的影响
血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS) 中重要的生物活性肽,可经Ang Ⅱ受体激活细胞内信号传递的关键酶--蛋白激酶C (PKC) 介导各种细胞效应,在肾脏疾病的发生发展中起重要作用[1]. 目前已知PKC 共有12种亚型,不同PKC亚型在Ang Ⅱ信号传递中的作用尚不十分清楚.为此,我们将肾系膜细胞进行体外培养,采用多光子共聚焦显微镜观察Ang Ⅱ、Ang Ⅱ受体1(AT1)拮抗剂--氯沙坦对三种PKC亚型α、β、ε表达和转位的影响,探讨这三种PKC亚型在肾脏疾病中的作用.
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脂联素调控微小RNA221/金属蛋白酶组织抑制因子3信号对高糖环境下小鼠肾系膜细胞增殖的抑制作用
目的 探讨脂联素通过微小RNA221(miR-221)靶向调控金属蛋白酶组织抑制因子3(Timp3)基因对高糖诱导的小鼠肾系膜细胞增殖的影响及作用机制.方法 在体外高糖条件下培养小鼠肾系膜细胞,分别加入脂联素以及转染miR-221抑制物、miR-221模拟物、小干扰RNA-Timp3(Si-Timp3)等干预因素.根据实验目的及干预因素不同将细胞分组为:正常对照组、高糖组、高糖+脂联素组、高糖+miR-221抑制物转染组及转染对照组、Si-Timp3转染组及转染对照组、miR-221模拟物转染组及转染对照组、高糖+脂联素+miR-221模拟物转染组及转染对照组.噻唑蓝法检测细胞的增殖活性,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)分析miR-221、Timp3的表达水平,Western blotting法检测Timp3的蛋白表达,荧光素酶报告基因实验检测Timp3的3'-UTR活性.两组间比较采用t检验.结果 高糖组促进小鼠肾系膜细胞增殖明显,上调miR-221和抑制Timp3的表达(分别为3.20±0.28比1、0.67±0.07比1,t=13.69、8.35,均P<0.05),而脂联素加入后该作用减弱(t=7.60、4.12,均P<0.05).与高糖+miR-221抑制物对照组比较,转染miR-221抑制物后,Timp3的mRNA表达水平上调(0.78±0.03比0.38±0.04,t=14.57,P<0.05),细胞增殖减弱.与Si-Timp3对照组比较,转染Si-Timp3后,细胞增殖活性增强(1.72±0.06比1.04±0.12,t=8.76,P<0.05).与高糖+脂联素+miR-221 minic转染对照组比较,加入脂联素及转染miR-221模拟物后,Timp3的mRNA表达水平下降(0.72±0.09比1.40±0.06,t=10.93,P<0.05),细胞增殖加强.结论 高糖是诱导小鼠肾系膜细胞增殖、上调miR-221水平、抑制Timp3基因表达的重要因素,脂联素可逆转该作用,其机制可能是通过miR-221/Timp3途径,靶向负调控Timp3基因的表达来实现的.
关键词： 脂联素 微小RNA221 金属蛋白酶组织抑制因子3 高糖 肾系膜细胞 -
血管紧张素Ⅱ对肾系膜细胞丝裂原活化蛋白激酶的作用
血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是一类重要的血管活性物质,在体外研究中发现,它可引起肾小球系膜细胞(MC)收缩并调节肾小球血流量,还可调节MC的生长并刺激细胞外基质的分泌,提示它在肾小球疾病的炎症及硬化过程中具有一定的致病作用.研究表明,AngⅡ对MC的作用是由AT1受体介导的,其细胞内信号传导可能涉及细胞内钙的激活和蛋白激酶C(PKC)的活化[1].然而,AngⅡ调节MC生长的细胞内机制至今仍无定论.
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糖肾安对高糖环境下大鼠肾脏及肾系膜细胞炎性因子 ICAM -1表达的影响
目的：探讨糖肾安对高糖环境下大鼠肾脏及肾系膜细胞炎性因子细胞间黏附因子-1（ICAM -1）表达的影响。方法①实验一：50只健康 SD 大鼠随机分成正常组和造模组，造模组高糖高脂喂养4周后，一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）诱导2型糖尿病模型，成模大鼠随机分为模型组、糖肾安高剂量组、糖肾安中剂量组、糖肾安低剂量组和西药组，各给药组给予相应药物8周后收集肾脏标本。②实验二：大鼠肾系膜细胞株解冻复苏后制成细胞悬液，将其按照实验一分组方法进行分组，各药物干预组在相应含药血清中培养24 h 后收集细胞。2组实验采用 Western blot、RT - PCR 方法检测 ICAM -1表达情况。结果①实验一：模型组、糖肾安中剂量组、糖肾安低剂量组及西药组 ICAM -1表达量均明显高于正常组（P 均﹤0.05），糖肾安各组及西药组 ICAM -1表达量均明显低于模型组（ P 均﹤0.05），糖肾安高剂量组 ICAM -1表达量明显低于糖肾安中剂量组、糖肾安低剂量组及西药组（ P 均﹤0.05）。②实验二：各药物干预组ICAM -1表达量均明显高于正常组（P 均﹤0.05），但明显低于模型组（ P 均﹤0.05）；糖肾安高剂量组 ICAM -1表达量明显低于糖肾安中剂量组、糖肾安低剂量组（P 均﹤0.05）。结论糖肾安可抑制大鼠肾脏及肾系膜细胞炎性因子ICAM -1的表达，减轻肾脏组织病理学改变，其肾脏保护作用可能与抑制 ICAM -1表达水平有关。
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尿毒净Ⅱ号对人肾系膜细胞Cyclin D1及CDK4表达的影响
目的:探讨尿毒净Ⅱ号对人肾小球系膜细胞Cyclin D1、CDK4的影响.方法:应用流式细胞术、免疫组化、Western blot方法,在培养的人胚胎肾小球系膜细胞,分别检测尿毒净Ⅱ号对系膜细胞Cyclin D1、CDK4以及DNA倍体的影响.结果:尿毒净Ⅱ号明显抑制血清加内皮素-1(ET-1)刺激的系膜细胞Cyclin D1、CDK4表达,增加G0/G1期细胞,降低S+G2/M期细胞(与对照组比较P<0.01),呈一定的量效依赖关系.结论:尿毒净Ⅱ号通过抑制细胞Cyclin D1、CDK4,阻止系膜细胞由G1期进入S期,延缓了细胞周期进程,从而抑制系膜细胞增殖.
关键词： 尿毒净Ⅱ号 肾系膜细胞 细胞周期素 细胞周期蛋白依赖激酶 -
胰岛素对大鼠肾系膜细胞增殖及损伤和PAI-1合成的影响
目的:观察不同浓度胰岛素对体外培养的大鼠肾系膜细胞(GMC)损伤、增殖和纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)的影响.方法:用不同浓度胰岛素刺激GMC,用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT) 测定细胞增殖程度,采用全自动生化分析仪测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)水平显示细胞损伤, 并以无胰岛素刺激组为对照;采用RT-PCR检测PAI-1 mRNA表达.结果:GMC在胰岛素刺激后,细胞增殖和LDH水平在一定浓度范围内呈剂量和时间依赖性增加,高水平胰岛素可从基因水平上调系膜细胞PAI-1的表达.结论:高胰岛素水平能促进GMC 增殖,造成细胞损伤,同时上调PAI-1 mRNA表达,提示高胰岛素可能通过抑制细胞外基质降解,参与肾小球纤维化的过程.
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复方积雪草对肾小球系膜细胞及细胞外基质的影响
目的:探讨复方积雪草在体外及体内对大鼠肾小球系膜细胞及细胞外基质增生的影响.方法:体外实验在培养的大鼠肾小球系膜细胞中进行:应用氮蓝四唑盐(MTT)比色法、流式细胞术对DNA倍体进行分析,分别检测复方积雪草对系膜细胞增殖的影响.体内实验在单侧肾切除术合并阿霉素静脉双次注射的大鼠肾小球硬化模型中进行,用定量病理分析观察复方积雪草对系膜细胞增殖及系膜基质增殖的影响.结果:体外实验提示,复方积雪草明显抑制血清加血管紧张素Ⅱ刺激的系膜细胞增殖(与对照组比较P＜0.01),G0/G1期细胞比例增加,S+G2/M期细胞比例逐渐下降,且呈量效和时效依赖关系.体内实验中,造模大鼠经复方积雪草治疗后第8周,系膜细胞增殖、细胞外基质沉积均明显减少(与对照组比较P＜0.01).结论:复方积雪草可以抑制系膜细胞增生,阻止系膜细胞由G1期进入S期,减少细胞外基质沉积.
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褪黑素对高糖诱导的大鼠系膜细胞凋亡及Caspase-3的影响
目的:探讨褪黑素(melatonin,MT)对于高糖条件下培养的大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell,MC)凋亡及Caspase-3的影响.方法:光镜观察大鼠MC凋亡的形态学变化;免疫细胞化学检测Caspase-3的表达改变.结果:褪黑素对于30 mmol/L浓度的葡萄糖诱导的MC高凋亡率有明显的抑制作用(P《0.05);并能明显抑制Caspase-3的表达.结论:褪黑素可以通过抑制Caspase-3表达来降低高糖诱导的大鼠MC高凋亡率.
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2型糖尿病与炎症及PPARγ激动剂
PPARγ是过氧化物酶体增殖物激活受体(peoxisome proliferator activated receptors,PPARs),是配体激活的转录因子,属于核激素受体超家族成员.PPARγ可在多种免疫活性细胞,内皮细胞,血管平滑肌细胞和肾系膜细胞等中表达,其高表达发挥重要的调节糖脂代谢、血压、抗炎、抗增生,减轻蛋白尿及防止肾维化等作用.人工合成PPARγ配体的发现增加了我们对它依赖配体激活及其生理效应的理解,尤其是PPARγ在糖尿病肾脏中的作用.TZDs,PPARγ激动剂不仅可以增加2型糖尿病患者胰岛素的敏感性而且还发挥了广谱的肾脏保护作用.本综述旨在总结PPARγ作为TZDs靶分子的重要作用以及它和糖尿病肾脏的关系.
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非糖尿病性高血糖的临床处理与评价
众所周知,高血糖状态对机体的主要影响是产生急性氧化应激作用;使胰岛素合成减少,胰岛素出胞障碍;高渗糖液使血容量增加,心脏负荷加重;糖的渗透性利尿可直接损害肾小管上皮细胞;糖进入肝脏,脂肪与氨基酸代谢障碍,体内的成糖成酯过多,使肝的解毒作用下降;致细胞免疫功能下降;高血糖还可通过自由基损害血管壁、肾系膜细胞、视网膜细胞和神经纤维及胰岛B细胞等[1].
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雷帕霉素对高糖诱导的大鼠肾系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响
目的：：评价雷帕霉素对高糖诱导的肾系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响,探讨其在糖尿病肾病防治中的意义。方法：体外培养的大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1分为：正常对照组、高糖组、高糖加不同浓度的雷帕霉素组,应用CCK-8法观察细胞增殖的变化；流式细胞术检测各组细胞的细胞周期和凋亡情况；Real-time PCR法检测各组细胞中血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ)、转化生长因子β1(TGF-β1)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达水平。结果：高糖诱导下HBZY-1的增殖水平明显上升,凋亡水平下降,ANGⅡ,TGF-β1和VEGF的表达水平上升,而雷帕霉素具有明显抑制作用,且有剂量依赖性,并下调ANGⅡ,TGF-β1和VEGF的表达；对于细胞周期,高糖组的S期细胞明显高于正常组(P<0.05)；雷帕霉素干预后,S期细胞比例减少(P<0.05)。结论：雷帕霉素能够抑制高糖状态下HBZY-1的增殖,促进其凋亡及导致G1/S期阻滞,同时下调ANGⅡ, TGF-β1和VEGF的表达。
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三七总皂苷在抗肾纤维化细胞模型中剂量的研究
目的 研究三七总皂苷(PNS)在抗肾纤维化细胞模型中剂量选择.方法 原代培养大鼠肾小球系膜细胞(MC)作为细胞模型,用含有或者不含有胎牛血清的各浓度(0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.6,3.2 mg/mL)三七总皂苷细胞培养刺激大鼠MC,MTT比色法观察其对细胞的增殖及毒性作用.结果 PNS浓度在0.1～0.6 mg/mL抑制大鼠MC细胞增殖(P<0.05),但对大鼠MC不具有细胞毒性作用(P>0.05),而PNS浓度≥0.8 mg/mL时具有细胞毒性作用(P<0.05),<0.1 mg/mL时对MC没有抑制增殖的作用.PNS浓度在0.1～3.2 mg/mL与大鼠MC增殖呈负相关(r=-0.838,P<0.01).结论 浓度0.1～0.6 mg/mL是PNS在抗肾纤维化细胞模型中理想剂量范围;在该范围内PNS抑制MC增殖的作用不是通过细胞毒性实现的.
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山茱萸环烯醚萜总苷对晚期糖基化终末产物诱导的肾系膜炎症反应的调节
目的 探讨山茱萸环烯醚萜总苷对晚期糖基化终末产物(AGEs)诱导的大鼠肾系膜HBZY-1细胞炎症反应的影响以及可能的作用机制.方法 采用巨噬细胞和肾系膜细胞共培养体系,评估巨噬细胞的迁移能力；采用ELISA试剂盒评估炎症因子的分泌水平；采用Western blot分析法评估炎症相关蛋白的表达.结果 与AGEs诱导的模型组相比,山茱萸环烯醚萜总苷显著抑制AGEs诱导的巨噬细胞迁移能力,不同剂量山茱萸环烯醚萜总苷(1.0、0.5、0.25mg/mL),对巨噬细胞迁移抑制率分别为42.09％±7.25％、26.44％±10.23％、20.84％±6.84％；山茱萸环烯醚萜总苷显著抑制AGEs诱导的炎症因子IL-6,IL-10,MCP-1和TNF-α的分泌水平；Western blot分析显示山茱萸环烯醚萜总苷及AGEs受体特异性抗体显著下调AGEs诱导的ICAM-1和TGF-β1的蛋白表达.结论 山茱萸环烯醚萜总苷可剂量依赖性地减轻AGEs诱导的大鼠肾系膜细胞HBZY-1炎症反应,对糖尿病肾病的发生发展具有一定的保护作用.
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转染Smad 2基因的大鼠肾系膜细胞纤连蛋白和Ⅳ型胶原表达的改变(摘要)
目的通过对大鼠肾小球系膜细胞(MsC)转染Smad 2基因,观察转染的阳性细胞克隆纤连蛋白(FN)及Ⅳ型胶原(ColⅣ)表达的改变,以探讨转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号转导通路引起细胞外基质积聚导致肾小球硬化发生的分子机制.方法经磷酸钙介导将含有Smad 2重组表达质粒转染大鼠MsC,用G418筛选及Western印迹分析法鉴定,又分别采用Western印迹分析法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染阳性细胞克隆FN及ColⅣ表达的改变.结果成功建立高表达Smad 2蛋白的阳性MsC克隆(T-12、T-31、T-35、T-40),并证实其FN及ColⅣ的mRNA和蛋白的表达水平均明显上调.阳性MsC克隆FN蛋白为对照组2.4倍(P＜0.05),mRNA为对照组的2.7倍(P＜0.05);阳性MsC克隆ColⅣ蛋白为对照组的2.9倍(P＜0.01),mRNA为对照组的3.3倍(P＜0.01).结论TGF-β/Smad信号转异途径中Smad 2可能是促进FN及ColⅣ在肾小球中积聚,是导致肾小球硬化发生的重要信号转导分子.
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依贝沙坦对糖基化终产物诱导的肾系膜细胞增殖的影响
目的观察依贝沙坦对糖基化终产物(AGEs)干预的人肾小球系膜细胞(HRMC)增殖的影响.方法用4-甲基偶氮四唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法观察AGEs对HRMC的增殖作用,以及不同作用时间和不同浓度依贝沙坦对这种增殖作用的影响,并通过流式细胞仪检测细胞周期变化.结果依贝沙坦在一定范围内以时间依赖和剂量依赖关系抑制糖基化终产物诱导的肾小球系膜细胞过度增生,并使G0～G1期细胞比例增高,S期细胞数减少.结论依贝沙坦能够抑制AGEs诱导的HRMC增生,这种作用可能是通过抑制细胞分裂、复制实现的.
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缓激肽促进大鼠肾系膜细胞增殖和纤维连接蛋白表达
目的:观察缓激肽(BK)对大鼠肾系膜细胞增殖和纤维连接蛋白表达的影响.方法:采用体外培养的大鼠肾系膜细胞,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖情况;应用Western b1otting观察肾系膜细胞纤维连接蛋白的表达.结果:缓激肽促进肾系膜细胞增殖,且具有剂量依赖性.缓激肽和转化生长因子-β1皆显著增加系膜细胞纤维连接蛋白表达,并具有协同效应.结论:缓激肽可能直接促进体外培养的系膜细胞增殖和纤维连接蛋白表达,从而加重对肾小球的损伤.
