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耐药肺炎克雷伯菌中发现碳青霉烯酶KPC基因新的变异型
肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kpn)是医院感染的重要致病菌.我们从医院分离到一组(15株)耐药肺炎克雷伯菌(均分离自2010年3月-2010年5月浙江大学附属第一医院住院患者临床样本).来源为:痰液6份,中段尿3份,血液和引流液各2份,脑脊髓液和咽拭子各1份.进行了A类、B类、C类、D类等4类41种B-内酰胺酶基因(阳性株全部作DNA测序并比对)与β-内酰胺酶活性检测,结果发现了肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase,KPC)基因新的变异型,现报告如下.
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KPC-2及 IMP-4酶介导肠杆菌科细菌碳青霉烯类耐药研究
目的：探讨我院肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及其流行特点。方法收集杭州市富阳区第一人民医院2013年1月至2014年8月分离的对碳青霉烯类抗生素（厄他培南）敏感性下降的肠杆菌科细菌，采用K-B纸片法及E-test法进行药敏试验，改良Hodge试验、EDTA抑制试验及超广谱β-内酰胺酶（ ESBLs）表型筛选试验进行耐药表型筛选；采用PCR法及测序技术检测耐药基因、KPC基因周围序列和肺炎克雷伯菌7个管家基因，多位点序列分型进行7个管家基因的序列分析；运用PFGE对鉴定为同一菌种的细菌进行同源性分析；采用S1-PFGE联合Southern杂交对已明确的碳青霉烯耐药基因进行基因定位。结果共收集到19株厄他培南敏感性下降的肠杆菌科细菌，所有菌株呈多重耐药现象，且同一菌株常携带有多种耐药基因，其中 blaKPC-2、blaIMP-4、blaSHV-1、blaCTX-M-65、blaCTX-M-15、blaTEM-1、rmtB为常见共同携带的耐药基因。 PFGE结果提示14株肺炎克雷伯菌呈多克隆分布，MLST分型以ST11型为主。11株肺炎克雷伯菌和1株大肠埃希菌产KPC-2酶， blaKPC-2基因分别定位于4种大小不同的质粒上（大小分别约为95 kb、140 kb、200 kb及240 kb），所有菌株blaKPC-2周围基因结构从上游至下游均为ISKpn8、blaKPC-2和ISKpn6-like元件；1株产酸克雷伯菌和1株肺炎克雷伯菌产 IMP-4型碳青霉烯酶， blaIMP-4基因定位于大小约为300 kb 的质粒上。结论KPC-2型及IMP-4型碳青霉烯酶是造成我院肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因；我院碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（ CRKP）菌株呈多克隆散在播散的流行特点，未发现优势克隆。
关键词： 碳青霉烯酶 碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌 KPC-2酶 IMP-4酶 -
MALDI-TOF MS检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的应用
目的 评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)快速检测临床产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的应用价值.方法 选取2016年2月至2017年2月我院分离自临床标本中的产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌(CPE)和同期分离的不产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌(NCPE)作为研究对象,建立MALDI-TOF MS检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的适反应体系.结果 成功建立MALDI-TOF MS检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的适反应体系:1 mg/ml亚胺培南溶液与2麦氏浊度的菌悬液等体积混合,37℃孵育20 min后离心,MALDI-TOF MS检测上清.亚胺培南所对应的质谱峰(300±0.55) m/z完全消失,即表明该菌株产碳青霉烯酶.检测结果与基因检测结果比较,敏感度和特异度均为100%.结论 MALDI-TOF MS可以准确、快速地检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌,该方法或可作为常规项目开展,指导临床早期抗感染治疗和医院早期感染控制.
关键词： 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 碳青霉烯酶 肠杆菌科细菌 耐药 -
1株分离自骨髓炎患者的泛耐药肺炎克雷伯菌的特性研究
肺炎克雷伯菌（ Klebsiella pneumoni-ae， KPn）广泛存在于自然界中，是院内感染的重要病原菌，可引起肺炎、尿路感染、败血症等。骨髓炎是一种复杂的临床感染性疾病，葡萄菌属是其常见的病原菌，肺炎克雷伯菌引起骨髓炎的相关资料较少，仅在免疫力低下、新生儿中有几例报道。本实验室自平素体健成年男性骨髓炎患者的骨髓标本中分离出一株肺炎克雷伯菌FKA78，其表现出泛耐药特性，即除了对替加环素敏感外，对临床各类抗菌药物都表现出高水平耐药，而目前国内外关于肺炎克雷伯耐药菌的研究大多数局限于对氨基糖苷类药物敏感的产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）型菌株。
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碳青霉烯类药物耐药的弗劳地枸橼酸杆菌耐药机制研究
目的 对耐碳青霉烯类弗劳地枸橼酸杆菌进行同源性分析及多种耐药基因的检测.方法 用琼脂稀释法测定其低抑菌浓度( MIC)值,采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析耐碳青霉烯类弗劳地枸橼酸杆菌的同源性,以聚合酶链反应(PCR)检测β-内酰胺酶、膜孔蛋白的缺失等多种耐药基因.结果 PFGE显示1、2、4、5号菌株均有19个条带,具有同源性；PCR试验检测结果1、4号菌携带blaCTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)；2、3、5号菌携带携带blaDHA,3号携带bla ACT/MIR型AmpC 基因,1、2、4、5号菌携带bla KPC-2碳青霉烯酶基因；2号、4号菌株缺失膜孔蛋白基因ompF,3号菌株同时缺失ompC和ompF；其中3号菌株的16S rRNA基因定量确定AmpC基因的表达为阴性菌的106.7倍.结论 宁波市第一医院碳青霉烯类耐药的弗劳地枸橼酸盐杆菌具有同源性,其耐药机制由KPC酶、AmpC酶、ESBLs、膜孔蛋白缺失等共同作用所形成,多数耐药基因定位在质粒上易引起耐药性的播散,临床应引起高度重视.
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对亚胺培南耐药粘质沙雷菌中质粒介导KPC-2型碳青霉烯酶的研究分析
目的 研究粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的分子机制.方法 临床分离到1株亚胺培南耐药的粘质沙雷菌[小抑菌浓度(MIC)为64μg/ml].将粘质沙雷菌和大肠杆菌进行接合试验,采用琼脂稀释法检测粘质沙雷菌和接合前后大肠杆菌对药物的MIC;提取粘质沙雷菌和接合后大肠杆菌的酶粗提液进行等电聚焦电泳和三维试验;特异性PCR扩增和DNA序列分析确认引起粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的β-内酰胺酶的基因型.结果 除碳青霉烯类抗生素外,粘质沙雷菌还对青霉素类、头孢菌素类和单酰胺类等抗生素耐药,对喹诺酮类和氨基糖甙类抗生素敏感;接合试验可使大肠杆菌获得与粘质沙雷菌相似的耐药谱;等电聚焦电泳显示粘质沙雷菌中存在等电点(PI)分别为6.5和6.7的两种β-内酰胺酶,接合后的大肠杆菌存在PI为6.7的β-内酰胺酶;特异性PCR扩增和DNA序列分析证实PI为6.7的β-内酰胺酶为碳青霉烯酶KPC-2,其核苷酸及氨基酸序列已递交到GenBank,PI为6.5的酶有待进一步研究;在三维试验中,克拉维酸、乙二胺四乙酸(EDTA)和氯唑西林均不能抑制KPC-2酶对亚胺培南的水解活性.结论 首次在粘质沙雷菌中发现碳青霉烯酶KPC-2,该酶是引起粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的主要原因.
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同时产ArmA型16S rRNA甲基化酶及KPC-2型β-内酰胺酶泛耐药阴沟肠杆菌的研究
目的 探讨上海交通大学医学院附属瑞金医院分离的5株泛耐药阴沟肠杆菌产碳青霉烯酶及16S rRNA甲基化酶的情况及两者之间的相关性.方法 用E test法检测5株泛耐药阴沟肠杆菌对10种抗菌药物的MIC值.PCR扩增16S rRNA甲基化酶基因armA、mtA、rmtB、rmtC、rmtD、npmA,β-内酰胺酶基因TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9、CTX-M-25、PER-1、VEB-1.鸟枪克隆法克隆碳青霉烯酶基因,并对克隆片段进行测序.质粒接合试验验证碳青霉烯酶基因及16S rRNA甲基化酶基因是否具有转移性.脉冲场凝胶电泳(PFGE)法对5株菌进行分子分型.等电聚焦电泳法检测β-内酰胺酶等电点.Southern杂交法对耐药决定因子进行定位.结果 5株阴沟肠杆菌对10种抗菌药物的MIC值均＞32 mg/L.克隆的碳青霉稀酶基因为blaKPC-2,酶编码基因上游为一转座酶基因,两侧为复制靶位,下游为ISKpn6的插入序列,该序列包括一个重复序列和tnpA转座子,酶编码基因位于54.2 kb的一个非接合性大质粒上.等电聚焦电泳显示5株菌均产4种β-内酰胺酶(TEM-1,pI5.4；KPC-2,pI6.7；SHV-12,pI8.2；CTX-M-14,pI8.4).16S rRNA甲基化酶基因位于接合性质粒上,而blaKPC-2基因则位于非接合性质粒上,5株菌PFGE型别一致.结论 5株泛耐药阴沟肠杆菌对碳青霉烯类耐药由产碳青霉烯酶KPC-2所介导.blaKPC-2与armA型16S rRNA甲基化酶基因由两条不同的质粒编码,不存在相关性.临床医院应加强监控,以防止交叉感染.
关键词： 阴沟肠杆菌 碳青霉烯酶 16S rRNA甲基化酶 -
产气肠杆菌中发现碳青霉烯酶KPC-2型
肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae Carbapenemase,KPC),属A类β-内酰胺酶.2010年3月25日我们从一家三等甲等医院老年患者的痰液中分离到1株碳青霉烯类耐药的产气肠杆菌(标本编号:20100323BAA049,经gyrA和parC基因扩增与测序,GenBank比对确认).为了解该菌株的β-内酰胺类耐药机制,我们采用E-test法检测了该菌对26种抗菌药物敏感性,并进行了A类、B类、C类、D类等4类41种β-内酰胺酶基因检测,用改良的三维试验法检测AmpC酶、ESBLs和金属β-内酰胺酶活性,用改良Hodge试验法检测碳青霉烯酶活性.
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2株产KPC-2型碳青霉烯酶肠聚集性大肠埃希菌的分离
肠聚集性大肠埃希菌（ EAEC）可引起成人和儿童的持续性水样腹泻。多重耐药的EAEC菌株在多个国家和地区均有报道，国内尚未见相关报道。本研究首次报道重症监护病房中分离到2株对碳青霉烯类抗生素耐药的EAEC菌株。
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碳青霉烯类抗菌药物耐药的大肠埃希菌KPC酶检测与分析
大肠埃希菌是医院内感染和社区获得性感染的重要病原菌,其耐药性十分严重.我们在我院分离的一株碳青霉烯类抗菌药物耐药的大肠埃希菌E902774的耐药机制研究中存在A类碳青霉烯酶KPC(肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶)-2酶.
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一种新的质粒介导的IMI-1型碳青霉烯酶
目的确立亚胺培南耐药阴沟肠杆菌对亚胺培南的耐药机制. 方法采用E test测定抗菌药物低抑菌浓度(MIC),通过等电点聚焦电泳(IEF)、三维试验、接合试验、Southern杂交、聚合酶链反应(PCR)、克隆测序对酶的活性及编码基因进行研究. 结果阴沟肠杆菌产碳青霉烯酶,等电点为8.1.该酶能被克拉维酸抑制,不被氯唑西林、EDTA抑制,存在2f类酶的某些特性,其耐药基因位于80kb左右的质粒上.克隆测序显示与染色体介导的IMI-1有99%的同源性. 结论阴沟肠杆菌对亚胺培南耐药是由一种新的质粒介导的与染色体介导的IMI-1类似的碳青霉烯酶所致.
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尿道分离产blaKPC-9型碳青霉烯酶大肠埃希菌的耐药基因研究
大肠埃希菌是医院感染的重要病原菌，该菌可产生多种β-内酰胺酶，包括KPC-2、KPC-3及 KPC-9型碳青霉烯酶类，此酶可在质粒间传播。目前产blaKPC-9型大肠埃希菌株国内尚未见文献报道。我们在1株大肠埃希菌中检测到KPC-9型碳青霉烯酶，现报道如下。
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无迁徙生长碳青霉烯耐药奇异变形杆菌耐药机制及分子分型研究
目的：探讨无迁徙生长碳青霉烯耐药奇异变形杆菌耐药机制及分子流行病学特点。方法收集2013年1月至2014年12月武警浙江总队杭州医院临床分离的无迁徙奇异变形杆菌,通过半固体培养及鞭毛染色试验观察菌株动力及鞭毛；采用脉冲场凝胶电泳( PFGE)分析菌株之间同源性；利用表型确证试验以及PCR扩增测序明确耐药基因型；运用S1-PFGE联合Southern印迹杂交及质粒电转化试验对碳青霉烯耐药基因进行定位,并分析耐药基因周围环境。结果共收集无迁徙生长奇异变形杆菌42株,对亚胺培南与美罗培南耐药率分别为57.1%和52.4%；其中碳青霉烯耐药的无迁徙生长奇异变形杆菌24株,PFGE结果提示分为3个克隆型且均携带blaKPC-2基因,菌株动力及鞭毛染色均为阴性；Southern印迹杂交表明blaKPC-2基因分别定位在约为26、55、139 kb不同大小质粒上；部分菌株在携带blaKPC-2基因的质粒上同时携带blaTEM-1、blaCTX-M-65、rmtB等多种耐药基因；携带blaKPC-2基因菌株周围结构显示,其上游含有插入元件ISKpn8,下游则由插入元件ISKpn6-like构成。结论无迁徙生长奇异变形杆菌具有较高碳青霉烯类抗生素的耐药率,产KPC-2型碳青霉烯酶是导致无迁徙奇异变形杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。碳青霉烯耐药无迁徙生长奇异变形杆菌在我院呈克隆播散趋势,应引起临床高度重视。
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改良Hodge试验检测肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶的研究
目的 用改良Hodge试验(MHT)检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的产生,了解碳青霉烯酶基因分布.方法 从浙江大学医学院附属第二医院、浙江省东阳市人民医院、北京医院和四川大学附属华西医院4家医院收集3 718株肠杆菌科细菌,用纸片法检测细菌对厄他培南的敏感性,用MHT检测碳青霉烯酶的产生情况,并用PCR扩增常见的碳青霉烯酶基因.结果 4家医院的肠杆菌科细菌对厄他培南的不敏感率为3.04％ (113/3718),上述4家医院的不敏感率依次为5.09％、2.15％、2.59％和1.72％.MHT的总阳性率为2.29％ (85/3718),4家医院的阳性率依次为4.73％、1.21％、1.06％和1.58％.113株厄他培南不敏感菌株中,MHT阳性82株,阴性31株.85株MHT阳性菌株中,82株对厄他培南耐药或中介耐药,仅有3株敏感.82株MHT阳性、厄他培南不敏感的菌株中,肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)基因阳性65株,亚胺培南水解酶(IMP)基因阳性15株,其中2株KPC和IMP同时阳性,其他4株未扩增到常见碳青霉烯酶基因.31株MHT阴性、厄他培南不敏感的菌株和3株MHT阳性、厄他培南敏感的菌株均未扩增到常见碳青霉烯酶基因.结论 MHT可有效地检测肠杆菌科细菌中的碳青霉烯酶,具有敏感性高、假阳性率低的特点.肠杆菌科细菌所产碳青霉烯酶主要为KPC,其次为IMP.
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诱导剂联合美罗培南筛查肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药基因研究
目的：探讨美罗培南联合多种抑制剂检测肺炎克雷伯菌产碳青霉烯酶类型的可行性。方法共收集可疑产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌菌株87株。采用美罗培南加多种抑制剂包括3-氨基苯硼酸（APBA），二吡啶羧酸（DPA），乙二胺四乙酸钠（EDTA）和氯唑西林（cloxacillin）等试验来检测菌株产碳青霉烯酶的可能类型；以耐药基因PCR扩增、测序结果作为标准来判断上述试验的敏感性和特异性，并与临床常用的改良Hodge试验结果相比较。结果87株试验菌中，经PCR扩增证实产KPC的菌株40株，待测序确认6株；无VIM、IMP等基因型；改良Hodge试验筛选碳青霉烯酶表型的敏感性为100%，特异性为97.6%；美罗培南和APBA联合检测KPC表型的敏感性为100%，特异性为100%；美罗培南和DPA联合检测MBL表型的敏感性为83.3%，特异性为97.5%；美罗培南和EDTA联合检测MBL表型的敏感性为83.3%，特异性为98.8%。结论改良 Hodge 试验敏感性好，特异性不高，只能作为碳青霉烯酶的初步筛选。美罗培南加抑制剂的试验敏感性和特异性较好，尤其是APBA检测KPC方法，临床上可以考虑该方法作为经济、准确检测碳青霉烯酶的方法推广。
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肺炎克雷伯杆菌101株临床分布与耐药性分析
目的分析医院感染肺炎克雷伯杆菌的临床分布及耐药情况，为减少院内肺炎克雷伯菌感染提供理论依据。方法对2011年3月至2012年2月我院临床分离的101株肺炎克雷伯杆菌标本来源临床科室分布及对17种常用抗菌药物的耐药率进行统计；并对菌株进行超广谱β内酰胺酶检测；运用PCR法检测KPC、IMP、VIM及NDM-1耐药基因并测序。结果101株肺炎克雷伯杆菌标本，来自痰87株，占86.14％；临床科室分布以高干科、神经内科为主各40株，各占39.60％；药敏结果显示我院肺炎克雷伯杆菌对亚胺培南敏感，敏感率为92.08％；其次是头孢替坦和头孢吡肟，敏感率分别为85.15％及80.20％；产超广谱β内酰胺酶的肺炎克雷伯杆菌70株，检出率为69.31％；耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌6株，其中4株检出KPC-2基因，未检出IMP、VIM及NDM-1耐药基因型。结论在我院，产超广谱β内酰胺酶的肺炎克雷伯杆菌检出率较高；肺炎克雷伯杆菌耐碳青霉烯类抗生素可能与携带KPC-2有关，合理使用抗菌药物，以减少耐药菌株的产生。
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泛耐药鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯抗生素机制的研究
目的 探讨医院泛耐药鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶的种类和碳青霉烯酶对美罗培南的水解作用.方法 提取泛耐药鲍曼不动杆菌酶粗提物,采用改良三维试验检测14株泛耐药鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶的产生,PCR方法检测IMP型、VIM型及OXA型碳青霉烯酶基因,高效液相色谱分析泛耐药鲍曼不动杆菌酶粗提物2、4、8 h对美罗培南的水解作用.结果 14株泛耐药鲍曼不动杆菌改良三维试验碳青霉烯酶检测结果均为阳性,IMP型和OXA-23碳青霉烯酶基因扩增阳性.对照组50 μg/ml美罗培南37 ℃条件下,2、4、8 h后浓度分别为(44.56±0.23)μg/ml、(40.41±0.19)μg/ml、(35.78±0.20)μg/ml,酶粗提物作用组50 μg/ml美罗培南37 ℃条件下,2、4、8 h后浓度分别为(28.65±1.14)μg/ml、(16.79±0.46)μg/ml、(2.56±1.21)μg/ml,相同时间段两组美罗培南检测结果差异有统计学意义,P均<0.01.结论 泛耐药鲍曼不动杆菌可同时产生IMP型及OXA型碳青霉烯酶基因,对美罗培南具有较强的水解作用.
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头孢哌酮舒巴坦联合多西环素有效治疗的泛耐药鲍曼不动杆菌特点分析
目的探讨头孢哌酮舒巴坦联合多西环素治疗有效的泛耐药鲍曼不动杆菌肺炎特点。方法对2010年12月至2012年3月经头孢哌酮舒巴坦联合多西环素治疗有效的5例患者及无效的4例患者进行临床分析，比较两组患者的临床特点，并对两组患者分离的泛耐药鲍曼不动杆菌进行基因表型分析。结果两组患者的临床特点均有碳青霉烯类抗生素、激素使用史， APACHEⅡ评分大于16分、行气管插管（套管）、总机械通气时间均大于14 d。两组细菌株均表达OXA-23碳青霉烯酶基因，头孢哌酮舒巴坦联合多西环素治疗成功组IMP金属酶基因未能扩增出；头孢哌酮舒巴坦联合多西环素治疗无效组中2株携带IMP金属酶基因，2株IMP金属酶基因PCR产物扩增阴性且整合子扩增产物约1200 bp。治疗有效组不携带IMP金属酶基因且整合子扩增产物约4000 bp。结论头孢哌酮舒巴坦联合多西环素可有效治疗部分泛耐药鲍曼不动杆菌肺炎，疗效可能与细菌碳青霉烯酶基因型和整合子结构有关。
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河南发现产KPC-2型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌
KPC酶是一种新的碳青霉烯酶，属于A类酶，水解所有的β内酰胺类抗生素，能被克拉维酸抑制[1]。它不仅存在于肠杆菌科的细菌中[2]，也存在于铜绿假单胞菌等非发酵菌中[3]。自2001年Yigit等[1]在美国报道KPC-1之后，法国、希腊、中国等国家[4-8]也发现了KPC酶。我国浙江地区曾报道了KPC酶[7-8]。我们在临床分离到1株亚胺培南中敏的肺炎克雷伯菌，研究发现其产生KPC-2型碳青霉烯酶。
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不动杆菌属菌种主动外排系统的研究进展
不动杆菌属是一种非发酵糖的革兰阴性球杆菌,广泛分布于自然界及健康人的皮肤表面,耐受干燥及普通消毒剂,是院内感染的重要病原菌,主要引起医院获得性肺炎、败血症、尿道感染,以及免疫缺陷患者、术后患者感染.近年来,对碳青霉烯类抗生素耐药的不动杆菌已成为国际社会讨论的热点话题之一,因为一旦亚胺培南耐药,就意味着对现有多种抗菌药物耐药,如今已出现越来越多的泛耐药不动杆菌造成院内感染暴发流行的报道,值得我们关注.不动杆菌的耐药机制较为复杂,包括产多种β内酰胺酶(AmpC酶、ESBLs、碳青霉烯酶)、膜通透性降低(Omp 20 000的缺失)及主动外排泵表达增强.本文将对不动杆菌中主动外排系统的研究现状做一综述.
