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大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及分子分型
目的：研究大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及分子分型。方法2007-2011年从杭州市3家医院分离到22株对碳青霉烯类抗生素不敏感的大肠埃希菌。琼脂稀释法测定抗生素低抑菌浓度（ MIC）；接合试验、PCR扩增和序列分析等研究细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制。脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分型（MLST）和系统发育分型（phylogenetic typing）等对菌株进行分子分型。结果22株大肠埃希菌亚胺培南和美罗培南的MIC范围为1～16μg/ml，厄他培南为2～64μg/ml。所有菌株产KPC-2型碳青霉烯酶及各种β-内酰胺酶，部分菌株同时产质粒介导的AmpC酶。22株大肠埃希菌均可通过接合试验或转化试验将碳青霉烯耐药性传递给大肠埃希菌EC600，使后者获得blaKPC-2基因及与供体菌相似的耐药性。 PFGE显示仅少数菌株为相同克隆或密切相关；MLST显示常见的序列类型为ST131（9株）和ST648（5株）， ST38和ST405各2株；系统发育分析显示9株ST131菌株均为B2群，另有11株属于D群，B1群和A群各1株。结论杭州地区产KPC-2大肠埃希菌主要为世界范围流行的多重耐药菌株ST131，其次为ST648。
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对亚胺培南耐药粘质沙雷菌中质粒介导KPC-2型碳青霉烯酶的研究分析
目的 研究粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的分子机制.方法 临床分离到1株亚胺培南耐药的粘质沙雷菌[小抑菌浓度(MIC)为64μg/ml].将粘质沙雷菌和大肠杆菌进行接合试验,采用琼脂稀释法检测粘质沙雷菌和接合前后大肠杆菌对药物的MIC;提取粘质沙雷菌和接合后大肠杆菌的酶粗提液进行等电聚焦电泳和三维试验;特异性PCR扩增和DNA序列分析确认引起粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的β-内酰胺酶的基因型.结果 除碳青霉烯类抗生素外,粘质沙雷菌还对青霉素类、头孢菌素类和单酰胺类等抗生素耐药,对喹诺酮类和氨基糖甙类抗生素敏感;接合试验可使大肠杆菌获得与粘质沙雷菌相似的耐药谱;等电聚焦电泳显示粘质沙雷菌中存在等电点(PI)分别为6.5和6.7的两种β-内酰胺酶,接合后的大肠杆菌存在PI为6.7的β-内酰胺酶;特异性PCR扩增和DNA序列分析证实PI为6.7的β-内酰胺酶为碳青霉烯酶KPC-2,其核苷酸及氨基酸序列已递交到GenBank,PI为6.5的酶有待进一步研究;在三维试验中,克拉维酸、乙二胺四乙酸(EDTA)和氯唑西林均不能抑制KPC-2酶对亚胺培南的水解活性.结论 首次在粘质沙雷菌中发现碳青霉烯酶KPC-2,该酶是引起粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的主要原因.
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同时携带blaNDM-1和blaKPC-2基因的一株阴沟肠杆菌检测及临床治疗分析
目的 探讨一株同时携带NDM-1和KPC-2基因的阴沟肠杆菌的耐药机制及其分子传播机制.方法 菌株分离自2013年3月徐州医科大学附属医院的一例慢性阻塞性肺疾病患者的痰液.采用改良Hodge试验和金属酶初筛试验检测菌株是否产碳青霉烯酶;采用聚合酶链反应(PCR)检测blaMUS-1、blaVIM-1、blaVIM-2、blaIMP、blaKPC-2、blaNDM-1、blaOXA-48和blaGES等碳青霉烯酶基因,并对阳性片段进行基因测序;通过质粒接合、转化实验证实耐药基因是否由质粒介导,采用琼脂稀释法检测菌株对常用抗菌药物的敏感性.结果 阴沟肠杆菌改良Hodge试验和金属酶抑制试验均为阳性,PCR产物测序证实该菌株携带NDM-1和KPC-2基因,其中NDM-1基因携带在54×103bp的IncX型质粒上,KPC-2基因携带在42×103bp未分型质粒上.药敏试验发现该菌株仅对四环素(2μg/Ml)和替加环素(1μg/Ml)敏感.患者经替加环素联合哌拉西林/他唑巴坦治疗后症状好转.结论 阴沟肠杆菌携带的NDM-1和KPC-2基因可由质粒介导传播,临床上应结合药敏试验治疗该菌引起的感染.
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2株耐碳青霉烯类植生拉乌尔菌耐药基因检测分析
目的 研究耐碳青霉烯类抗菌药物的植生拉乌尔菌耐药机制.方法 收集2014年10月-2015年03月临床分离的两株来自痰液标本耐碳青霉烯类植生拉乌尔菌,采用Vitek2-compact全自动微生物分析仪进行细菌鉴定,并用16S rRNA进行菌株确认,采用E-test进行药敏试验,用PCR扩增检测碳青霉烯酶(KPC、GES、IMI、NDM、VIM、IMP、SIM、OXA-48)、超广谱 β 内酰胺酶(TEM、S HV、CTX-M、VEB、PER)、质粒介导的喹诺酮耐药基因(qnrA、qnrB、qnrS、aac(6')-Ib-cr)以及 Ⅰ 类整合子可变区结构,Southern杂交方法检测2株菌株质粒相关情况.结果 1号菌株携带blaK PC-2和qnrB4耐药基因,Ⅰ 类整合子基因盒种类为arr-3-dfrA27;2号菌株携带blaIM P-4、blaTEM-1、blaCTX-M-3、blaSHV-12、qnrS1和aac(6')-Ib-cr等耐药基因,但无相关整合子基因盒结构.质粒分析发现blaKPC-2和blaIM P-4均位于54kb-60kb可结合质粒上.结论 两株耐碳青霉烯类泛耐药植生拉乌尔菌分别产KPC-2和IM P-4型碳青霉烯酶,需加强耐药监测,避免多重耐药菌播散.
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碳青霉稀类耐药肺炎克雷伯菌耐药机制和多位点序列分型研究
碳青霉烯类抗菌药物被认为是为数不多的可有效治疗高产AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)多重耐药菌引起的严重感染的药物之一.然而,随着碳青霉烯类药物在临床中的大量、广泛应用,碳青酶烯类耐药的肠杆菌科细菌不断增加.其机制主要是细菌产生的碳青霉烯酶能够水解碳青霉稀类抗生素.肺炎克雷伯菌产生碳青霉烯酶主要为产KPC酶.KPC是一种质粒介导的Ambler分类B类酶,能水解几乎所有的β-内酰胺酶和碳青霉稀类抗菌药物.
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肺炎克雷伯菌携带碳青霉烯酶 KPC-2基因环境多态性研究
目的：研究复旦大学附属华山医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌广泛播散初期携带 blaKPC-2的完整基因结构﹐获得其播散的基因背景。方法收集2006年8月―2009年12月连续不重复的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌42株﹐进行质粒抽提、blaKPC-2筛选、多位点序列分型（MLST）；随后设计一系列 PCR 引物﹐对 blaKPC-2基因结构进行完整测序。结果 MLST 分型显示：34株属于 ST11型﹐5株属于 ST423﹐2株属于 ST65﹐1株属于 ST977。主要发现两种携带 blaKPC-2基因结构﹐A 型（8/42）：Tn1721-blaKPC-2-Tn3；B 型（34/42）：Tn1721-blaKPC-2-ΔTn3-IS26﹐且 B 型结构的两端序列存在差异。结论该组中肺炎克雷伯菌携带 blaKPC-2的基因结构存在多态性﹐Tn1721-blaKPC-2-ΔTn3-IS26样结构占优势。研究获得的携带 blaKPC-2基因结构及侧翼的完整序列﹐为进一步正确认识和理解 blaKPC-2的播散模式和机制提供了完整的基因背景。
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耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药基因及同源性分析
目的 了解急诊重症监护病房(ICU)分离耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)耐药基因携带情况和菌株同源性.方法 收集2015年7月至2016年8月分离自徐州医科大学附属医院急诊ICU的CRKP 19株,PCR检测碳青霉烯类耐药基因、超广谱β内酰胺类相关基因及头孢菌素类耐药基因;脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)进行菌株分子分型.结果 19株CRKP菌株中18株检出碳青霉烯类耐药基因,包括blaKPC-2型17株和blaNDM-5型1株;18株菌均携带ESBLs基因,其中blaSHV-12型8株、blaSHV-H型3株、blaSHV-2a型5株,blaTEM-1型15株、blaCTX-M-65型10株,blaCTX-M-15型3株,blaCTX-M-14及blaCTX-M-27型各1株;13株检出头孢菌素类耐药基因,且均为blaDHA-1型.PFGE分型显示19株CRKP可以分为4个型和4个亚型,包括A1型12株,A2型、A3型、A4型各1株,B型2株,C型及D型各1株.MLST显示ST11型15株,ST48型2株以及ST37型1株,1株菌未能分型.其中15株blaKPC-2阳性ST11型菌株PFGE分型为型别A.结论 我院急诊ICU存在携带blaKPC-2基因ST11型CRKP菌株克隆传播,应加强急诊ICU的耐药性监测以及病房的隔离和消毒.
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弗劳地枸橼酸杆菌中质粒介导的KPC-2和NDM-1型碳青霉烯酶基因结构分析
目的 对携带blaNDM-1和blaKPC-2的弗劳地枸橼酸杆菌的碳青霉烯酶基因结构进行分析.方法 收集4株耐碳青霉烯类药物弗劳地枸橼酸杆菌(CF-05、CF-17、CF-35、CF-43),琼脂稀释法测定抗菌药物敏感性;脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析细菌同源性;特异性PCR扩增和序列测定分析碳青霉烯酶耐药基因和ESBLs耐药基因、接合试验、耐药基因周围序列分析对菌株的耐药机制进行分子水平研究.结果 4株细菌仅CF-05对阿米卡星敏感,所有菌株对其他检测药物全部耐药;PFGE结果显示4株细菌不同源;特异性PCR扩增和序列分析显示2株(CF-35、CF-43)同时携带blaNDM-1和blaKPC-2、另2株(CF-05、CF-17)仅携带blaNDM-1,CF-35同时携带blaCTX-M-15;其中3株细菌(CF-05、CF-17、CF-43)接合成功,CF-05、CF-17接合子(CF-05-1和CF-17-1)携带blaNDM-1,CF-43获得2种接合子(CF-43-1携带blaKPC-2、CF-43-2同时携带blaNDM-1和blaKP-2);分析blaNDM-1和blaKPC-2周围序列发现,4株细菌周围序列分别与国内报道携带blaNDM-1和blaKPC-2的肺炎克雷伯菌质粒pNDM-HN380和PK048周围序列高度相似.结论 在4株弗劳地枸橼酸杆菌中检测到NDM-1型碳青霉烯酶,其中2株同时携带KPC-2型碳青霉烯酶,blaNDM-1周围序列和blaKPC-2周围序列与国内已知肺炎克雷伯菌相关耐药基因周围序列高度相似.
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产KPC-2肺炎克雷伯菌的基因分型、毒力基因和血清型特征研究
目的 分析我院产KPC-2肺炎克雷伯菌基因分型、毒力基因和血清型特点.方法 收集碳青霉烯类不敏感肺炎克雷伯菌菌株75株(采用改良Hodge试验和DNA测序以确定其表型和基因型)和同期分离的敏感株97株,脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株间的同源性,PCR检测9种毒力基因allS、rmpA、mrkD、kfuBC、cf29a 、fimH、uge、wabG、ureA和K1、K2、K5、K54、K57、K206种血清型.比较产KPC-2和非产KPC-2肺炎克雷伯菌的毒力基因和血清型差异.结果 75株碳青霉烯类不敏感肺炎克雷伯菌菌株中,有61株细菌经改良Hodge试验初筛为产碳青霉烯酶菌株,PCR扩增及DNA测序确定其为产KPC-2酶.PFGE结果显示,依据相似度80％的折点,产KPC-2酶组的61株细菌来源于30个克隆菌株,不产KPC-2酶组的111株肺炎克雷伯菌来源于96个克隆菌株.allS基因在不产KPC-2组中的阳性率(21.9％)高于在产KPC-2组的阳性率(3.3％),差异有统计学意义(P＜0.05).血清型K1、K2和K54在产KPC-2组与不产KPC-2组间的分布差异无统计学意义(P＞0.05),其他3种血清型未检测到.结论 产KPC-2肺炎克雷伯菌临床分离株携带的尿素酶基因allS减少,且大多不属于高致病性血清型,但作为高度耐药菌,应加强监控.
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产KP C-2肺炎克雷伯菌的MLST和wzi分型分析
目的 探讨产KPC-2肺炎克雷伯菌的多位点序列分型(MLST)并确定其wzi分型.方法 收集南京鼓楼医院2012—2014年分离的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌108株,采用改良Hodge试验筛选产碳青霉烯酶菌株,PCR和DNA测序技术鉴定KPC-2编码基因.对产KPC-2菌株,用MLST技术分析其遗传相关性,并用PCR技术对其进行wzi分型.结果 108株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中,72株产KPC-2.72株产KPC-2菌株经MLST分型分为9个不同克隆型,其中ST11(61/72,84.7％)为流行,其次为ST15(4/72,5.6％);72株产KPC-2细菌有7种wzi分型,wzi209(K47荚膜型)为流行(58/72,80.6％),其次为wzi64(K64荚膜型)(6/72,8.3％).结论 产KPC-2肺炎克雷伯菌ST11型在我院存在克隆播散,大多为wzi209,荚膜型为K47,需加强感染控制措施.
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siHybrids分子对耐药肺炎克雷伯菌kpc-2抑制作用研究
目的:本研究采用RNA干扰技术和合成小分子抑制剂的方法,研究siHybrids分子对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯杆菌耐药性的影响.方法:通过对临床分离的48株肺炎克雷伯杆菌进行药敏实验,初步筛选并收集了耐碳青霉烯类抗生素的菌株;进一步利用PCR检测,筛选出携带碳青霉烯酶基因kpc-2的耐药株.利用siHybrids技术,针对kpc-2设计合成siHybrids杂合分子,对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因kpc-2进行特异性沉默后,通过荧光定量PCR实验检测siHybrids沉默靶基因kpc-2的体外表达水平,并通过联合抑菌实验验证siHybrids分子提高抗生素抗菌活性乃至逆转细菌耐药性的效果.结果:合成的小分子siHybrids可以使耐药肺炎克雷伯杆菌kpc-2基因的表达下调,并且与碳青霉烯类抗生素亚胺培南、美罗培南、厄他培南分别联合使用,可使肺炎克雷伯杆菌对亚胺培南、美罗培南、厄他培南由耐药转为敏感.结论:siHybrids可以特异地抑制耐药肺炎克雷伯杆菌kpc-2基因的表达,通过干扰产碳青霉烯酶基因kpc-2造成肺炎克雷伯杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药性的逆转.
关键词： 肺炎克雷伯杆菌 碳青霉烯酶 KPC-2 siHybrids分子 -
碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌耐药机制及分子流行病学研究
目的：探讨临床分离的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐药基因及分子流行病学研究。方法收集并鉴定临床分离非重复碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌株44株。采用Vitek 2 compact全自动微生物鉴定药敏分析仪鉴定进行常规药敏试验，改良Hodge试验检测KPC型碳青霉烯酶，EDTA协同法检测金属β-内酰胺酶，聚合酶链反应（ PCR ）法检测细菌携带的耐药基因。肠杆菌基因间重复性共有序列ERIC-PCR对菌株进行同源性分析，了解其分子流行病学特征。结果44株肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗菌药物显示了较高的耐药性。改良Hodge试验阳性41株，金属酶检测试验结果均为阴性。 PCR结果显示，临床分离的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌以KPC-2型为主，共42株。 ERIC-PCR将44株肺炎克雷伯菌分为14型，以Ⅰ型为主，共18株，集中于重症监护室（ ICU）和神经外科。结论分离的碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌对临床常用抗菌药物表现出高水平耐药；其耐药机制主要是该类细菌产KPC-2碳青霉烯酶，ICU 与其它科室的患者频繁转诊治疗可能是导致碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌在全院范围播散流行的主要原因。
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碳青霉烯酶在黏质沙雷菌中的耐药基因研究
目的 研究对碳青霉烯类抗生素耐药的黏质沙雷菌的基因分型.方法 收集咸阳地区2010年-2014年15株对亚胺培南和美罗培南耐药的黏质沙雷菌株,应用PCR扩增和DNA序列分析,确认引起黏质沙雷菌耐碳青霉烯酶的基因型;将黏质沙雷菌与大肠埃希菌进行结合,并测定结合后大肠埃希菌对碳青霉烯类药物的MIC值.结果 PCR检测结果9株(9/15)携带KPC-2基因,1株(1/15)携带IMP基因,l株(1/15)携带VIM基因,接合实验使大肠埃希菌与黏质沙雷菌有相似的耐药谱.结论 耐碳青霉烯酶的黏质沙雷菌的主要耐药基因为KPC-2、IMP-2、VIM,是引起黏质沙雷菌耐药的主要原因.接合实验阳性提示耐药基因通过接合转录的方式在不同种属细菌间进行传播,应加强院内感染的监测和预防.
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用生物化学方法从植物内生真菌提取液中高通量筛选细菌β-内酰胺酶抑制物
目的 采用生物化学方法从植物内生真菌代谢物中筛选细菌β-酰胺酶抑制剂.方法 克隆β-内酰胺酶KPC-2、TEM-10和NDM-1基因至表达载体pET28;纯化重组蛋白质,以此为药靶,从植物内生真菌代谢产物库中高通量筛选β-内酰胺酶抑制物；检测效应物对β-内酰胺类药物的增效效应.结果 成功克隆了3个目的基因,纯化了重组蛋白质至纯度80-95％;从3752种真菌提取液中筛选确定了5个对3种纯化的β-内酰胺酶活性均有抑制的效应物,其中效应物PF000,212能够使美罗培南对3株携带NDM-1基因的临床分离“超级细菌”菌株的低抑菌浓度降低8～16倍.结论 以β-内酰胺酶为药靶,以植物内生真菌代谢物为材料,应用生物化学方法进行高通量筛选,是获得新型β-内酰胺酶抑制物的一条有效途径.
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碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷菌的流行病学分析
目的 分析无锡市第二人民医院呼吸科ICU临床分离的碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌(CRKP)的分子流行现状.方法 选取我院2016年01月～2016年11月呼吸科ICU检出的所有的非重复的CRKP共35株,所有菌株表型实验及耐药基因检测、ERIC-PCR分析.结果 碳青霉烯类失活试验、Carba NP水解试验的诊断效能较高.ERIC结果显示35株菌:A型25株,B1型7株,B2型3株.结论 无锡二院呼吸科CRKP的首要原因是产KPC-2酶.ERIC-PCR的同源性分析的较好手段.
关键词： 碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌 KPC-2 ERIC-PCR
