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ERIC-PCR在肠道致病菌基因分型和流行病学中的应用
肠杆菌基因间重复共有序列PCR研究是分子流行病学分子分型方法的一种,根据所得数目不等、大小不同的各自独特的电泳带型来达到菌株分型的目的,近年逐渐引起了人们的关注.现已用于纯菌、人工混合菌和微生物群落的结构分析.本文对肠杆菌基因间重复共有序列PCR的基本原理、优缺点、发展概况及其在肠道致病菌基因分型和流行病学研究中的应用进行了简要.
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菊苣提取物对腹型肥胖大鼠肠道菌群的影响
目的:以肠道菌群为切入点,探讨菊苣提取物干预腹型肥胖大鼠的作用机制.方法:雄性SD大鼠随机分为5组,即正常组、模型组、菊苣大、小剂量组和非诺贝特组,正常组给予去离子水,其他组给予10％果糖水,生化法检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC),测量体质量、腹围,ERIC-PCR指纹图谱宏观观察肠道菌群结构变化.结果:与正常组相比,模型大鼠体质量、腹围、腹脂量、腹脂率、TG明显升高(P＜0.05);与模型组相比,菊苣提取物大、小剂量组、非诺贝特组可以显著降低TG水平及腹脂量和腹脂率(P＜0.05,P＜0.01).肠道菌群ERIC-PCR条带发生明显的变化.结论:菊苣提取物可治疗腹型肥胖,并可调节腹型肥胖大鼠菌群紊乱,提示肠道菌群可能是菊苣干预腹型肥胖的药效机制之一.
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3种健脾补气方药对脾气虚证大鼠肠道菌群的影响
目的:研究3种健脾补气方药对脾气虚证大鼠肠道菌群的影响,并探讨其作用机制.方法:利用运动疲劳兼饥饱失常法复制大鼠脾气虚证模型,采用ERIC-PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR)指纹图谱分析技术观察比较灌胃给予四君子汤(含生药10.8,3.6,1.2 g·kg-1)、理中汤(16.2,5.4,1.8 g·kg-1)和补中益气汤(14.4,4.8,1.6 g·kg-1)3种临床常用健脾补气方药对脾气虚证大鼠的治疗作用,研究其对肠道菌群的影响.结果:造模后大鼠肠道菌群ERIC-PCR指纹图谱条带位置、数量及丰度与健康状态相比均发生改变,说明其肠道菌群发生了一定变化.给予3种健脾补气方药后,大鼠ERIC-PCR指纹图谱多样性指数(shannon's index,H')有所回升,各给药治疗组与健康时期的相似性系数(sorenson's pairwise similarity) coefficent,Cs)与模型组相比显著升高.结论:ERIC-PCR指纹图谱分析技术是分析肠道菌群变化较理想的1种方法,该技术可用于脾气虚证本质和治疗脾气虚证药物的筛选或评价相关研究中.3种健脾补气方药对肠道菌群均具有一定的调节作用,其对肠道菌群的调节可能为其治疗脾气虚证的作用机制之一.
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维吾尔医学4种正常体液质人群肠道菌群结构ERIC-PCR指纹图谱分析
目的:了解维吾尔医学4种正常体液质人群肠道菌群结构的多样性以及4种体液质人群之间菌群分布的差异性.方法:对141例健康人进行维吾尔医学分型.采集受检者粪便样品.提取总DNA,以此作模板获得反映肠道菌群组成的ERIC-PCR指纹图谱;计算各样本多样性指数和群落相似性系数.结果:不同体液质人群肠道菌群结构多样性具有一定程度上的差异.血液质型人群肠道菌群结构具有较高的多样性和相似性,而粘液质人群肠道茵群结构的多样性程度较低.维医4种正常体液质人群肠道菌群分布结构存在一定程度的差异.
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19株新分离噬菌体可裂解肺炎克雷伯菌临床株的ERIC-PCR指纹图谱分析
目的 测定19株新分离噬菌体对30株肺炎克雷伯菌临床株的噬菌谱;对噬菌体可感染菌侏进行同源性分析以进一步评价其噬菌谱. 方法 利用滴斑法测定19株新分离噬菌体的噬菌谱:采用肠杆菌基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR)对噬菌体感染的菌株进行同源性分析. 结果 19株新分离噬菌体的噬菌谱可覆盖67％的被调查菌株(20/30).其中以噬菌体P13感染的菌株多,占33％(10/30),但这些菌株的ERIC-PCR分型仅归属于2种类型:Ⅰ型和Ⅵ型;噬菌体P27感染20％(6/30)的菌株,这些菌株的ERIC-PCR分型归属于4种类型:Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅷ型. 结论 根据肺炎克雷伯菌的ERIC-PCR指纹图谱分型信息,以噬菌体P27的噬菌谱较宽,可感染4种类型亲缘关系较远的肺炎克雷伯菌临床株.
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51株临床铜绿假单胞菌ERIC-PCR分型与噬菌体分型比较研究
目的 探讨噬菌体分型技术和ERIC-PCR技术对51株临床铜绿假单胞菌的相关性. 方法 临床铜绿假单胞菌51株使用PL39、PL15、PL16、PL18、PL49和PL62(滴斑法)进行噬菌体分型,采用肠杆菌基因间重复一致序列为引物进行ERIC-PCR分型,比较两种分型方法的差异. 结果 51株铜绿假单胞菌的ERIC-PCR指纹图谱使用UPGMA法进行聚类分析,分为1型、2型和3型,使用噬菌体分型可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ群6个群.经Spearman等级相关分析,铜绿假单胞菌ERIC-PCR分型与6种噬菌体分型无显著相关性(r=-0.055,P＞0.05). 结论 细菌ERIC-PCR分型较噬菌体分型分辨率低,因此在细菌同源性分析时应结合多种分型技术分析菌株的遗传进化关系.
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大肠埃希菌基因间重复序列PCR反应体系的优化
目的 对大肠埃希菌ERIC-PCR反应体系进行优化. 方法 提取大肠埃希菌基大组DNA作为ERIC-PCR反应的模板,通过设计一个L9(34)正交试验对Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq DNA聚合酶4种因素进行优化. 结果 通过L9(34)正交试验优化的大肠埃希菌ERIC-PCR佳反应体系(25μl)为:2.5μl 10×Loading buffer,Mg2+浓度2.0 mmol/L,dNTPs浓度200 μmol/L,引物浓度0.2 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0U,模板DNA 40 ng.应用该体系进行ERIC-PCR得到的DNA指纹图谱条带丰富、清晰、重复性好. 结论 采用正交试验优化的ERIC-PCR反应体系结果稳定可靠,对于大肠埃希菌在分子水平上的分型鉴定以及分子流行病学调查具有重要意义.
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应用 ERIC-PCR 技术分析多药耐药肺炎克雷伯菌的基因分型
目的分析多药耐药肺炎克雷伯菌的肠杆菌科基因间重复一致序列PCR（ ERIC-PCR）基因分型，为临床诊断和防治肺炎克雷伯菌感染提供依据。方法先利用纸片扩散法检测18株临床分离的肺炎克雷伯菌对17种抗菌药物的耐药性并获得耐药谱型；再利用ERIC-PCR获得18株肺炎克雷伯菌DNA指纹图谱，通过非加权配对聚类分析（ UPGMA）法构建分子进化树；后探讨肺炎克雷伯菌ERIC-PCR基因型与其耐药性及耐药谱之间的关系。结果18株肺炎克雷伯菌对17种抗生素呈不同程度耐药，对亚胺培南敏感性达100％。18株肺炎克雷伯菌对17种抗生素呈现12种耐药模式，并可分为9种基因型。结论肺炎克雷伯菌耐药性及耐药谱与特定的ERIC-PCR基因型之间存在较高程度的关联。
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医院感染耐亚胺培南铜绿假单胞菌与oprD2基因相关的ERIC分型研究
目的 探究耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IRPA)的oprD2基因缺失在天津地区3所三甲医院内的分布以及该菌的克隆流行情况.方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法检测60株IRPA的oprD2基因缺失情况,并以基于肠杆菌科基因间重复一致序列PCR(ERIC-PCR)方法对其中的54株进行分子生物学分型.结果 60株IRPA中有38株oprD2基因缺失.且3所医院的oprD2基因缺失率差异无统计学意义(P＞0.05),54株IRPA用ERICPCR方法分为30型.结论 IRPA的oprD2基因缺失在天津地区的分布差异无统计学意义,且提示尚有其他原因造成亚胺堵南/西司他丁耐药株流行;个别科室内的IRPA存在克隆流行趋势,应注意监控IRPA在医院内的暴发流行.
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铜绿假单胞菌采用肠杆菌属重复基因间隔共有序列-PCR的分析
目的 探讨铜绿假单胞菌(PAE)多重耐药情况,为临床治疗和防治医院感染提供依据. 方法 从重症监护病房(ICU)＞60岁的患者中分离到的14株PAE,进行传统的生化、PCR方法、药敏分型和质粒、肠杆菌重复基因间隔共有序列(ERIC)-PCR多态性分析. 结果 传统的生化分为一个型,API 20 NE结果为1344575,药敏则呈现出多重耐药,质粒分型有10株得到约23kb的质粒,其余4株则无,质粒的有无与多重耐药无直接关系;运用ERIC-PCR技术进行基因谱系,聚类分析将株菌主要分为3大类,相似系数从0.62～0.88. 结论 ICU的PAE在老年患者中呈现出散发的状态, ERIC-PCR指纹图谱基因技术分型方法分辨率高,可重复性好,简便快捷,可用于PAE医院感染流行病学监测.
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呼吸科病房嗜麦芽窄食单胞菌的分子流行病学调查
目的 了解广州呼吸疾病研究所嗜麦芽窄食单胞菌分子流行病学与临床危险因素的关系.方法 回顾分析2008年3～4月呼吸科20株临床分离嗜麦芽窄食单胞菌的药敏结果.ERIC-PCR分析菌株的来源特征.分析患者的临床危险冈素包括基础疾病,抗生素治疗情况,机械通气史等.结果 20株嗜麦芽窄食单胞菌体外对亚胺培南、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢曲松、氨曲南等100%耐药;对环丙沙星、阿米卡星、复方磺胺甲噁唑和米诺环素等的敏感性分别为65%、65%、85%和95%;ERIC-PCR显示20株嗜麦芽窄食单胞菌由17种不同克隆构成,药敏谱与基因型之间无显著相关性;患者临床资料显示其普遍具有易感性.结论 20株嗜麦芽窄食单胞菌分子流行病学调查显示其基因型多态性,未发现克隆株的传播;在严格的感染控制措施下,嗜麦芽窄食单胞菌小易出现克隆传播,降低临床危险因素对控制嗜麦芽窄食单胞菌发生至关重要.
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鲍曼不动杆菌30株基因同源性分析
鲍曼不动杆菌广泛存在于人体皮肤、呼吸道和泌尿生殖道,是引起医院内感染的常见机会致病菌.目前世界上已有多个国家和地区报道多重耐药鲍曼不动杆菌医院感染爆发流行[1],给临床治疗带来极大困难.为了解河北省临床分离的鲍曼不动杆菌的耐药情况,我们对2004年12月至2008年8月从河北省3家医院分离的30株鲍曼不动杆菌的耐药谱进行了测定,并检测其耐药基因携带情况,采用ERIC-PCR方法对不同医院的分离株进行基因同源性分析,为及时控制多重耐药菌株的进一步传播提供实验依据.
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ERIC-PCR指纹图谱分析逍遥散对抑郁模型大鼠肠道菌群的影响
目的 探讨逍遥散对抑郁模型大鼠肠道菌群的影响.方法 用肠杆菌的基因间重复共有序列(ERIC)为引物的聚合酶链式反应(PCR)指纹图谱技术分析抑郁模型大鼠及逍遥散干预后肠道菌群结构特征,SD大鼠随机分为健康对照组、模型组、盐酸氟西汀组和逍遥散组.复制慢性温和不可预知应激抑郁模型(CUMS),造模3周恢复1周后无菌收集回肠、盲肠和结肠内容物,利用ERIC-PCR技术比较肠道不同部位菌群多态性结构,分析抑郁模型大鼠及逍遥散干预后大鼠肠道菌群的结构变化.结果 行为学结果表明CUMS模型复制成功;ERIC-PCR、聚类分析、主成分分析和Shannon-Wiener指数进行验证结果显示大鼠盲肠菌群结构失调,而氟西汀和逍遥散均有良好恢复作用.结论 本研究建立了大鼠肠道菌群ERIC-PCR分析方法,并采用聚类分析、主成分分析和Shannon-Wiener指数进行验证,发现CUMS能够引起大鼠肠道菌群发生明显改变,其中盲肠菌群结构的变化为显著,而逍遥散具有扶持正常菌群生长和调整菌群失调的作用.本文为逍遥散抗抑郁机制研究提供了新的思路和方法.
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生鲜肉中肠炎沙门菌分子生物学特征分析
目的 了解生鲜肉类中肠炎沙门菌耐药性及基因变异情况.方法 药敏试验采用K-B法,用碱裂解法提取细菌的质粒DNA,采用肠杆菌重复基因间隔重复共有序列(ERIC-PCR)技术对10株肠炎沙门菌进行基因分析,运用NTSYS-PC2.0软件进行同源性比较,聚类分析.结果 药敏呈现出多重耐药;基因谱系与聚类分析可将菌株分为3大类,扩增片段长度为250 bp～2 000 bp,在85%的同源度上可分为A、B、C等3个型,其中A型2株,B型6株,C型2株.结论 生鲜肉中肠炎沙门菌耐药情况比较普遍,10株肠炎沙门菌基因变异较小,ERIC-PCR技术是分析、鉴定肠炎沙门菌,追溯食物中肠炎沙门菌的有用和可行的工具.
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沈阳市副溶血弧菌重复序列PCR分型
目的 探讨重复序列PCR对临床分离株副溶血弧菌进行分型的可行性;从分子水平了解沈阳市流行的副溶血弧菌菌型特征.方法 利用基因外重复回文序列-PCR(PEP-PCR)和肠细菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)对40株临床分离副溶血弧菌基因组DNA进行扩增,对扩增的DNA电泳指纹图谱进行分型分析.结果 40株副溶血弧菌呈现不同程度的基因多态性.基因外重复回文序列-PCR分辨力指数可达到0.953,40株菌株分为16个型,优势菌型为G型,占总菌数的20.0%.肠细菌基因间共有重复序列-PCR分辨力指数为0.5;40株菌株可分为4个型,优势菌型为D型,占总菌数的67.5%.结论 重复序列PCR可以用于副溶血弧菌临床分离株的分子分型研究,其分型敏感程度优于血型分型.
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鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因分布与耐药相关性研究
目的 研究鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因的分布与其耐药的相关性.方法 收集2015年1月至2017年3月瑞安市两家市级医院的100株耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌,应用PCR技术检测碳青霉烯酶的相关基因,应用ERIC-PCR法对筛选结果阳性菌株进行DNA同源性分析.结果 100株耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌中,有50株携带OXA-51基因,26株携带OXA-23基因,同时携带OXA-51和OXA-23基因的有10株,未检出其他碳青霉烯酶基因.对筛选出的58株鲍曼不动杆菌进行同源性分析,得出的DNA指纹条带数为7条,其大小为200～2 000 bp.根据片段数目和大小,分为A、B、C、D、E共5种基因型,分别有38、32、21、5、4个克隆株.结论 本地区鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的机制主要为携带OXA-23基因,克隆传播是主要的传播途径.
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临床分离耐甲氧西林溶血性葡萄球菌的SCCmec分型及同源性分析
目的 了解临床分离耐甲氧西林溶血性葡萄球菌(MRSH)的SCCmec基因型别及相同SCCmec型别菌株的同源性.方法 多重PCR进行SCCmec分型,ERIC-PCR法对相同SCCmec型别菌株进行同源性分析.结果 83株临床分离MRSH菌株中,SCCmec Ⅰ型有23株(27.7％),SCCmec Ⅱ型有10株(12.1％),SCCmecⅢ型有24株(28.9％),SCCmecⅣ型有1株(1.2％),Ⅰ、Ⅱ混合型有8株(9.6％),Ⅰ、Ⅲ混合型有6株(7.2％),Ⅱ、Ⅲ混合型有5株(6.0％),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合型有3株(3.6％),未分型3株(3.6％).ERIC-PCR结果显示,23株SCCmec Ⅰ型分为Ⅱ型,其中A型5株,B型5株,C型3株,其余8株各为1型,2株未分型；10株SCCmecⅡ型分为6型,其中D型4株,E型2株,3株各为1型,1株未分型；24株SCCmec Ⅲ型分为9型,其中F型11株,G型2株,H型2株,Ⅰ型2株,5株各为1型,2株未分型.结论 临床分离MRSH中,SCCmec Ⅰ、Ⅲ型为多,部分菌株呈混合型别；相同SCCmec型别的部分菌株之间可能存在克隆传播.
关键词： 耐甲氧西林溶血性葡萄球菌 SCCmec分型 ERIC-PCR 同源性 -
产ESBLs肠杆菌科细菌的检测及耐药性
目的 对产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的病原菌分布及耐药性进行分析,进而为临床合理用药提供依据.方法 应用西门子MicroScan autoSCAN4全自动细菌鉴定及药敏分析仪对2014年1月-12月在大连市妇幼保健院住院患者送检的标本进行菌株鉴定及药敏分析,对提示产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌进行纸片扩散法确认,统计分析其分布情况及耐药情况.采用ERIC-PCR法检测同源性.结果 检测出125株产ESBLs的肠杆菌,包括大肠埃希菌88株,肺炎克雷伯菌37株.其病区分布情况:肺炎克雷伯菌主要分布在新生儿科,占67.6％,且存在流行感染.大肠埃希菌主要分布在各个产科病房,占48.9％.产ESBLs的肠杆菌对18种抗菌药物的分析表明对β-内酰胺类及第三代头孢菌素类抗生素耐药率达100.0％,对氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类和磺胺类药物出现不同程度的耐药,对碳青霉烯类抗生素敏感率较高.结论 临床分离的产ESBLs的肠杆菌主要以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主,且为多重耐药,甚至广泛耐药,因此临床治疗上应严格合理选用抗生素.
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健康儿童与轮状病毒感染儿童肠道菌群结构的比较研究
目的比较分析轮状病毒感染个体与健康个体肠道菌群结构的差异.方法采集11例轮状病毒感染个体及6例健康个体的粪便样品,提取粪便样品中细菌的混合DNA,先通过ERIC-PCR结合分子杂交的技术分析两组个体之间肠道微生物组成的相似性;再扩增粪便样品中菌群的16S rRNA基因,利用PCR-TGGE技术分析肠道菌群的组成情况.结果轮状病毒感染个体与健康个体相比,肠道菌群中GC含量较低的菌明显减少,同时肠道菌群有宿主专一性.结论轮状病毒感染会导致儿童肠道内菌群结构失调.
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玉米须水提物对糖尿病大鼠肠道菌群的调节作用
目的 考察玉米须水提物对糖尿病大鼠肠道菌群的调节作用,探讨其作用机制.方法 利用高脂饲料联合链脲佐菌素诱导建立糖尿病大鼠模型,收集正常组、高脂组、模型组及给药组大鼠粪便,采用ERIC-PCR指纹图谱技术和气相色谱法分析不同组大鼠粪便的菌群多态性结构及短链脂肪酸含量的变化.结果 ERIC-PCR指纹图谱显示,正常组在250～750 bp间显示两条特征条带,而高脂组与模型组则在100～250 bp间出现多条特征条带,250～750 bp间的条带变浅或消失,给药组的指纹图谱接近正常组;高脂组和模型组大鼠粪便的乙酸、丙酸、丁酸含量与正常组相比均显著下降(P＜0.05),模型组大鼠降低尤为显著,给药组三种短链脂肪酸含量相对于模型组及高脂组明显升高(P＜0.05).结论 玉米须水提物可能通过调节糖尿病大鼠肠道菌群的结构而使短链脂肪酸的含量增加进而发挥降糖作用.
