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甲磺酸伊马替尼合成路线图解
甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate,1),化学名为4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-N-[4-甲基-3[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]苯甲酰胺甲磺酸盐,是瑞士Novartis公司研发的Bcr-Abl酪氨酸激酶受体抑制剂,2001年首次在美国上市,商品名Gleevec.
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舒尼替尼合成路线图解
舒尼替尼(sunitinib,1),化学名为N-[2-(二乙胺基)乙基]-5-[(Z)-5-氟-2,3-二氢-2-氧代-1H-吲哚-3-基亚甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺,是美国辉瑞公司研发的多靶点酪氨酸激酶受体抑制剂,其苹果酸盐于2006年在美国上市,临床用于治疗胃肠道基质肿瘤和转移性肾细胞癌.本品是一种新型双重作用及多靶点的口服药物,可抑制肿瘤生长和阻断肿瘤的血供,从而使肿瘤失去继续分裂和生长的能力,目前对其它多种肿瘤的治疗正处于临床研究阶段[1,2].
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表皮生长因子受体蛋白酪氨酸激酶的表达、纯化及活性测定
目的:采用原核表达体系对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)受体型酪氨酸激酶(recep-tor tyrosine kinase,RTK)进行体外表达、纯化及活性鉴定.方法:以包含EGFR cDNA的pRK5质粒为模板,PCR选择扩增编码EGFR-RTK的cDNA片段,插入pQE30质粒后转染大肠杆菌M15.IPTG诱导表达融合蛋白,包涵体蛋白经复性后亲和层析法纯化,ELISA方法测定蛋白活性.结果:成功地将933 bp的EGFR-RTK cDNA片段插入载体pQE30中,构建了表达载体pQE30-RTK.经诱导在原核表达系统中以包涵体形式高效表达了相对分子质量为37 000的EGFR-RTK融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的65.2%.复性、纯化后的EGFR-RTK蛋白经ELISA检测,结果发现随着加入蛋白量的增加,酶促反应产物磷酸化酪氨酸的量也逐渐增加,两者具有线性关系.结论:本实验成功地利用原核表达系统表达了具有生物学活性的EGFR-RTK,较传统的昆虫细胞表达系统更为简便、经济.
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COX-2抑制剂联合舒尼替尼增强对荷瘤小鼠肾癌抑制作用的机制
目的 通过COX-2抑制剂与舒尼替尼联合用药,观察其对荷RenCa肾癌BALB/e小鼠移植瘤的抑制作用,以及对小鼠外周血、脾脏、淋巴结的骨髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)与调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的影响.方法 建立BALB/c小鼠RenCa肾癌皮下移植瘤模型.模型动物分为4组,每组10只,分别为舒尼替尼治疗组、COX-2抑制剂(塞来昔布)治疗组、舒尼替尼+COX-2抑制剂治疗组和空白对照组.各组按时给药并绘制肿瘤生长曲线;流式细胞术检测小鼠外周血、脾脏中Treg、MDSC数目的变化;流式细胞术分选MDSC,提取蛋白质,Western blot检测STAT-3水平.结果 联合用药组相较于对照组,脾脏MDSC数目明显降低(1.22%±0.15% vs.9.34%±0.58%,P<0.01),外周血MDSC数目明显降低(12.7%±0.85% vs.23.0%±1.68%,P<0.01),脾脏Treg明显降低(11.3%±1.69% vs.22.4%±2.31%,P<0.01),外周血Treg明显降低(3.30%±0.64% vs.11.9%±1.53%,P<0.01).经流式细胞术分选后的脾脏MDSC中,联合用药组较单用药组STAT-3水平明显下降(P<0.01).结论 COX-2抑制剂与舒尼替尼联合用药对肾透明细胞癌的抗肿瘤作用优于任何单独用药,其机制可能是通过减少免疫抑制细胞,调节机体肿瘤免疫环境,从而增强分子靶向药物的抗肿瘤效果.
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原发性低丙种球蛋白血症Bruton's酪氨酸激酶表达研究
目的研究临床诊断为原发性低丙种球蛋白血症Bruton's酪氨酸激酶(BTK)表达及意义.方法使用抗BTK单克隆抗体通过流式细胞仪技术分析细胞BTK表达.经临床和常规实验检查诊断为原发性低丙种球蛋白血症的8例来自不同家系的患者和其中5例患者的母亲.结果正常对照者单核细胞BTK表达均大于95%.8例受检患者中7例单核细胞中BTK表达明显降低,基因分析存在BTK突变.1例BTK表达正常,基因分析BTK正常.检测的5例患者母亲中3例单核细胞BTK表达降低,BTK基因分析也表现为嵌合型.2例BTK表达正常,BTK基因正常.结论通过流式细胞仪检测单核细胞内BTK表达可作为诊断X-连锁无丙种球蛋白血症(XLA)手段之一,并可能用于甄别XLA携带者.
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甲磺酸伊马替尼联合造血干细胞移植治疗慢性髓细胞性白血病
甲磺酸伊马替尼(STI571,商品名格列卫)是人工合成的酪氨酸激酶(PTK)抑制剂,可使慢性髓细胞性白血病(CML)细胞分化并促进凋亡,而对正常造血几乎无抑制作用,代表了CML治疗的新进展.
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整合素介导小鼠卵内钙离子增加
为了研究整合素是否作为跨膜信号传递受体介导小鼠卵[Ca2+]i的变化并探讨其机制.本实验采用甘-精-甘-天冬-丝-脯(GLY-ARG-GLY-ASP-SER-PRO,RGD肽)、纤连蛋白(fibronectin,Fn)及抗整合素α6、β1的单克隆抗体作用于负载了钙探针Fluo-3/AM的去透明带小鼠卵,用激光共聚焦显微镜检测小鼠卵的荧光强度以反映卵[Ca2+]i;用无钙液替代有钙液、或用酪氨酸激酶抑制剂或蛋白激酶C的抑制剂预先作用于卵,然后再观察RGD肽所致卵[Ca2+]i的变化.结果显示整合素配体RGD肽或Fn作用于去透明带小鼠卵可引起卵[Ca2+]i增加,增加的程度与精子作用相似;去除培养液中的Ca2+后,再用RGD肽、Fn作用仍可引起卵[Ca2+]i增加;用功能性的抗小鼠整合素α6、β1的单克隆抗体也可引起不同程度的卵[Ca2+]1增加,尤其以抗小鼠整合素α6单克隆抗体的作用明显;用酪氨酸激酶抑制剂预先作用于鼠卵,RGD肽或精子作用都不再引起卵[Ca2+]i增加;蛋白激酶C抑制剂预先作用鼠卵,RGD肽及Fn也不再引起卵[Ca2+]i增加.实验证明,小鼠卵膜整合素与其配体结合可使卵内贮存钙离子释放,引起卵[Ca2+]i增加这一卵激活的早期事件;整合素介导小鼠卵激活需要酪氨酸激酶信号转导途径的参与;蛋白激酶C也参与了整合素介导的卵激活.
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α1-肾上腺素受体亚型介导细胞内游离Ca2+增高的信号转导途径
本文探讨了α1a,α1b,α1d三种亚型肾上腺素受体(AR)激动时细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)升高的信号转导途径.在稳定表达三亚型α1-AR的HEK293细胞系中,用fura-2方法描记细胞内Ca2+信号强弱的变化.结果显示,百日咳毒素(PTX)对去甲肾上腺素激动三亚型α1-AR而引起的[Ca2+]i升高无影响,U-73122和PMA明显抑制[Ca2+]i升高;Calphostin C和PMA过夜预处理可翻转PMA的抑制作用;Forskolin和Rp-cAMPs对α1-AR介导的[Ca2+]i升高无影响,但Quercetin和Tyrphostin可抑制[Ca2+]i升高峰值,对平台期幅值则无影响.因此,在HEK293细胞,三亚型α1-AR可通过PTX非敏感G蛋白激活PLC而介导磷酸肌醇-Ca2+信号系统,PKC磷酸化系统既抑制α1-AR介导的细胞内贮存Ca2+释放,又抑制细胞外Ca2+内流;cAMP系统不参与α1-AR介导Ca2+信号的调节,酪氨酸激酶可能参与这一过程.
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VEGFR-1与心血管疾病
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)主要与两种酪氨酸激酶受体结合:VEGFR-1(vascular endothelial growth factor receptor-1),也称Flt-1(Fms-like tyrosine kinase,1990年Shibuya等分离并命名),VEGFR-2(vascular endothelial growth factor receptor-2),又称Flk-1(fetal liver kinase,1991年Matthews等从小鼠造血干细胞中克隆).
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STAT1基因与肿瘤及其放疗关系的研究进展
STATs家族包括STAT1-4、5A、5B和6七个成员,都有各自的细胞因子信号转导通路[1]。 STAT1是第一个被发现的STATs 家族成员,主要通过酪氨酸激酶( Janus Kinase , ;JAK)/STAT通路被激活,参与细胞生长、增殖、分化以及凋亡等生理过程,且STAT1被认为是一种肿瘤抑制因子[2]。有研究显示高表达STAT1肿瘤细胞中, STAT1通过对细胞周期的调节而产生放射抵抗作用[3]。目前,针对STAT1的大多数研究停留在其信号通路上,而对放疗敏感性的研究不多,STAT1与放疗的关系仍不明确。现就STAT1的结构和功能,与肿瘤及其放疗关系的研究进展作一综述。
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血管内皮生长因子及其受体在尖锐湿疣组织中的表达
血管内皮生长因子(VEGF)有两种特异性受体,分别为含激酶插入区受体(KDR)和fms样酪氨酸激酶-1(Flt-1),主要分布在血管内皮细胞表面[1].研究表明在人类实体肿瘤中VEGF表达升高[2].本实验用RT-PCR方法检测VEGF、Flt-1、KDR的mRNA在尖锐湿疣组织的表达,探讨在尖锐湿疣发病机制的作用.
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一播散性浅表光线性汗孔角化病家系BNC、CSK基因突变
1999年,通过全基因组扫描,我们在一个遗传了7代的中国人家系中,将播散性浅表光线性汗孔角化病(DSAP)基因首次定位在12q23.2-24.1[1].张正华等[2]对DSAP家系进行扫描也证实了疾病基因与此位点相关.2002年我们又将另一个常染色体显性遗传的DSAP家系定位于15q25.1-26.1 D15S1023和D15S1030之间6.4 cM范围内[3].这是我们对该病定位的第2个位点,我们称之为DSAP2.为了克隆DSAP2的致病基因,我们从该区间选取了2个侯选基因BNC(basonuclin)、CSK(c-src酪氨酸激酶),对该家系进行突变检测.
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胰岛素样生长因子-Ⅰ受体蛋白在瘢痕疙瘩中的表达
研究发现胰岛素样生长因子(IGF)-Ⅰ能降低烧伤后增生性瘢痕中成纤维细胞合成胶原酶mRNA的水平和胶原酶的活性[1].IGF-Ⅰ的功能主要靠与IGF-Ⅰ受体(IGF-Ⅰ R)结合来介导完成.成熟的IGF-Ⅰ R由4个亚基(α2β2)组成.位于细胞外的α链具有配体结合部位,通过二硫键与β链共价连接.β链有跨膜和胞内部分,具有酪氨酸激酶活性部位.本研究主要观察正常成纤维细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞中IGF-Ⅰ Rα亚单位的表达,以进一步探讨IGF-Ⅰ和IGF-Ⅰ R通路在瘢痕疙瘩形成中的作用.
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人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞对蛋白激酶C激活的不同生物学效应
细胞信号传导调节通路主要包括蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)、酪氨酸激酶等酶系统。它们广泛参与细胞的各种生物学过程如增殖、分化、基因的表达和功能蛋白的合成等[1,2]。PKC是其中重要的调节通路。已发现人角质形成细胞和真皮成纤维细胞中均有PKC的多种亚型,但是对这两种细胞在PKC激活后生物学效应的比较研究甚少。我们通过体外实验,观察了PKC激活剂乙酸肉寇佛泊酯(PMA)刺激后角质形成细胞和真皮成纤维细胞在形态学、细胞增殖以及细胞因子产生等方面的变化,发现这两种细胞在PKC激活后生物学效应存在差异。一、材料角质形成细胞和真皮成纤维细胞来自接受包皮环切的青年男子。细胞培养皿、培养板购自Dako公司,培养基购自Gibco公司,PMA购自Sigma公司,四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Serva公司,前列腺素E1(PGE1)购自Ono公司,白介素(IL)-1α、IL-8检测酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒购自晶美公司。cAMP检测药盒购自YamasaShoyu公司。
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针对T315I突变的Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂研究进展
BCR-ABL是一种由bcr基因和c-abl原癌基因融合产生的致癌基因.该基因表达的Bcr-Abl癌蛋白是慢性粒细胞白血病的病理学基础.因此研发选择性的Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂成为治疗慢性粒细胞白血病的一种有效策略.目前已有数个Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂获准上市.然而,Abl激酶结构域的突变或其他原因导致肿瘤耐药性的出现,其中T315I突变是重要的突变之一,引发的耐药性更是难以克服.重点介绍了针对T315I突变的Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂的研究进展.
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抗癌药TovokTM
TovokTM(BIBW-2992)是勃林格殷格翰公司开发的表皮生长因子受体(EGFR)和人表皮生长因子受体2(HER2)酪氨酸激酶的强效、不可逆的双重抑制剂,口服有效.用荷瘤小鼠进行的研究显示,本品对某些肿瘤如鳞状细胞癌A-431、乳腺癌MDA-MB-453、胃癌NCL-N87 及卵巢癌SK-OV-3的生长具有强效持久的抑制作用.
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人血管内皮细胞生长因子受体1酪氨酸激酶的克隆与表达
目的 克隆人血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体1酪氨酸激酶(VEGFR1/Flt-1)基因,构建其表达载体,为其应用研究奠定基础.方法 应用RT-PCR技术,对可溶性血管内皮细胞生长因子受体1(sVEGFR1/sFlt-1)胞外区前四个结构域基因片段进行扩增,亚克隆至pUC18质粒,进行测序后,建立其表达载体,获得重组质粒pSGL-gpp-F,并将其转化至Streptomyces lividans TK24,获得基因工程菌株pSGLgpp-F,对其培养上清液进行SDS-PAGF及Western blot分析.结果 在信号肽gPP的引导下,sFlt-1在S.lividans中获得成功分泌表达,且表达的sFlt-1具有和配基VEGF结合的生物学活性,但在信号肽vis的控制下,未获成功表达.结论 sFlt-1经分离提纯后,可用于与抑制血管生成相关的疾病的研究,而利用重组sFlt-1建立VEGF拮抗剂筛选模型,对于从组合化学库等天然来源的化合物中,提取高通量、大规模药物的筛选提供了可能.
关键词: 血管内皮生长因子受体 基因表达 酪氨酸激酶 克隆 -
ABL酪氨酸激酶及突变体蛋白ABLT315 I的分离纯化及活性鉴定
目的:建立一种简单、稳定、高效分离纯化ABL酪氨酸激酶及其突变体ABLT315I的方法。方法 abl及其定点突变基因插入pET-28a载体后,与pGEX6P-1-ptp-1b共同转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中进行培养,加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导ABL酪氨酸激酶及其突变体的表达,亲和层析和凝胶过滤层析纯化蛋白,SDS-PAGE分析蛋白纯度与相对分子量,BCA法测定蛋白浓度,ATP/NADH偶联法测定蛋白激酶活性。结果 SDS-PAGE显示ABL及ABLT315I蛋白具有很高的纯度,并且其浓度分别达到28 mg/L( LB菌液)和20 mg/L( LB菌液)。2种目的蛋白在体外均测得了很好的酪氨酸激酶活性。结论本研究成功建立了一种稳定、简单高效的ABL蛋白及其突变体的分离纯化方法,为后续蛋白进行高通量药物筛选和结构分析建立良好的基础。
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BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂的研究进展
BCR-ABL融合基因表达出的酪氨酸激酶能引起细胞增殖、黏附和生存性质的改变,导致多种肿瘤的产生.抑制BCR-ABL酪氨酸激酶可有效抑制肿瘤生长.本文介绍了第一、二代以及新近开发的BCR-ABL酪氨酸激酶抑制剂.
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缺血及药物预处理的研究进展
早期研究中,人们对组织器官保护的尝试在钙通道拮抗剂、β-肾上腺素受体阻断剂和氧自由基清除剂方面的结果令人失望.
关键词: 预处理 蛋白激酶C 酪氨酸激酶 有丝分裂活性蛋白激酶 线粒体ATP敏感钾通道 核因子κB