一种简单快速的cDNA文库构建方法

目的:建立一种以LD-PCR(long-distance-PCR)为基础的cDNA文库的快速构建方法.方法:以鲨鱼再生肝组织为材料获得总RNA,用偶联有Oligo(dT)的磁珠纯化mRNA后,利用含BamH Ⅰ酶切位点的Oligo(dT)16引物在逆转录酶M-MLV的作用下合成cDNA第一链,进而利用末端转移酶在合成的cDNA第一链的3′末端引入poly-dC尾;以含BamH Ⅰ酶切位点的Oligo(dT)16和含Hind Ⅲ酶切位点的Oligo(dG)10为引物,利用LD-PCR合成双链cDNA,双链cDNA经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同双酶切的pUC19载体后构建成cDNA文库,对文库的容量、重组率以及多样性进行分析.结果:通过本方法构建的cDNA文库容量约为5.84×105个/μg ds-cDNA,重组率为96.7%;对随机提取的30个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得25个不同的cDNA序列,且未见重复序列.结论:本法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的功能基因分析.

重组水蛭素对实验性白内障的防治作用

目的:观察重组水蛭素(Recombinant hirudin,R-h)对实验性白内障的影响和对眼的刺激性.方法:采用D-半乳糖诱发哺乳期大鼠白内障模型和亚硒酸钠诱发哺乳期大鼠白内障模型进行试验,并用家兔进行眼刺激性试验.结果:R-h能减轻D-半乳糖和亚硒酸钠诱发哺乳期大鼠白内障模型的晶状体浑浊度,升高晶状体超氧化物歧化酶(SOD)活力,降低晶状体丙二醛(MDA)含量,对家兔眼无刺激性.结论:R-h对实验性白内障具有较好的防治作用,对眼无明显局部刺激性.

注射用头孢菌素类抗生素细菌内毒素动态比浊定量法的研究

目的:应用动态比浊定量法研究头孢菌素类抗生素细菌内毒素.方法:通过对样本中定量添加标准内毒素的干扰预试验,将头孢菌素类抗生素制备成5种浓度系列,测得回收率,并筛选出佳检测浓度,后进行3个批号的试验.结果:内毒素的回收率分别为92.48%(头孢曲松钠舒巴坦钠),111.1%(头孢拉啶),99.39%(头孢他啶),73.31%(头孢曲松钠),111.9%(头孢呋辛),109.2%(头孢噻肟钠),133.3%(头孢哌酮钠舒巴坦钠),133.6(头孢硫脒).头孢菌素类抗生素浓度小于等于1 mg/mL的条件下,对动态比浊定量法无干扰作用,可用于有效的日常细菌内毒素检查.结论:动态比浊定量法为头孢菌素类抗生素的细菌内毒素的定量检测提供了一种全新的、高效的方法.

RP-HPLC测定大鼠N,N-双乙酰胱氨酸的血药浓度

目的:建立一种RP-HPLC测定大鼠血浆中N,N-双乙酰胱氨酸的浓度.方法:血浆样品经10%高氯酸沉淀蛋白后,上清液直接进样分析.色谱柱为Lichrospher C18柱(5 μm,150 mm×4.5 mm,ID),流动相为0.025 mol/L磷酸二氢钾(磷酸调节pH至3.0)-甲醇(90∶10,v/v),流速1.0 mL/min,柱温25 ℃,检测波长205 nm.对乙酰氨基酚为内标.测定了大鼠静脉注射N,N-双乙酰胱氨酸40 mg/kg后的血药浓度-时间过程.结果:标准曲线线性范围为1.0～600.0 μg/mL(r＝0.998 8),低检测限为0.2 μg/mL,回收率均大于90%,日内、日间精密度RSD均小于15%.结论:此方法快速、可靠,可用于N,N-双乙酰胱氨酸血药浓度分析及药代动力学研究.

西红花苷对3β,5α,6β-三羟胆甾烷致内皮细胞凋亡和相关基因表达的影响

目的:研究西红花苷(crocin)对3β,5α,6β-三羟胆甾烷(cholestane-3β,5α,6β-triol,Triol)致血管内皮细胞凋亡和相关基因表达的影响.方法:将内皮细胞分成正常对照组、模型组(25 μmol/L Triol)、西红花苷 (10-6 mol/L,10-7mol/L,10-8mol/L)+25 μmol/L Triol组.采用诱导内皮细胞凋亡的模型,用比色法测定丙二醛含量.光学显微镜、电子显微镜观察细胞形态和超微结构的变化,电泳法检测DNA 梯形条带、流式细胞仪分析法检测细胞凋亡率,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测Bcl-2和Bax mRNA表达,免疫细胞化学方法检测Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达.结果:用Triol处理后,培养液中MDA含量增加(P<0.01 vs control),细胞收缩,核浓缩,深染,线粒体肿胀空化,出现凋亡小体、DNA 梯形条带和亚二倍体峰,细胞凋亡率为30.62%,Bax mRNA、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达明显高于正常对照组(P<0.01);Bcl-2 mRNA和蛋白表达低于正常对照组(P<0.01);西红花苷(10-7mol/L、10-6mol/L)+Triol组,MDA含量减少,内皮细胞形态结构完整,细胞凋亡率分别为24.4%、6.3%,细胞Bax和Caspase-3基因表达明显下调,Bcl-2基因表达上调(P<0.05 or P<0.01 vs Triol).结论:西红花苷可能是通过调节Bcl-2,Bax 和Caspase-3基因表达抑制Triol诱导的内皮细胞凋亡.

25-羟维生素D3-1α-羟化酶质粒转染对角质形成细胞增殖分化和凋亡的影响

目的:研究25-羟维生素D3-1α-羟化酶(1α-羟化酶)质粒转染对角质形成细胞增殖、分化和凋亡的影响.方法:体外培养小鼠角质形成细胞(KC)转染1α-羟化酶后,观察细胞在形态上的变化对分化进行研究;利用Giemsa染色法和Tunel荧光素原位末端标记法对凋亡诱导作用进行观察.利用小鼠阴道上皮有丝分裂模型和小鼠尾部鳞片表皮模型对1α-羟化酶质粒转染对KC增殖和分化的影响进行研究.结果:携带1α-羟化酶的质粒转染KC可以非常显著的促进其分化,剂量与效应呈正相关;10-6mol/L的维生素D3和0.015 μg/μL 1α-羟化酶质粒转染联合应用即可诱导KC细胞凋亡.1α-羟化酶质粒转染可以非常显著的抑制小鼠阴道上皮有丝分裂(P<0.01),显著促进小鼠尾部鳞片表皮模型中颗粒层的形成(P<0.05).结论:1α-羟化酶质粒转染角质形成细胞可以明显抑制其增殖,促进其分化,诱导其凋亡.1α-羟化酶质粒转染为以增殖过渡分化不全为特征的皮肤病比如银屑病以及某些肿瘤的基因治疗提供了新思路.

LC-MS测定大鼠脑微血管内皮细胞中卡马西平的含量

目的:建立大鼠脑微血管内皮细胞中卡马西平的LC-MS测定方法.方法:细胞悬液中加入内标盐酸非洛普,高速离心沉淀蛋白,取上清液进行LC-MS测定.色谱柱为Shim-pack ODS C18(5.0 μm,150 mm×2.0 mm ID),离子源为ESI,检测离子为[M+H]+:卡马西平(m/z):237;DDPH(m/z):344,流动相为2 mmol/L醋酸铵缓冲液(pH=4)与乙腈(60∶40,v/v).结果:本实验条件下卡马西平与内标盐酸非洛普可良好分离,保留时间分别为5.0 min和3.6 min左右;线性范围为0.39～50.00 ng/mL;方法回收率为96%～104%;日内日间变异系数均小于13%;低检测浓度为0.39 ng/mL.结论:该方法符合生物样品测定要求,可用于细胞内卡马西平浓度的测定.

3'R,4'R-二取代角型吡喃香豆素的不对称合成

目的:寻找具有钙离子拮抗作用和乙酰胆碱酯酶抑制活性双重作用机制的早老性痴呆(Alzheimer′s Disease,AD)新型抑制剂.方法:间二苯酚为底物,AD-mix-β作不对称双羟基化试剂进行凯林内酯类香豆素的全合成;所有产物进行乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制活性测试.结论:立体选择性地合成cis-3′R,4′R-二取代角型二氢吡喃香豆素,但AchE 抑制活性明显低于cis-3′R,4′R-二取代线型二氢吡喃香豆素.

肠内营养制剂对短肠综合征大鼠血清游离脂肪酸代谢的影响

目的:观察短肠综合征(SBS)大鼠血清游离脂肪酸水平的变化,评价长链甘油三酯(LCT)和长链甘油三酯加中链甘油三酯(MCT/LCT,1∶1)肠内营养制剂对大鼠血清游离脂肪酸水平的影响.方法:SD大鼠随机分为3组(每组7只):假手术对照组,进行小肠离断再吻合并给予LCT营养支持;85%肠切除组,进行LCT营养支持;85%肠切除组,MCT/LCT营养支持.14 d后取血清用气相色谱法测定大鼠血清游离脂肪酸水平.结果:SBS大鼠血清中总游离脂肪酸水平以及各游离脂肪酸水平明显低于对照组,大多差别具有显著意义.添加MCT的肠内营养大鼠其血清游离脂肪酸水平明显高于仅给予LCT 脂肪乳剂的大鼠.结论:添加50%MCT的MCT/LCT肠内营养制剂较单纯LCT肠内营养制剂能增加SBS大鼠对脂肪的吸收功能,增加血清游离脂肪酸水平,而不影响肠道代偿能力.

连钱草中的黄酮类化学成分

目的:对连钱草全草进行化学成分研究.方法:采用工业酒精提取、硅胶柱层析、ODS柱层析和重结晶等方法.结果:从连钱草全草中分离并鉴定了10个黄酮类化合物,其结构分别为:芹菜素(1)、木犀草素(2)、芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸乙酯苷(3)、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸乙酯苷(4)、大波斯菊苷(5)、木犀草素-7-O-葡萄糖苷(6)、山奈酚-3-O-芸香糖苷(7)、芦丁(8)、6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖-芹菜素(9)和6-C-葡萄糖-8-C-葡萄糖-芹菜素(10).结论:化合物1～10均为首次从该植物中分离得到.

仙人掌的化学成分研究

目的:研究仙人掌的化学成分.方法:采用多种层析手段进行分离纯化,应用多种波谱技术,结合文献对照,对分离得到的化合物进行结构鉴定.结果:从仙人掌肉质茎的乙醇提取物中分离出6个化合物,其结构分别鉴定为3,4-二羟基苯甲酸乙酯 (1),3,4-二羟基苯甲酸 (2),槲皮素-3-O-甲基-7-O-β-D-葡萄糖苷 (3),山奈酚7-O-β-D-葡萄糖苷 (4),manghaslin (5)和山奈酚7-O-β-D-葡萄糖基 (1→4)-β-D-葡萄糖苷(6).结论:化合物6为新化合物,化合物1～5均为首次从本属植物中分离得到.

死亡素在裂殖酵母中的表达

目的:在裂殖酵母中表达死亡素.方法:通过PCR方法人工合成死亡素基因,构建重组表达载体pRHZ-41-Tha,转化到裂殖酵母中,杯碟法检验表达产物活性.结果:重组载体构建成功并且转化到酵母中,外源基因在转化子中得到了表达,表达产物具有抑菌活性.结论:本研究成功构建了具有抑菌活性的表达产物,为进一步将死亡素研制成添加剂和药物奠定了一定的基础.

原代肝细胞体外培养用于利福平和异烟肼肝毒性的研究

目的:研究利福平(rifampicin,LFP)和异烟肼(isoniazid,INH)对体外大鼠肝细胞的毒性.方法:以乳酸脱氢酶(LDH)释放量反映肝细胞损伤,以尿素分泌量和大鼠白蛋白合成量反映肝功能.结果与结论:15 mg/mL异烟肼(5 mL)、10 mg/mL利福平(5 mL)以及相同剂量两药合用时LDH释放量分别为对照组的1.3倍、1.5倍和1.6倍,产生的白蛋白量分别为不加药时的25%、28%和28%,尿素产量也有相应下降但程度不如白蛋白显著.说明该剂量的利福平和异烟肼对大鼠肝细胞均有毒性作用,但两药合用并不增加毒性.进一步将此原代肝细胞模型与连续细胞系小鼠成纤维细胞株L929、与文献报道的动物模型比较,探索原代肝细胞模型在肝毒性研究中应用的可行性.

粉防己碱静脉注射乳剂的制备及对实验性肺纤维化的治疗作用

目的:优化处方工艺,制备稳定的粉防己碱静脉注射脂肪乳剂(Tet-EM),并探讨此剂型改进的合理性.方法:正交设计优化乳剂的处方和制备工艺,考察4 ℃、室温条件下乳剂贮放稳定性,比较Tet乳剂和注射剂抗大鼠实验性肺纤维化的药效及不良反应.结果:乳剂平均粒径约200 nm,Zeta电位-50 mV,115 ℃灭菌 30 min.4 ℃、室温贮放90 d稳定;Tet-EM抗肺纤维化疗效优于注射剂,不良反应降低.结论:制备乳剂的粒径、粒径分布及稳定性较理想,用于治疗大鼠实验性肺纤维化有减毒增效的作用.

新型两亲性N-辛基-N-PEG化壳聚糖衍生物的合成与表征

目的:制备新型的两亲性N-辛基-N-PEG化壳聚糖衍生物.方法:以天然聚合物壳聚糖为原料,其2-NH 2与辛醛形成Schiff′s碱,用KBH4还原得到N-辛基壳聚糖,然后在其剩余2-NH2与MeO-PEG-CHO 反应,再用KBH4还原制备了N-辛基-N-PEG化壳聚糖衍生物,结构经FTIR、13C NMR、1H NMR得到了表征.用DSC实验对其物理性质进行了分析.结果与结论:制得了新型的辛基、PEG取代度分别为36,64%的两亲性N-辛基-N-PEG化壳聚糖衍生物,有望作为难溶性药物增溶的载体.

一种缺失核定位信号区的hbFGF的表达及纯化

目的:为了研究缺失核定位信号区的人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)独特的转运机制,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达和纯化了缺失核定位信号区的hbFGF.方法:将PCR扩增得到的hbFGF cDNA片断克隆到表达载体pET3c中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过离子交换和肝素亲和层析从菌体上清中纯化目标蛋白,MTT法检测促分裂活性.结果:hbFGF的表达量约为全菌体蛋白的20%,纯化的缺失核定位信号区的hbFGF的促分裂活性与缺失核定位信号区的hbFGF标准品相当.结论:BL21(DE3)/pET3c表达系统能高效表达缺失核定位信号区的hbFGF,纯化得到的hbFGF可用于进一步的研究.

NF-κB p50蛋白的原核表达及纯化

目的:提供p50研究所需大量纯蛋白.方法:将编码p50 N端39-376aa肽段的cDNA片段插入到pET-32a (+)载体的BamH Ⅰ和Nco Ⅰ酶切位点之间,构建了p50蛋白原核表达载体(pET-p50),用IPTG诱导表达,His-Bind柱进行纯化.结果:原核表达载体(pET-p50)30 ℃,0.1 mmol/LIPTG诱导5 h,重组蛋白大量表达,经凝胶迁移滞后实验证明纯化的重组p50蛋白具有序列特异性DNA结合活性.结论:在优化条件下,通过His-Bind柱亲和层析法可以获得大量重组蛋白,并通过凝胶迁移滞后实验证明其具有较高的活性.

量子点荧光猝灭法测定中药饮片中的微量铜

目的:运用一种新型的半导体纳米材料的发光性质测定中药饮片中的微量铜.方法:将硫化锌包被的硒化镉核壳量子点(CdSe/ZnS QDs)表面用牛血清白蛋白(BSA)进行修饰.利用QDs-BSA作为发光探针,在pH 7.4的缓冲溶液中Cu2+能使其发生荧光猝灭从而测定铜的含量.结果:Cu2+浓度在6.0×10-4～6.0×10-3μg/mL范围内有良好的线性关系(r＝0.998 9),检测限为1.0×10-4 μg/mL,加样回收率为93.6%～108.0%.结论:此方法适用于中药饮片中的微量铜的测定.

原子吸收光谱法测定丝裂霉素C-磁性纳米球中Fe3O4在小鼠体内的分布

目的:采用原子吸收光谱法测定丝裂霉素C-磁性纳米球中Fe3O4在小鼠体内的分布.方法:用浓HNO3-H2O2微波消化处理样品,乙炔-空气火焰原子吸收法.结果:小鼠的心、肝、脾、肺、肾中低、中、高3种浓度加样回收率为98.80%～100.41%,日内精密度RSD均小于3%,日间精密度RSD均小于5 %.经尾静脉给药后磁性纳米球主要被肝脏摄取;而在外加磁场的作用下磁性纳米球对肝脏的靶向率有明显的提高,至给药后60 min是不施加磁场组的两倍.结论:提供了一种测定磁性靶向制剂中的磁性成分在体内分布的方法.

盐酸哌仑西平在水溶液中的降解动力学

目的:研究盐酸哌仑西平(pirenzepine hydrochloride,PRZ)在水溶液中的降解动力学.方法:采用经典恒温法进行试验,通过高效液相色谱法(HPLC法)检测PRZ的浓度.结果:PRZ在水溶液中的水解为伪一级动力学反应,同时受H+和OH-催化,酸催化速率常数(K1)为0.595 h-1*mol-1*L,碱催化速率常数(K2)为4.67×103 h-1*mol-1*L,K2是K1的7 849倍,表明PRZ在水溶液中主要受OH-催化水解.PRZ在水溶液中的稳定pH(pHm)为5.1.PRZ在pH 1.1、pH 5.1、pH 7.0和pH 10.0(I=0.3)的水解反应活化能(Ea)分别是72.83、105.10、74.33和71.67(KJ/mol),在室温(25 ℃)下的有效期(t0.9)分别为13.1,783.6,58.2和0.7 d;在pH 1.1的水溶液中PRZ表观水解速率常数随离子强度(I)的增加而增大;相反,在pH 7.9的水溶液中,PRZ表观水解速率常数随离子强度增加而降低.结论:PRZ在强酸和强碱条件下均不稳定,若制成液体制剂可调pH为5.1左右.

蛋白质天然构象预测的研究进展

继人类基因组计划完成后,如何弄清相应的基因序列的功能及其之间的关系,即比较彻底地解开生命的奥秘成为后基因组计划的主要任务.基因的功能终主要通过蛋白质来完成,因此,如何根据已知的氨基酸序列来预测相应的蛋白质天然构象成为后基因组计划中重要的组成部分之一,这为比较彻底界定其功能奠定分子生物学基础.本文从以下几个方面进行了详细地介绍:(1)组成蛋白质天然构象预测方法的基本元素即序列比对方法、构象空间搜索方法及有关的蛋白质数据库;(2)结构预测方法的评估与分类;(3)描述预测性能较好及有比较发展前景的预测方法;(4)天然构象预测的前景等.

药物稳定性实验方案设计研究的国际化规范

综述了药物稳定性实验的国际化规范要求,着重探讨了全球化和国际协调化的进展和稳定性研究中可能遇到的问题,以供从事药物产品全球化的药物研究者,药物厂商和药政管理人员参考.

2004年世界新药

新技术