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耳聋生物治疗现状与挑战
众所周知,由于毛细胞缺失造成的感音神经性耳聋在目前仍然是不可治愈的.虽然现在临床上有助听器、人工耳蜗、振动声桥等听觉补偿手段可以帮助患者改善听力,但其效果毕竟不能完全令人满意,而且助听设备不能作为根治性方法,人们仍然希望能够有一种方法能够使耳聋患者恢复接近正常的听力.生物治疗是未来很有希望根治耳聋的治疗方法.耳聋的生物治疗包括干细胞治疗、分子治疗和基因治疗.这些治疗策略的主要是通过诱导内耳毛细胞和/或支持细胞、螺旋神经节细胞的再生,恢复内耳柯蒂氏器的精细的三维细胞结构,并在新牛的内耳毛细胞与螺旋神经节神经元末梢之间建立有功能的突触联系,从而进一步恢复内耳的声电转换功能,并恢复患者的听力.近10年来本课题组在药物性耳聋、噪声性耳聋和遗传性耳聋动物模型的建立和治疗方面的研究得到一些新进展[1-14],部分涵盖本专刊之中,而且本文也将对目前国内外已经报道的一些研究进行总体概述,今后需要更大的突破,以期更快推进耳聋生物治疗研究向临床转化,有望成为转化医学的又一个典范.
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听觉生理学研究的进展及未来（一）
耳蜗疾病响度重振现象的神经生物学机制
听觉生理学研究听觉系统在感受外界声音刺激过程中所产生的复杂的神经生物学和心理学过程。在生理情况下，耳蜗是连接有声世界和中枢认知的一道门户，它把声信号的物理刺激，转变成听神经上的电信号。当遇到噪声、药物等对听觉有害的情况时，耳蜗又是首先受损的器官并导致耳聋。因此，系统研究耳蜗生理学，探讨耳蜗对声的感受及其调控的神经生物机制，是对耳聋进行研究必须首先考虑的重要课题。解放军耳鼻咽喉研究所听觉生理实验室在连续的几项国家自然科学基金项目的资助下，对耳蜗响度重振现象的发生机制、耳蜗传入和传出通路的调节、耳蜗支持细胞的生物学特性等方面进行了系统的研究，本文总结了我所35年来在听觉生理学研究方面的进展、临床应用以及对未来的展望。 -
内耳Connexin缝隙连接的功能与耳聋机理
缝隙连接对于维持正常听觉功能有着重要的作用,编码组成缝隙连接蛋白的Connexin基因突变可引起严重的听力损失,占整个新生儿耳聋病例的70～80 %.此类基因病理变化仅发生于耳蜗内,虽听觉毛细胞上并无缝隙连接或Connexin基因表达,但其支持细胞借助于缝隙连接的耦合作用在内耳联结成一个特殊的网络.本文总结了近年来内耳缝隙连接生物物理学特性方面的研究进展,阐述了耳蜗缝隙连接对于听觉功能的重要性;同时也展望了阐明其功能对治疗因Connexin基因突变所致的遗传性耳聋的前景.
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邻苯二甲酸酯类对大鼠睾丸支持细胞毒性作用
目的探讨大鼠睾丸支持细胞间紧密连接结构能否作为邻苯二甲酸酯类(PAE)毒性作用效应的标志物.方法建立大鼠睾丸支持细胞原代双室培养模型,通过光镜、跨上皮电阻测定及免疫荧光定位方法研究PAE对大鼠支持细胞及支持细胞间紧密连接结构的影响.结果PAE染毒后,支持细胞单层破坏、细胞间的嵴线消失、跨上皮电阻值下降、紧密连接相关蛋白ZO-1、F-肌动蛋白和闭锁蛋白表达降低;600 μmol*L-1浓度下,单乙基己基邻苯二甲酸酯(MEHP)对睾丸支持细胞的毒性大于单丁基邻苯二甲酸酯(MBP).结论MEHP和MBP可破坏睾丸支持细胞间的紧密连接结构,跨上皮电阻值可作为PAE睾丸毒作用敏感的效应标志物.
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五子衍宗丸提高大鼠睾丸支持细胞抵抗热应激能力的基因表达谱分析
目的 采用全基因组表达谱芯片数据分析五子衍宗丸提高大鼠睾丸支持细胞抵抗热应激能力的作用机制.方法 将原代培养的睾丸支持细胞分为五子衍宗丸组、正常组和模型组,分别给予五子衍宗丸溶液和等体积的PBS,培养24 h后,五子衍宗丸组和模型组给予43 ℃水浴15 min,正常组给予37 ℃水浴15 min处理. 分别提取3组细胞总RNA,通过基因芯片技术进行数据分析.结果 在支持细胞全基因组表达谱中,五子衍宗丸组与模型组比较共有1 203个差异表达基因,其中下调基因有697个,上调基因506个;正常组与模型组比较共有473个差异表达基因,其中上调基因168个,下调基因305个;与模型组相比,五子衍宗丸组和正常组共同下调的基因中RGD1305298、Trpt1、Dll3、Abi3和Ppp1r12b共5个基因表达差异明显,共同上调的基因中Dusp7表达差异明显,这些差异表达基因涉及到细胞周期、细胞凋亡、细胞代谢、细胞黏附等分子功能及Notch信号通路、细胞骨架调节、MAPK信号通路和紧密连接等通路.结论 五子衍宗丸可能是通过维持支持细胞间紧密连接,抑制支持细胞凋亡,促进支持细胞分化成熟来提高睾丸支持细胞热应激的能力.
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五子衍宗丸对幼年大鼠睾丸支持细胞增殖的影响及机制
目的 探讨五子衍宗丸对幼年大鼠睾丸支持细胞的增殖作用及其机制.方法 分离并培养20 d龄SD雄性大鼠的睾丸支持细胞,将支持细胞随机分为正常组和五子衍宗丸低、中、高剂量(5、10、15 g/L)组.采用MTT比色法检测各组支持细胞OD值的变化,采用免疫组化的方法检测各组支持细胞中Ki67阳性颗粒的表达,采用Western Blot方法检测各组支持细胞中Akt和p-Akt的表达.结果 与正常组相比,经五子衍宗丸处理后的睾丸支持细胞增殖能力明显增加(P ＜0.05或P＜0.01);Ki67阳性颗粒的表达明显增多(P＜0.05或P＜0.01);p-Akt的相对表达量明显增加(P＜0.05或P＜0.01).结论 五子衍宗丸可能通过激活Akt信号通路,上调p-Akt的表达,促进幼年睾丸支持细胞的增殖.
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五子衍宗丸含药血清对大鼠睾丸支持细胞活力的影响
目的 观察五子衍宗丸含药血清对大鼠睾丸支持细胞活力的影响.方法 培养大鼠睾丸原代支持细胞,制备高、低剂量五子衍宗丸含药血清,高、低剂量组合药血清又进一步分为20％、10％、5％和空白血清4个中药血清浓度培养基,并将不同浓度五子衍宗丸含药血清分别和大鼠睾丸原代支持细胞共同培养,选取6、12、24、48、72 h5个时间点,MTr法观察在不同时间点时五子衍宗丸对支持细胞活力的影响.结果 培养6、12、24、48、72 h后,随着时间的增加,20％及10％浓度血清组细胞活力亦随之增加,在24 h达到高值,然后细胞活力随着培养时间的增加逐渐下降.结论 五子衍宗丸含药血清对支持细胞的活力有一定的促进作用,且在高剂量组20％浓度血清培养基和支持细胞共培养24 h后,支持细胞活力高.
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睾丸支持细胞功能的研究进展
支持细胞位于睾丸曲细精管内皮,作为与生精细胞接触的惟一体细胞,在生精过程中起着至关重要的调控作用.支持细胞在精子发生过程中可为精子细胞提供结构支持；他分泌的各种蛋白质参与精子发生所需物质的转运；同时支持细胞表达一些膜蛋白,促进局部免疫豁免形成,为精子发生提供有利的微环境；再者,支持细胞通过发挥粘附与吞噬作用,清除精子发生中凋亡的精子细胞.随着研究的深入,近年来对支持细胞又有了新的认识.
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恒河猴睾丸支持细胞对间质细胞分泌睾酮的研究
目的 研究恒河猴睾丸支持细胞对间质细胞分泌睾酮的调节作用.方法 采用无血清培养的方法,分析了促性腺激素释放激素(GnRH)、卵泡刺激素(FSH)、表皮生长因子(EGF)、内皮素-1(ET-1)和白细胞介素-1(IL-1)对原代共培养恒河猴睾丸支持细胞与间质细胞睾酮分泌水平的影响.结果 GnRH、FSH、EGF和ET -1对原代共培养恒河猴睾丸支持细胞与间质细胞睾酮分泌水平具有促进作用,并且这种影响与共培养的支持细胞数量呈线性关系,即共培养的支持细胞数量增加,睾酮分泌水平亦明显上升；而IL-1对原代共培养恒河猴睾丸支持细胞与间质细胞睾酮分泌水平没有产生影响.结论 支持细胞对间质细胞分泌睾酮具有重要的调节作用.
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血睾屏障在精子发生中的作用
血睾屏障(blood-testis barrier,BTB)广泛存在于哺乳动物的睾丸组织中,支持细胞是曲细精管中与生精细胞相接触的唯一体细胞,其参与形成血睾屏障,可分泌多种生精细胞分化成熟所需的物质.BTB的动态开合可调控精子发生所需的营养物质、重要分子以及危害精子发生的有害毒物进入减数分裂期和分裂后期生殖细胞形态变化的近腔室,为哺乳动物的精子发生提供一个适宜的微环境.BTB还可赋予生精上皮细胞极性,参与生精细胞迁移,为生精细胞的迁移提供导向,保证了生精细胞在曲细精管内迁移方向的正确性,同时还能阻止自身对精子抗原产生的自体免疫反应.因而血睾屏障对于精子发生具有极为重要的作用,本文就血睾屏障在精子发生中的作用及机制做一综述,为今后从血睾屏障方面调控男性不育的预防及控制提供线索.
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脑缺血性疾病中星形胶质细胞保护机制研究
星形胶质细胞是中枢神经系统中数量多的细胞,也是强大的支持细胞.它在维持内环境的稳定,血脑屏障的形成和神经兴奋传递等方面有重要作用.
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维甲酸在内耳发育中的作用及其机制
感音神经性耳聋患者在临床上多见,约占总人口的10％.主要是因为衰老、噪声、耳毒性药物、外伤、感染、肿瘤、遗传、免疫等体内外因素所致,且哺乳动物耳蜗毛细胞破坏后再生能力有限,常引起不可逆性的听力下降,治疗困难.随着内耳发育机制研究的深入和干细胞组织工程技术的逐渐成熟,科学家们发现许多因子,如EGF、FGF、TGF-α、甲状腺素等在内耳毛细胞、支持细胞的分化、成熟、再生中起作用,试图通过加入这些活性因子促进毛细胞再生,或诱导干细胞分化为毛细胞来治疗感音神经性耳聋.
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睾丸支持细胞与间质细胞的相互作用
睾丸中主要包括3种细胞,支持细胞与间质细胞及生精细胞.生精细胞与生精有关;间质细胞分泌雄激素;而支持细胞主要维持睾丸曲细精管的结构、维持血睾屏障的完整性、维护睾丸组织天然免疫豁免的功能以及对生精细胞及间质细胞功能的调控,因此间质细胞与支持细胞为组织工程睾丸组织构建的潜在种子细胞.本文就间质细胞及支持细胞之间的相互作用、调控予以综述.
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精液白细胞与不育症之间的关系研究
目的:探讨精液白细胞的检出率与不育症之间关系,以提供临床参考.方法:回顾性分析我院2008 年2 月~2011 年2 月收治的180 例男性不育症患者临床资料,选取我院同期正常生育的男性健康体检者180 例作为对照组,取其精液采用瑞-姬染色,油镜进行白细胞及其他细胞形态分类,分析精液白细胞异常患者、精液白细胞正常患者、对照组等精液动态指标并进行统计处理.结果:精液白细胞异常组患者精液液化异常、精液黏稠度、精液pH 值、精子凋亡率、解脲支原体及沙眼支原体感染阳性率均高于正常生育组和精液白细胞正常组,而精液量、精子密度、精子活率、精子活力等方面均低于正常生育组和精液白细胞正常组(P<0.05 或P<0.01).精液白细胞异常组精液运动参数明显低于精液白细胞正常组,两组比较差异有高度统计学意义(P<0.01).结论:精液白细胞影响精液质量造成不育症.
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Cox7a2在小鼠睾丸支持细胞中的表达及定位
不育症的发病机制与支持细胞功能障碍有关,但是否与线粒体有关至今仍不清楚.本研究通过原代细胞培养以及荧光共定位技术,观察小鼠睾丸支持细胞中Cox7a2的表达与定位.通过纯化的支持细胞,在荧光显微镜下观察到了线粒体中Cox7a2的表达.从而为探讨支持细胞线粒体功能障碍的研究打下了基础.
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成体神经干细胞巢
对于成年哺乳动物来说,只有神经发生区域:室下区(subventricular zone, SVZ)和海马齿状回的颗粒下层(subgranular zone, SGZ)的神经干细胞,可以在体内向神经元分化,而其他区域的神经干细胞在体内只能分化为神经胶质细胞[1].但将神经发生区域的干细胞移植到非神经发生区域,则只能分化为胶质细胞;而非神经发生区域的干细胞移植到神经发生区域后,就能向神经元分化;这无疑会使我们想到体内环境存在某种调节神经干细胞分化的机制.目前对神经干细胞生物学特性影响因素的研究多集中在某些单个因子的领域,这些研究虽可以反映某些因子的作用途径,但尚无法全面了解神经干细胞在体内复杂环境下的生物学特性.神经干细胞巢(neural stem cell niche)的发现,为我们全面了解神经干细胞的生物学特性提供了切入点.神经干细胞巢是指能对神经干细胞产生影响的周围结构,主要包括附近的支持细胞、胞外基质和微血管网等.而神经干细胞巢对神经干细胞生物学特性的影响是通过复杂的微环境信号传导来调控的,因此这种巢穴的概念更多地被认为是生物化学概念而非解剖概念[2].
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3例异位嗜铬细胞瘤超声对照临床病例分析
嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma,PHEO)是起源于肾上腺髓质或肾上腺外副神经节嗜铬细胞的肿瘤,主要分泌儿茶酚胺[1].大多数位于肾上腺,异位PHEO相对于肾上腺PHEO很少见,主要发生在腹膜后中线旁沿交感神经链分布的区域[2].2008年～2013年我院共收治了3例,现报告如下.病例1患者女性,36岁,出现阵发性头晕、心悸20余日,2008年1月来我院就诊.血压正常,126mmHg/70mmHg.门诊行超声检查发现左侧肾门处6cm ×5cm的实性低回声,边界清,包膜完整,内部回声欠均匀,周边可见彩色血流信号(见图1A,封底).为进一步治疗收入院手术.术中可见肿物分别位于右侧后腹膜(右肾下极及下腔静脉之间)及左侧肾门位置(左肾与腹主动脉之间).术后病理诊断:PHEO,免疫组化显示CgA(+),Syn(+),支持细胞S-100(+).
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支持细胞骨架与血睾屏障的研究进展
血睾屏障(BTB)对精子的发生、穿越及排放有特殊的调控机制.支持细胞骨架成分与BTB有极其密切的关系.支持细胞骨架成分如微丝、微管、中间丝等及其所表达的肌动蛋白、微管蛋白、Claudins、波形蛋白、4.1蛋白家族等多种蛋白,可通过支持、黏附、信号转导和基因位点表达等对BTB的结构和功能起维持和促进作用.着重对支持细胞骨架成分所表达的各种蛋白与BTB的结构和功能的关系做进展性综述.
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双酚A对大鼠睾丸支持细胞P38丝裂原活化蛋白激酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3表达的影响
目的 研究双酚A (bisphenol A,BPA)对离体培养青春前期大鼠睾丸支持细胞P38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)及相关凋亡基因表达的影响.方法 将睾丸支持细胞分别暴露于0(溶剂对照)、30、50、70 μmol/L的BPA.采用MTT法检测离体培养细胞活力,采用RT-PCR的方法检测p38 MAPK、caspase-3、FasL、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α) mRNA的相对表达情况,采用western-blotting的方法检测细胞中P38 MAPK、磷酸化P38 MAPK和caspase-3酶原蛋白的表达情况.结果 与溶剂对照组相比,30 μmol/L BPA组支持细胞p38 MAPK mRNA的相对表达量升高,而50 μmol/L BPA组p38 MAPK的表达明显降低(P＜0.05)；各浓度BPA染毒组caspase-3mRNA的相对表达量均较高(P＜0.05)；仅50 μmol/L BPA组TNF-α mRNA的相对表达量增加(P＜0.05)；50、70 μmol/LBPA组FasL mRNA的相对表达量增加(P＜0.05)；各剂量BPA染毒组总P38MAPK蛋白的相对表达量无显著变化；50和70 μmol/LBPA组磷酸化P38 MAPK蛋白的相对表达量均明显升高(P＜0.05)；仅70 μmol/L BPA组caspase-3酶原蛋白的相对表达量下降(P＜0.05).结论 BPA可激活离体培养青春前期大鼠睾丸支持细胞p38 MAPK,并诱发caspase-3活化,导致细胞凋亡,这可能是通过FasL凋亡途径介导的.
关键词： 双酚A 支持细胞 细胞凋亡 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 -
p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路在多菌灵致小鼠睾丸支持细胞增殖抑制和凋亡中的作用
目的 通过建立多菌灵致小鼠睾丸支持细胞(TM4)损伤模型,探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在多菌灵致小鼠TM4细胞增殖抑制和凋亡中的作用.方法 将TM4细胞分别暴露于0(对照)、1、2、5、10、20 μmol/L多菌灵溶液和10μmol/L SB203580抑制剂溶液及10 μmol/L SB203580+5 μmol/L多菌灵溶液染毒48h,采用CCK-8法检测细胞存活率.将TM4细胞分别暴露于O(对照)、5 μmol/L多菌灵溶液和10 μmol/L SB203580抑制剂溶液及10 μmol/LSB203580+5μmol/L多菌灵溶液染毒48 h,采用碘化丙啶(PI)染色法检测细胞周期,采用Annexin V/PI双标法检测TM4细胞凋亡,采用Western blot法检测细胞P38 MAPK和p-P38 MAPK蛋白的表达水平.结果 与对照组比较,5、10、20μmol/L多菌灵组TM4细胞的存活率均下降,差异有统计学意义(P＜0.01);且随着多菌灵暴露浓度的升高,TM4细胞的存活率呈下降趋势.与5 μmol/L多菌灵组比较,10 μmol/L SB203580+5 μmol/L多菌灵组TM4细胞的存活率升高,差异有统计学意义(P＜0.01);而10 μmol/L SB203580抑制剂组TM4细胞的存活率无明显改变.与对照组相比,5μmol/L多菌灵组TM4细胞的凋亡率增加,差异有统计学意义(P＜0.01);而10 μmol/L SB203580抑制剂组的凋亡率无明显改变.与5 μmol/L多菌灵组比较,10 μmol/L SB203580+5 μmol/L多菌灵组TM4细胞的凋亡率下降,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组比较,5 μmol/L多菌灵组TM4细胞G1/Go期细胞所占比例降低,而G2/M期和S期细胞所占比例升高,差异均有统计学意义(P＜0.01);而10 μmol/L SB203580抑制剂组各期细胞所占比例均无明显改变.与5μmol/L多菌灵组比较,10 μmol/LSB203580+5 μmol/L多菌灵组TM4细胞仅G2/M期细胞所占比例下降,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组比较,5μmol/L多菌灵组TM4细胞的p-P38 MAPK蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P＜0.01);而10 μmol/L SB203580抑制剂组的p-P38 MAPK蛋白表达水平无明显改变.与5μmol/L多菌灵组比较,10 μmol/L SB203580+5 μmol/L多菌灵组TM4细胞的p-P38 MAPK蛋白表达水平下降,差异有统计学意义(P＜0.01).各组TM4细胞的P38 MAPK蛋白表达水平间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 多菌灵通过激活p38 MAPK信号通路抑制TM4细胞增殖,并诱导细胞凋亡及周期阻滞,从而造成细胞损伤.
