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微囊藻毒素-LR对睾丸支持细胞活性及凋亡基因表达的影响
[目的]研究微囊藻毒素-LR对睾丸支持细胞活性的影响及其对细胞凋亡相关基因表达的影响. [方法]分离纯化大鼠睾丸支持细胞,用低剂量(0～500×10-3 μg/ml)和高剂量(1～20 μg/ml)微囊藻度素-LR染毒细胞,细胞培养24 h、48 h和72 h后,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验和中性红吸收(NR)实验检测微囊藻毒素-LR对支持细胞活性的影响；将纯化后的部分睾丸支持细胞接种于6孔板中,给予不同剂量的微囊藻毒素-LR (0,1,10μg/ml),于24h和48 h后提取细胞总RNA,RT-PCR方法检测细胞中凋亡相关基因P53、bax和bcl-2表达水平.[结果]低剂量(0～500×10-3 μg/ml)微囊藻毒素-LR作用于支持细胞24、48、72 h,细胞活性增强.高剂量微囊藻毒素-LR(10和20μg/ml)作用24、48 h,细胞活性显著降低.时闻效应实验结果显示随着暴露时间的延长细胞活性降低.细胞暴露于1 μg/ml微囊藻毒素-LR后与对照组细胞相比较P53和bcl-2 mRNA水平相对表达量增加,bax表达量降低.暴露予10 μg/ml微囊藻毒素-LR后P53和bax mRNA水平相对表达增加,bcl-2表达降低.[结论]低剂量的微囊藻毒素-LR对 细胞具有兴奋效应,随着剂量的增高及暴露时间的延长微囊藻毒素-LR能够明显抑制细胞活性.同时微囊藻毒素-LR可通过P53、bax和bcl-2基因的表达影响睾丸支持细胞的凋亡.
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小鼠睾丸支持细胞的体外分离和纯化
目的寻求简便经济的方法分离纯化小鼠睾丸支持细胞,提高其获取量.方法用0.1%的胶原酶和0.25%的胰蛋白酶次第消化准备7-8天小鼠生殖细胞悬液,置于37℃,5%CO2孵箱内培养,4小时后换液,24小时后向培养板内加入20 mmol Tris-HCl低渗处理3分钟,去除精原细胞,即得到高纯度的支持细胞.结果在小鼠睾丸支持细胞的分离培养中,支持细胞占培养细胞90%以上.结论应用本实验方法分离小鼠睾丸支持细胞获得成功并简化了国内现行的分离方法.
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兔实验性隐睾术后三个月 A型精原细胞数量严重减少
目的:关于隐睾是否会导致不可逆的精子发生的损害,人们还有争论.本文拟通过研究兔实验性隐睾术后三个月是否伴有A型精原细胞(精子发生的干细胞)的数量的变化,来间接说明隐睾对精子发生的损害是否可逆.材料与方法:6只青春期兔作单侧隐睾术,将睾丸和隐睾一起放回腹腔.三个月后从腹腔及阴囊取出两侧睾丸及附睾作形态定量分析.运用25μm厚甲基丙烯酸树脂切片及无偏、有效的体视学新工具--光学体视框来测量生精细胞(核)数,利用其它体视学方法来估计生精小管的直径和长度等.结果:腹腔内睾丸精子发生严重障碍,生精上皮内只见A型精原细胞和支持细胞,附睾内无精子;生精小管长度只有对照侧的42+/-5%(平均值+/-标准误);支持细胞数无改变;精原细胞总数和A型精原细胞数分别减少了95+/-5%和84+/-3%.以往在人类和鼠类动物促性腺激撤退模型中均未见生精小管长度减少的变化.结论:青春期兔实验性隐睾三个月导致了精子发生的严重损害;由于A型精原细胞的严重减少,这种损害即使能恢复(通过睾丸复位固定术等),也将不理想.
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豚鼠耳蜗内Corti氏器NOS免疫组织化学研究的体会
内耳骨迷路埋藏在颞骨岩部内,对内耳的免疫组化研究技术关键在于脱钙, 既要制作出完整的耳蜗切片,又要保存抗原.特别是一氧化氮合酶(NOS)本身是一种蛋白质,更容易受温度和酸度的影响.本实验选用中性脱钙剂对内耳进行脱钙,改良石蜡包埋法进行石蜡包埋切片,取得了良好效果.现介绍如下:1.实验材料与方法:(1)取豚鼠10 只,快速断颈处死,沿外耳颞侧暴露出内耳,取出螺旋器,先从蜗底以5号针刺一小孔,再吸取适量的4%多聚甲醛固定液(用pH7.4的0.1M PB配制)自蜗顶注入膜蜗管内,将螺旋器放入4%多聚甲醛固定液内继续固定1w.(2)0.01M PBS(pH7 .4)洗三次,每次30分钟.(3)7%EDTA脱钙液(用0.1M PB配制,每100 ml溶液内加3ml甘油)4℃脱钙3～5w.(4)0.01M PBS(pH7.4)洗7 次,每次15min.(5)30%;40%;50%;60%;70%80%;90%; 95%;100%1;100%11梯度酒精4℃冰箱内脱水,每级15min.(6)苯透明5min.(7)1∶1苯蜡37℃温箱内30min.(8)熔点55℃软蜡30m in.(9)熔点60℃硬蜡150min.(10)熔点62℃硬蜡包埋.(11)电镜超薄切片机进行石蜡切片厚4μm.(12)常规SP法进行免疫组织化学染色.0.1% 胰酶37℃消化30min,一抗NOS2兔抗鼠多克隆抗体(1∶100)4℃冰箱过夜,二抗羊抗兔(1∶200)37℃30min,复合物37℃ 30min,DAB显色液显色.结果与讨论:上述实验过程制成的石蜡切片结构完整,膜半规管、壶腹嵴、前庭膜、基底膜、螺旋器、盖膜等清晰完整.Corti氏器阳性细胞的胞浆内呈棕黄色,内毛细胞、外毛细胞、内柱及外柱细胞阳性、周围支持细胞弱阳性,耳蜗螺旋节神经细胞阳性. 本实验的关键是(1)脱钙液选用EDTA并加入少量甘油,pH值为7.4,可以使脱钙缓和,组织不易变脆,并能很好保存抗原.(2)控制实验过程的酸度和温度,固定液及缓冲液的pH均为7.4,石蜡包埋温度均低于60℃.(4)选用电镜超薄切片机进行石蜡切片,使组织结构完整.(3)缩短脱水时间,以防止组织变脆不易切片.
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精原干细胞在支持细胞饲养层上的长期培养
目的 建立体外研究精原干细胞与支持细胞共培养的细胞模型,研究体外精原干细胞在支持细胞层上的增殖特点.方法 应用两步酶消化法,分别从14-15 d及6 d龄雄性昆明小鼠睾丸中分离支持细胞及精原干细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定.将精原干细胞接种在支持细胞层上,观察不同时间点精原干细胞集落形态及数目.结果 在支持细胞层上培养24 h后.精原干细胞开始增殖分裂,呈双细胞形态;随着培养时间延长,双细胞集落数逐渐减少,而链状细胞集落逐渐增加;培养120 h后,链状细胞局部融汇堆积,且细胞集落维持在相对稳定数量.在每4-5 d更换培养液的条件下,细胞集落维持稳定状态的平均时间为(51.2±5.8)d.结论 精原干细胞在体外支持细胞层上呈集落样生长,并能长时间维持细胞集落形态及数目,可用于体外研究生精细胞增殖分化特征、药物或毒物干扰精原干细胞功能实验.
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DEHP体外对大鼠睾丸支持细胞Bax和Bcl-2基因表达的影响
目的:探讨邻苯二甲酸二乙基己酯(di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP)体外对大鼠睾丸支持细胞Bax和Bcl-2基因表达及细胞凋亡的影响.方法:体外分离和原代培养大鼠睾丸支持细胞,不同浓度的DEHP(10、50、100nmol/L)作用于支持细胞24h,荧光定量PCR法检测Bax和Bcl-2基因mRNA表达,Weastern blot检测Bax和Bd-2蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果:与对照组相比,DEHP各组支持细胞Bcl-2基因mRNA和蛋白表达下降(P＜0.05),Bax基因mRNA和蛋白表达增加(P＜0.05),细胞凋亡率增加(P＜0.05),呈浓度依赖关系.结论:DEHP可通过抑制Bcl-2基因表达和上调Bax基因表达而诱导大鼠睾丸支持细胞凋亡,进而影响支持细胞功能.
关键词： 邻苯二甲酸二乙基己酯 支持细胞 Bax Bcl-2 调亡 -
锌指蛋白185(ZNF185)在小鼠睾丸精子细胞、间质细胞和支持细胞中的表达和定位
目的 研究锌指蛋白185(ZNF185)在小鼠睾丸精子、间质和支持细胞中的表达变化.方法 应用免疫荧光组织化学染色法检测ZNF185在精子、间质、支持细胞和睾丸组织中的定位;实时定量PCR和Western blot法分别检测三种细胞中ZNF185 mRNA和蛋白表达水平的差异.结果 免疫荧光细胞分析显示ZNF185在小鼠睾丸精子、间质和支持细胞中均表达,主要分布于间质和支持细胞胞质、精子细胞头部和尾部;实时定量PCR和Western blot结果显示,支持细胞ZNF185 mRNA和蛋白表达水平显著低于间质和精子细胞.结论 ZNF185分布于小鼠睾丸不同细胞,表达量存在差异.
关键词： 锌指蛋白185(ZNF185) 精子细胞 间质细胞 支持细胞 精子发生 -
甲醛急性染毒对性成熟期雄性大鼠睾丸支持细胞结构和功能的影响
目的 探讨甲醛急性染毒对性成熟期雄性大鼠支持细胞结构和功能的影响.方法 选用性成熟期健康SD雄性大鼠24只,随机分为甲醛染毒高[10 mg/(kg·d)J、中[1 mg/(kg·d)]、低[0.1 mg/(kg·d)]剂量和对照组4组.腹腔注射染毒3 d后,利用透射电镜观察支持细胞的超微结构,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定雄激素结合蛋白(ABP)mRNA的相对表达量.结果 ①染毒3 d后,高剂量甲醛染毒组精子数与对照组相比显著下降(P<0.05);中、高剂量甲醛染毒组精子活动率与对照组相比显著下降(P<0.05)而精子畸形率与对照组相比显著升高(P<0.05);②中、高剂量甲醛染毒组大鼠支持细胞线粒体空泡化、核染色质边集;③各剂量甲醛染毒组的ABP mRNA表达水平与对照组相比均有明显的差异(P<0.05).相关检验发现甲醛染毒剂量与ABPmRNA表达水平显著负相关(r=-0.896,P<0.05).结论 对支持细胞结构和功能的影响可能是甲醛雄性生殖毒性的重要机制.
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睾丸细胞的生物学特征及研究进展
睾丸形态与功能的维持主要依靠生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞发挥作用。生精细胞、支持细胞功能的正常是精子发生的基础，管周肌样细胞的收缩促使精子排出至睾丸网，间质细胞是睾酮的主要来源。目前，睾丸细胞研究主要集中在细胞体外培养、细胞基因组学、细胞应用三大领域。本次研究将分别探讨生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞的的生物学特征及其研究进展。
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卵巢睾丸母细胞瘤2例
卵巢睾丸母细胞瘤又称卵巢支持间质细胞瘤,是一种稀少的性素间质细胞瘤,来源于原始或未分化的性腺间质,组织形态上反映睾丸组织的不同发育时期,由分化不同程度的支持细胞和(或)间质细胞构成.1990～2001年我院发现2例该病患者,现报道如下.
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支持细胞--间质细胞瘤一例报告
一、临床资料病例,患者,女,24岁,已婚,孕1产0,因月经紊乱1年半,伴闭经多毛4个多月,于1996年11月12日入院.近1年来每月月经来潮2次,经期14 d,量中等.同时发现腿部、下腹部及阴毛增多,无声音增粗及性格情绪等明显变化.7个多月前起月经量进行性减少,4个多月前开始闭经至今,并伴烦躁、声音增粗,体毛明显增多,增粗.
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巴戟天水提取物对精索静脉曲张SD大鼠支持细胞波型蛋白表达的影响
目的 探究巴戟天水提取物对精索静脉曲张SD大鼠支持细胞波型蛋白表达的影响.方法 选取处于青春期的健康雄性SD大鼠40只,按照数字随机表法分为假手术组、对照组、观察1组和观察2组,按组别分别使用相应剂量的生理盐水和巴戟天水提取物灌胃,然后使用MTT法检测细胞活性,使用实时荧光定量PCR法检测mRNA相对表达量,使用Western blotting法检测波形蛋白表达.结果 4组大鼠支持细胞活性差异无统计学意义(P>0.05);对照组支持细胞波形蛋白mRNA和波形蛋白表达水平显著低于假手术组(P<0.05),观察1组和观察2组显著高于对照组(P<0.05),并且观察2组显著高于对照组和观察1组(P<0.05).结论 巴戟天水提取物具有提高精索静脉曲张SD大鼠支持细胞波形蛋白mRNA表达水平和波形蛋白表达水平的作用.
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睾丸支持细胞连接结构在精子发生过程的作用
睾丸支持细胞(Sertoli cell)是曲细精管内唯一与生精细胞直接接触的体细胞,在生精过程中起免疫屏障、支持、营养和调节作用.相邻支持细胞、支持细胞与生精细胞之间的连接类型包括紧密连接、锚定连接和缝隙连接.这些连接结构与精子发生过程紧密联系,连接结构紊乱或异常,会干扰精子发生过程中的信号通路、生精细胞迁移、精子形态形成和精子极性维持等,引起生精功能障碍,导致男性生育力下降,甚至不育.
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管周细胞在介导睾丸功能中的作用
管周细胞是分布在生精上皮基膜外,围绕曲细精管呈环形排列的一类肌成纤维细胞,有伸缩和分泌功能.管周细胞合成了多种生物活性物质,旁分泌调节间质细胞和支持细胞的功能.管周细胞的发育依赖于雄激素作用,间质细胞合成雄激素过程被阻断或抗雄激素抗体的出现都能抑制管周细胞的发育.单独雄激素不能促使管周细胞分化,它需要同时有促性腺激素作用于支持细胞,间接地刺激管周细胞分化.管周细胞分泌旁分泌因子PModS等调节支持细胞功能,促进支持细胞合成雄激素合成蛋白和转铁蛋白.管周细胞、间质细胞和支持细胞相互之间密切联系,协调促进精子发生和睾丸雄激素合成.
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支持细胞与其周围细胞之间的相互作用
支持细胞为生精细胞提供结构支架和营养,支持细胞分泌的细胞因子(如IL-1α和IL-6)可能涉及精子发生的局部调控.生精细胞分泌蛋白抑制因子或刺激因子来调节支持细胞的功能.生精细胞的分化,抑制支持细胞分泌睾丸素.支持细胞对间质细胞有营养作用,支持细胞释放的类黄体生成素释放激素(LH-RH)作用于间质细胞上的LH-RH受体,进而调节间质细胞的功能.间质细胞产生的β-内啡肽和黑素细胞刺激素可分别抑制和促进支持细胞的分泌.肌样细胞旁分泌因子(PModS)促进支持细胞合成雄激素结合蛋白(ABP)和转铁蛋白,而支持细胞可抑制肌样细胞增殖.
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Fas/FasL系统与睾丸
哺乳动物睾丸中的生殖细胞通过多次有丝分裂进行克隆性扩增,从干精原细胞到后产生精子是一个连续的分化与成熟的动态过程.生精上皮内的支持细胞和生殖细胞紧密联接,支持细胞跨越生精上皮的整个厚层,通过提供结构、激素和营养来供养生殖细胞,与精子生成和谐地结合起来.生殖细胞不间断地克隆性扩增,需要一种机制来平衡生殖细胞数目,以及接受支持细胞的支持与供养能力.凋亡是一个依赖能量的细胞主动死亡过程,与核酸内切酶活化有关,并且有特殊的生化及形态学改变.近年的研究表明:凋亡在人体发育过程及在许多疾病,如恶性肿瘤、自身免疫及感染性疾病中起重要作用[1],睾丸中也有同样的过程[2,3].发育早期生殖细胞不断增殖,在发育过程中由于选择性凋亡而使生殖细胞有所限制.睾丸生殖细胞的凋亡作用作为一个重要的生理机制限制着生精上皮内生殖细胞的数量[2].
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小鼠睾丸支持细胞标志蛋白表达的研究
目的:探寻小鼠睾丸支持细胞不同发育阶段和功能状态下的特异性标志蛋白.方法:通过对小鼠睾丸组织进行免疫组织化学染色和实时定量(real-time)RT-PCR,观察受精后16d胚胎(E16)到出生后6周的雄性小鼠睾丸组织蛋白和mRNA表达.结果:雄激素受体(AR)在出生后1周、2周、6周小鼠的睾丸支持细胞、外周小管肌样细胞、间质细胞细胞核内都有表达,且表达量逐渐增强,但在E16不表达;Wilms肿瘤基因(WT1)在E16、出生后1周、2周、6周的睾丸支持细胞细胞核内表达,但不表达于其它细胞;苗勒氏管抑制素(AMH)在E16、出生后2周的睾丸支持细胞胞质中表达,而在出生后6周不表达;β-链蛋白(β-catenin)和胞质紧密粘连蛋白-1(Zo-1)是血睾屏障特异性蛋白,出生后2周时它们分布于整个曲细精管,而出生后4周时规则地分布于靠近外壁的一圈,此时它们的血睾屏障已经完全建立.Real-time PCR分析睾丸组织mRNA表达,佐证了这些结果.结论:WT1可以作为支持细胞的特异性标志,而AMH则标记不成熟的睾丸支持细胞;AR单独不适合作为睾丸支持细胞的标志物,但与其他标志物结合,可能可区分睾丸支持细胞的成熟与否.而通过β-catenin和Zo-1染色,可以判断血睾屏障是否完全形成,为支持细胞是否成熟提供判断标记.
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胚胎期氟他胺暴露对SD大鼠支持细胞增殖和成熟的影响
目的:探讨胚胎期暴露于氟他胺(Flu)对SD雄性仔鼠睾丸支持细胞的影响.方法:将妊娠的SD大鼠随机分为Flu组和正常组,Flu组自妊娠后第12～21日每日皮下注射25 mg/kg Flu以建立生殖发育障碍模型,正常组不作任何处理.分别在雄性幼仔出生后第13日(PD 13)、PD15、PD 17随机颈椎脱臼法处死幼仔鼠,收集雄仔鼠睾丸组织.免疫组织化学检测雄仔鼠BrdU并计算支持细胞增殖指数,Real-time PCR检测各组雄仔鼠SGP-2基因的表达.结果:随着生长发育,正常组和Flu组雄仔鼠睾丸支持细胞增殖指数均呈下降趋势,PD 17正常组支持细胞增殖已经停止,Flu纽PD 13、PD 15、PD 17支持细胞增殖指数升高,明显高于正常组(P＜005).PD13 Flu组支持细胞SGP-2 mRNA表达量较正常组无明显差异(P＞0.05);PD 15、PD 17 Flu组支持细胞中SGP-2 mRNA表达量明显低于正常组(P＜0 01).结论:胚胎期Flu暴露导致支持细胞增殖期延长、成熟延迟,这可能是导致其生殖细胞发育障碍的重要原因之一.
关键词： 氟他胺(Flu) 支持细胞 细胞增殖 硫酸糖蛋白-2(SGP-2) -
睾丸局部溶脲脲原体感染对支持细胞锌指蛋白265表达的初步研究
目的:研究睾丸局部感染后支持细胞免疫调节功能与锌指蛋白265(zinc finger protein 265,ZNF265)的变化情况.方法:以溶脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,UU)体内感染支持细胞后,分别在感染1、2、3周时间段运用RT-PCR、免疫组化和流式细胞术(FCM)方法比较感染组与对照组间ZNF265、IL-1α、IL-6、TGF-β和FasL的mRNA及蛋白水平的表达变化情况.结果:与对照组相比,体内感染处理后2周后支持细胞的ZNF-265表达下降,3周后又升高;TGF-β和FasL从感染2周开始表达上升,一直至3周仍处于上升趋势;感染2周IL-1α和IL-6表达分别上升;3周后则分别下降.结论:ZNF265在支持细胞被UU感染后会产生表达变化.
关键词： 锌指蛋白265(ZNF265) TGF-β 支持细胞 免疫调节 -
镍铬联合慢性染毒对成年大鼠睾丸波形蛋白表达的影响
目的:探讨镍离子(Ni2+)、六价铬离子(Cr6+)联合染毒对睾丸曲细精管和间质区波形蛋白表达的影响.方法:将32只SD大鼠随机分成8组,每组4只.A组:正常对照组;B组:给予等量0.9%NaCl;C组:5 mg/kg Ni2+;D组:50 mg/kg Ni2+;E组:2.5 mg/kg Cr6+;F组:6.5 mg/kg Cr6+;G组:5 mg/kg Ni2++2.5 mg/kg Cr6+;H组:50 mg/kg Ni2++6.5 mg/kg Cr6+.连续灌胃染毒4个月后,取睾丸组织.应用免疫组化法检测睾丸波形蛋白的表达和变化.结果:C组-H组的阳性支持细胞率及表达量与A或B组相比,均有显著性降低(P＜0.01);G组与C、E组相比,H组与D、F组相比,阳性支持细胞率与表达量也有显著性降低(P＜0.01).在间质区,C组-H组的波形蛋白表达量,与A或B组相比较均有显著性降低(P＜0.01);G组与C、E组相比,H组与D、F组相比,波形蛋白表达量也有显著性降低(P＜0.01).结论:成年大鼠受Ni2+、Cr6+慢性作用后,睾丸支持细胞和间质区的波形蛋白表达量显著减少,Ni2+和C6+联合染毒对睾丸波形蛋白起着协同或相加的毒性作用,损害更严重.
