快速老化痴呆小鼠听功能及耳蜗螺旋神经节细胞MeCP2增龄性变化

目的 探讨快速老化痴呆小鼠听觉功能、耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cell,SGC)甲基化CpG结合蛋白2 (methyI-CpG-binding protein 2,MeCP2)表达的增龄性变化.方法 检测5、7月龄快速老化小鼠亚系8 (senescence accelerated dementia mouse/prone,SAMP8)和同龄抗快速老化小鼠亚系1(senescenceaccelerated mouse/resistance 1,SAMR1) 8 kHz短纯音听觉脑干反应阈值以及SGC的MeCP2免疫组化染色等方面的增龄性变化.结果 ①第5、7月龄SAMP8小鼠双耳听觉脑干反应阈值较同龄SAMR1小鼠明显提高(5月龄左侧t=5.84,P＜0.05,右侧t=3.31,P＜0.05;7月龄左侧t=5.11,P＜0.05,右侧t=5.11,P＜ 0.05)；②MeCP2蛋白在不同月龄快速老化小鼠耳蜗组织中均有表达,第5、7月龄SAMP8小鼠SGC中的MeCP2蛋白较同龄SAMR1小鼠明显降低(5月龄t=2.80,P＜0.05；7月龄t=4.64,P＜ 0.05).结论 SGC中MeCP2蛋白的表达水平随着快速老化小鼠听觉功能增龄性减退而降低,说明MeCP2蛋白可能与听觉形成有关.

耳蜗电刺激并脑源性神经营养因子联合应用对大鼠耳蜗病理及听觉生理的影响

目的 探讨延迟给予慢性电刺激、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF),以及二者联合应用对药物致聋大鼠耳蜗病理及听觉生理影响.方法 药物致聋大鼠40只,随机平均分为人工外淋巴液组(artificial perilymph,AP)、BDNF组、电刺激(electrical stimulation,ES) +AP组、BDNF+ES组共4个组.药物致聋30 d后,左侧耳蜗植入动物用蜗内电极及药物灌注集成单元,并连接微渗透压泵,进行分组干预并每7d行电诱发听性脑干反应(electrically evoked auditory brainstem response,EABR)阈值检测.干预28 d后处死动物,取耳蜗进行病理检查,观察蜗轴Rosenthal管内螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGC)胞体密度及骨螺旋板缰孔内SGC树突数量.结果 ①EABR阈值:与AP组比较,其他3组均降低,ES和BDNF联合应用具有协同作用.②耳蜗病理SGC胞体密度及神经纤维密度,除AP组外,其余3组均表现为实验侧较对照侧多;各组间左侧比较,其余3组均较AP组密度大,ES和BDNF联合应用具有协同作用.③EABR阈值与SGC树突及胞体变化存在函数关系,方程为T=469.222-1.561 (F底L) -0.089 (R2L),系数检验P值分别为0.000、0.001、0.023.结论 大鼠致聋30d后,鼓阶内慢性电刺激及BDNF持续灌注给药联合应用对SGC胞体及树突均有保护作用,并可以相应改善听觉敏感性,且二者具有协同作用；SGC胞体及树突的数量均影响听觉敏感性,后者影响更大.

211电刺激下听神经兴奋性研究

本文主要介绍近年来电刺激听神经兴奋性研究进展,阐述了电刺激与声刺激听神经兴奋性的异同,电刺激下影响听神经兴奋性因素和电刺激对于耳蜗螺旋神经节细胞的影响.

阻断JNK信号转导通路对培养螺旋神经节细胞神经突生长的影响

小鼠耳蜗螺旋神经节细胞瞬时外向钾电流的研究

螺旋神经节细胞膜上的瞬时外向钾电流通道,对于听觉动作电位的形成和调节具有重要的作用.本实验以小鼠耳蜗螺旋神经节细胞为材料,应用全细胞构型电压钳制技术对此通道电流进行了研究,拟为听觉形成的离子机制提供可靠的电生理学实验依据.

耳蜗毛细胞严重缺失后螺旋神经节细胞的病理变化

目的：观察耳蜗毛细胞严重损伤后螺旋神经节细胞的病变过程。方法豚鼠肌肉注射硫酸卡那霉素（1000mg/kg）2小时后给予速尿（100mg/kg）静脉注射，分别于用药3天、7天、1月及2月行听觉脑干诱发电位(auditory brainstem response ABR)及耳蜗形态学检测。结果联合应用速尿和硫酸卡那霉素后，豚鼠鼠ABR阈值出现很大程度提高，给药3天、7天、1月、2个月组各频率ABR阈值比较无差别；对药物损伤致聋豚鼠进行耳蜗切片、扫描电镜观察，发现用药7天后耳蜗毛细胞严重受损，以外毛细胞（OHCs）缺失为主，严重致聋的豚鼠内毛细胞（IHCs）也广泛缺失，但是切片显示柯替氏器的支持细胞存在；螺旋神经节细胞正常。联合用药1月后螺旋神经节细胞大量缺失，Corti’s器塌陷。结论药物性耳聋首先损伤毛细胞，螺旋神经节细胞的损伤延后发生，螺旋神经节细胞缺失程度取决于致聋后的时间长短，致聋后螺旋神经节细胞变性可以持续数年。这为我们植入电子耳蜗提够了宝贵的时间窗。

bFGF和NT3基因共表达质粒对豚鼠庆大霉素耳蜗损害的防治作用研究

目的 探讨pBudCE4.1-bFGF-NT3基因共表达载体对豚鼠庆大霉素耳蜗损害的防治疗作用.方法 取健康豚鼠造模,分组,即:治疗组、预防组、对照组、NT3组、bFGF组.治疗组经右耳圆窗导入pBudCE4.1-bFGF-NT3、bFGF组、NT3组分别导人pCI-bFGF及pUC18-NT3;预防组在肌注庆大霉索前,先行导人共表达质粒:对照组导入SA-EGFP.各组动物分别进行ABR阈值的测试:耳蜗外毛细胞、螺旋神经节细胞计数并观察组织形态学变化.结果 ABR阈值测试,预防组、治疗组、NT-3组、bFGF组与对照组比较差异有显著意义(P<0.01),治疗组与NT-3组、bFGF组比较差异有显著意义(P<0.01),对照组,外毛细胞大面积缺失及细胞水肿坏死.而预防组、治疗组、N1r3XEG、bFGF组外毛细胞缺失等渍理性改变均显著减轻.毛细胞计数:预防组、治疗组、NT-3组、bFGF组与对照组比较差异有显著意义(P<0.01),治疗组与NT-3组、bFGF组比较差异有显著意义(P<0.01).对照组螺旋神经节细胞大面积坏死肿胀和消失,而预防组、治疗组、NT-3组、bFGF组仅有少数的螺旋神经节细胞发生退行性病变和损失.螺旋神经节细胞计数:预防组、治疗组、NT-3组、bFGF组与对照组比较差异有显著性(P<0.01),预防组、治疗组与NT-3组、bFGF组与比较差异有显著性(P<0.01).NT-3组与bFGF组比较差异有显著性(P<0.01).结论 pBudCE4.1-bFGF-NT3真核共表达载体,可有效预防和治疗庆大霉素对豚鼠耳蜗的损害.

高迁移率族蛋白B1在正常C57BL/6J小鼠耳蜗组织中的分布

目的 了解C57BL/6J小鼠耳蜗组织中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的分布情况,为研究HMGB1在内耳疾病中的作用提供基础.方法 运用听性脑干反应(ABR)筛选听力正常的小鼠.对其行全耳蜗基底膜铺片及冰冻切片,并行免疫荧光染色,观察HMGB1在小鼠耳蜗中的表达和分布情况.结果 HMGB1在小鼠耳蜗内Corti氏器及螺旋神经节区均有表达分布.Corti氏器中内毛细胞和Deiters细胞的HMGB1表达丰富,螺旋神经节区底回胶质细胞HMGB1较顶回更丰富.其中HMGB1在Corti氏器内表达量为Deiters细胞多于内毛细胞多于外毛细胞,HMGB1的表达具有明显差异.但Corti氏器的HMGB1表达没有顶底回差异.在螺旋神经节区,螺旋神经节细胞的HMGB1表达量在顶底回之间无明显差异.但HMGB1在胶质细胞顶底回的表达具有差异性.而螺旋神经节区HMGB1的表达在胶质细胞与螺旋神经节细胞之间则无明显差异.结论 HMGB1在正常小鼠耳蜗中不同细胞中的表达有差异,为今后内耳疾病发病的分子机制研究提供了基础.

人工耳蜗植入后听力言语康复研究进展

人工耳蜗是目前唯一获得FDA批准、可帮助绝大多数重度-极重度感音神经性聋患者恢复听力的生物医学装置[1,2]，常被视为将基础研究转化为临床实践的成功范例，其三位主要发明人（澳大利亚的Graeme Clark、奥地利的Ingeborg hochamir和美国的Black Wilson）也因此分享了2014年Lasker-DeBakey临床医学研究奖。有别于传统助听器仅是对声音信号的放大处理，人工耳蜗则可将声学信号转化成为电信号，直接刺激患者的螺旋神经节细胞和听神经。多导人工耳蜗诞生30多年来，软硬件技术不断升级，耳蜗植入者的表现稳步提升[3]，植入年龄及手术适应证已大大放宽。

幼鼠内耳单个器官培养步骤及分类方法

内耳离体培养在研究内耳细胞功能、内耳组织发育再生、细胞损伤退化等方面具有重要价值。但由于内耳的组织结构微小复杂，其取材和培养具有较大难度，使该技术的普及和应用受到一定限制。本文在简要点评不同内耳离体培养方法优劣的基础上，结合本实验室多年来积累的实践经验，详细介绍了新生大鼠各个内耳终器取材及培养的具体步骤。从解剖迷路到分离终器，从凝胶制备到标本铺放，都有详细的操作指南，本文还针对各环节中的技术动作和关键事项进行了具体探讨并配以指导图例，希望这些内容能够弥补以往文献中抽象简略的条款式步骤所造成的实验困难，为开展内耳器官培养研究的初学者提供一定的帮助。

耳聋生物治疗现状与挑战

众所周知,由于毛细胞缺失造成的感音神经性耳聋在目前仍然是不可治愈的.虽然现在临床上有助听器、人工耳蜗、振动声桥等听觉补偿手段可以帮助患者改善听力,但其效果毕竟不能完全令人满意,而且助听设备不能作为根治性方法,人们仍然希望能够有一种方法能够使耳聋患者恢复接近正常的听力.生物治疗是未来很有希望根治耳聋的治疗方法.耳聋的生物治疗包括干细胞治疗、分子治疗和基因治疗.这些治疗策略的主要是通过诱导内耳毛细胞和/或支持细胞、螺旋神经节细胞的再生,恢复内耳柯蒂氏器的精细的三维细胞结构,并在新牛的内耳毛细胞与螺旋神经节神经元末梢之间建立有功能的突触联系,从而进一步恢复内耳的声电转换功能,并恢复患者的听力.近10年来本课题组在药物性耳聋、噪声性耳聋和遗传性耳聋动物模型的建立和治疗方面的研究得到一些新进展[1-14],部分涵盖本专刊之中,而且本文也将对目前国内外已经报道的一些研究进行总体概述,今后需要更大的突破,以期更快推进耳聋生物治疗研究向临床转化,有望成为转化医学的又一个典范.

耳蜗螺旋神经节细胞的损伤和再生

耳蜗螺旋神经节细胞（spiral ganglion cells，SGCs）为双极神经节细胞，是听觉传导通路的第一级神经元，其周围突与毛细胞相连，中枢突则参与组成听神经。螺旋神经节细胞在声音信号的传递与编码方面具有重要作用，容易在接触耳毒性药物、强噪声、神经营养因子（NTFs）缺乏、衰老、缺血-再灌注等因素而导致不可逆的损伤，并且引起听力损失。由于螺旋神经节细胞是高度分化的终末细胞，损伤后难以修复，使得神经性耳聋的治疗更加困难。研究发现神经营养因子和干细胞可以诱导死亡的螺旋神经节细胞再生（Regeneration）。本文将从螺旋神经节细胞的损伤机制和螺旋神经节细胞再生方面进行综述。

碱性成纤维细胞生长因子对硫酸链霉素急性耳毒性影响的实验研究

采用激光共聚焦显微镜技术,以Fluo-3/AM负载后的豚鼠螺旋神经节细胞(SGC)为实验对象,观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对其钙调控的影响以及这种影响与硫酸链霉素的拮抗效应.结果表明,高钾细胞外液和含1nmol/L bFGF的正常细胞外液灌流可以导致SGC[Ca2+]明显升高,钙升高的来源为细胞外钙离子的内流,bFGF和高钾细胞外液具有协同作用,硫酸链霉素可以阻断高钾细胞外液的致细胞内钙升高效应,bFGF可以拮抗硫酸链霉素的这种阻断作用,拮抗作用的大小与所用bFGF的浓度相关.

短时血清培养与多聚赖氨酸对耳蜗螺旋神经节细胞活性与贴附性的作用

目的 体外分离大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion neurons,SGN),探索急性分离后短时血清培养可提高耳蜗SGN的活性,同时观察多聚赖氨酸对耳蜗SGN的贴附性影响,为采取膜片钳技术研究耳蜗SGN电生理特性提供实验平台.方法 采用急性分离的方法获得耳蜗SGN后,进行短时间的血清培养,同时在培养皿的底部加入多聚赖氨酸.分别比较耳蜗SGN在活性和贴附性上与未进行血清培养及未加多聚赖氨酸时的差异.结果 急性分离后的耳蜗SGN,短时血清培养后比不培养的能获得更好的细胞状态,可以记录出稳定的电流曲线,并且能持续良好的细胞活性约5h,而不加血清培养的细胞,良好活性只能持续约半小时.在培养皿底加用多聚赖氨酸,可明显提高耳蜗SGN的贴附性.结论 急性分离方法得到的耳蜗SGN,通过加血清短时培养及在培养皿底加多聚赖氨酸,可明显提高耳蜗SGN的活性及贴附性,增加了细胞的记录时间和封接成功率,从而有利于对耳蜗SGN做进一步电生理学的研究.

毛细胞自发活性对螺旋神经节生存及其外周靶支配的影响

感音神经性聋和耳鸣是两种为常见的听觉系统疾病.据世界卫生组织1996年估计,全世界聋残患者约有1.2亿人.我国每年新生先天性耳聋患儿3万余人.而占全世界总人口15％以上的人群遭受经常性或永久性主观耳鸣的困扰[1].而听觉感受器毛细胞及其传入纤维是两个常见的病变部位.当Ⅰ型螺旋神经节细胞内毛细胞之间的突触或其轴突出现故障,将出现听觉神经病[2,3].当Ⅰ型髓鞘包裹的螺旋神经节树突和轴突因炎症、肿瘤或血管压迫脱髓鞘,诱导的局部脱髓鞘导致胞体或轴突局部合成的离子通道及各种受体等蛋白异常堆积在轴突损伤区神经元的胞体膜上,引起受损的初级传入神经元异位兴奋和反应性自发增加,成为异位电活动的起博点.

神经营养因子-3和胶质细胞衍生的神经营养因子共转导对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用

目的探讨新型的病毒载体(HSV-Amplicon)介导的神经营养因子-3(NT-3)和胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)共同表达,对耳蜗螺旋神经节细胞(SGNC)的保护作用.方法构建能够在独自的转录控制条件下,同时表达NT-3和GDNF的HSV-Amplicon重组体(HSVnt-3myc/gdnf).包装后,转导体外培养的内耳细胞(MOI=1),48 h后分别测定培养基中NT-3和GDNF的含量.建立顺铂(DDP)致聋的小鼠动物模型,24只实验小鼠被分成3组,经鼠尾静脉隔日注射DDP两次,8 mg/kg,48 h后再分别经圆窗将10 μl HSVnt-3myc/gdnf、HSVnt-3myc/lac和HSVlac病毒悬液注入鼓阶,饲养4周后,取出耳蜗,采用NIH软件分析系统,定量分析耳蜗内SGNC的总数.结果 ELISA显示 HSVnt-3myc/gdnf 转导的内耳细胞培养基中,NT-3的含量达11.44 μg/ml,而GDNF的含量达1.79 ng/ml,与对照组比较,差异有显著意义(P<0.01).在DDP致聋的小鼠模型中,定向转染HSVnt-3myc/gdnf 、HSVnt-3myc/lac和HSVlac 的耳蜗平均SGNC存活率分别为88%、77%和22%,各组间差异有显著意义(P<0.01).结论 HSV-Amplicon介导的NT-3/GDNF共同表达,可以刺激SGNC分泌NT-3和GDNF,有效拮抗耳毒性药物所致的SGNC损伤,提高SGNC的残留数量,促进SGNC突起的再生.

噪声性听力损伤对大鼠耳蜗螺旋神经节Caspase-3表达的影响

目的 探讨不同程度的噪声性听力损伤(NIHL)与大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(SGC)Caspase-3表达水平的关系,分析SGC噪声损伤的凋亡机制.方法 SPF级雄性SD大鼠30只随机分为3组,每组10只.除对照组外,其余2组分别予以90、110 dB SPL的白噪声暴露,每天6h,连续28 d,暴露前1d和暴露结束后第7d进行听性脑干反应(ABR)检测和SGC病理学检查,免疫组化法分析SGC的Caspase-3表达水平.结果 各组间大鼠平均永久性听阈位移(PTS)水平变化差异有统计学意义(F=1 103.21,P＜0.01),随噪声暴露强度的增加,PTS水平也增加;各组大鼠SGC的Caspase-3平均灰度值(IA)差异有统计学意义(F=1 190.93,P＜0.01),随噪声暴露强度的增加,IA值亦增加;病理学观察发现各噪声暴露组均出现SGC的损伤,110 dB SPL噪声暴露组出现明显的SGC溶解现象.结论 轻度NIHL即可诱发耳蜗SGC的凋亡.

植入人工电子耳蜗患儿的护理

人工电子耳蜗是近年来随着仿生学发展起来的一项新技术;特别是多导人工电子耳蜗技术的发展,更为助听效果不佳的病人提供了改善听力的新途径.电子耳蜗的基本原理是人工耳蜗的语言处理器将接收到的声音信号转化为编码的电信号,由植入的电极刺激螺旋神经节细胞;再由听神经将信号传人大脑产生听觉.植入人工电子耳蜗是使先天或后天性重度感音性耳聋患儿听力补偿的重要途径,但植入人工电子耳蜗的护理是提高疗效的关键.现将植入人工电子耳蜗患儿的护理介绍如下.

新生C57小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的原代培养

背景:目前在原代细胞培养领域内,对耳蜗螺旋神经节细胞培养条件的报道各有差异,个别方法重复性较差,不利于实际应用.目的:原代培养并鉴定新生C57小鼠螺旋神经节细胞.方法:显微解剖分离新生C57小鼠蜗轴组织,经胰酶消化+差速贴壁+化学药物相结合方法培养;倒置相差显微镜及苏木精-伊红染色观察细胞生长状态,免疫组织化学染色鉴别细胞来源.结果与结论:蜗轴组织细胞纯化后,胞体呈椭圆形或三角形,有细长的突起,Nuen染色胞核呈棕黄色阳性反应,β3-Tubulin染色细胞胞浆与轴突均呈棕黄色阳性反应.提示实验成功培养出小鼠螺旋神经节细胞.

水杨酸钠对顺铂导致的螺旋神经节细胞毒性的保护作用

目的:探讨水杨酸钠对顺铂导致的螺旋神经节细胞(SGNs)毒性的保护作用.方法:体外培养SGNs.分组:空白对照组.不同浓度水杨酸钠组、顺铂组和顺铂+水杨酸钠组(100～900 μg/mL),加药48 h后,通过显微镜下细胞计数及噻唑蓝(MTT)比色法对SGNs进行药物毒性检测,通过Hoechst 33258进行细胞核染色,观察细胞凋亡情况.结果:顺铂(4、6、8 μg/mL)对SGNs有明显毒性,促使细胞凋亡,并且随浓度增加,细胞数量明显减少,与空白对照组相比差异具有显著统计学意义(P<0.05).一定浓度范围(≤500 μg/mL)的水杨酸钠可以拮抗顺铂对SGNs的毒性,拮抗顺铂导致的细胞凋亡,与顺铂组相比差异具有显著统计学意义(P<0.05).结论:在体外培养的条件下,水杨酸钠在一定浓度范围内可以拮抗顺铂导致的SGNs毒性,其保护机制可能与抑制细胞凋亡有关.