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超极化激活阳离子电流的电生理特性及其在DRG神经元中的分布
运用全细胞膜片电压钳和电流钳技术研究超极化激活阳离子电流(hyperpolarization-activatedcurrent,Ih)的电生理学特性及其在背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)细胞上的分布,结果发现:①当膜电位超极化时可以记录到一种内向的电压依赖性电流--Ih,电流的反转电位为-32.34±2.56 mV(n=4),半激活电位(potential at half activation,V1/2)为-100.6(n=8);Ih可特异地被胞外Cs2+(2 mM)阻断,而不受胞外Ba2+(1.0 mM)的影响;cAMP是Ih的特效激动剂,胞内施加100μM的cAMP可使Ih激活曲线向左平移9.5 mV(-91.4 mV,n=5);Ih为Na+、K+混合阳离子流,Na+、K+通透比为0.25,改变胞外K+浓度能有效地改变Ih大小,但不影响其Na+、K+选择通透比.
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细胞外La3+对内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用
本文采用双微电极电压钳(TEV)法研究细胞外La3+对非洲爪蟾卵母细胞表达的内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用.细胞外La3+浓度分别为0,0.1,0.3,1,3和10mmol/L,K+浓度为90mmol/L,可见La3+对IRK1的瞬间电流(施加电压后1.5ms)具有La3+浓度依赖性、时间依赖性和电压依赖性阻断作用;阻断剂La3+对IRK1的门控特性和外向电流几乎无影响作用;细胞外加La3+后反转电位没有变化,因而IRK1对之不通透.细胞外La3+在减少IRK1电导的同时增加IRK1的归一化电导.三级指数拟合的结果表明:拟合的时间常数不随La3+浓度的增减而增减,这表明细胞外La3+对IRK1的抑制作用可能通过了表面电荷机制或La3+在通道中的阻断位点在通道表面.因为La3+浓度较低时,阻断的效力与La3+浓度较高时的差异不大,所以La3+不会通过表面电荷机制进行IRK1阻断的,因此La3+是IRK1的一种快速开通道阻断剂,其阻断位点在通道表面.
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细胞外氢离子浓度对HERG通道功能的影响
背景:HERG基因在心肌细胞高度表达,编码钾离子通道,形成延迟整流钾电流的快速激活成分,在复极化过程中发挥重要作用,它是维持2和3相动作电位的主要因素.近有研究显示HERG基因突变可引起长QT综合征(LQTS),而且许多抗心律失常药物的作用靶点为HERG通道.本研究的目的是探讨不同胞外氢离子浓度对HERG通道的影响.方法和结果:本研究将HERG其因亚克隆到pSP64和pcDNA3.1表达载体,用T7 RNA聚合栈体外合成cR-NA,经Ribogreen荧光定量和变性胶电泳鉴定后,将相应的cRNA注入卵母细胞,在18℃培养箱中培养3天后,用标准双电极电压钳测量孵母细胞的表达电流.所有数据均采用pCLAMP软件采集,并应用Daleidagraph3.5和Igor软伯进行数据处理.研究表明胞外酸化作用(pH8.5,7.5,6.5)时,HERG通道来活加速,激活曲线右移,而其它门控动力学无明显影响.结论:本研究表明胞外酸化(pH8.5,7.5,6.5)作用时,HERG通道来活加速,激活曲线右移.酸中素养时,HERG通道来活加速可能是引起心律失常的一种机制.
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小鼠耳蜗螺旋神经节细胞瞬时外向钾电流的研究
螺旋神经节细胞膜上的瞬时外向钾电流通道,对于听觉动作电位的形成和调节具有重要的作用.本实验以小鼠耳蜗螺旋神经节细胞为材料,应用全细胞构型电压钳制技术对此通道电流进行了研究,拟为听觉形成的离子机制提供可靠的电生理学实验依据.
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Oozeer视神经纤维膜动力学特性的仿真
目的 对Oozeer视神经纤维的膜特性进行仿真,研究不同离子通道在动作电位产生过程中的作用.方法 利用Matlab编程和欧拉数值计算法对Oozeer视神经模型的膜动力学特性进行仿真;相平面图法分析脉冲电流对膜电位的相图和有无A型电流存在的dV/dt对V的相图.结果 相图分析表明,动作电位的上升阶段主要是因为传统的快速钠离子流,而A型电流在复极化阶段起主要作用,持续钠离子流和慢速钾离子流的影响较小.A型电流存在时产生延迟的动作电位,且缩短动作电位的持续时间,膜电位升高到尖峰阈值时,膜电位的上升减缓.结论 不同离子电流在动作电位形成过程中起不同作用,A型电流使视神经纤维膜动作电位复极化,对超极化后电位起主要作用.
关键词： Oozeer视神经模型 电压钳 相平面图法 视觉假体 -
膜片钳技术在心血管及药理学研究中的应用
膜片钳技术[1]是一种以记录通过细胞膜上的各种离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多个的离子通道活动的技术.通过微电极与细胞膜之间形成紧密接触,采用电压钳或电流钳技术对生物膜上离子通道的电活动进行记录.
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细胞外Mn2+对内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用
目的和方法:采用双微电极电压钳(TEV)法研究细胞外Mn2+ 对非洲爪蟾卵母细胞表达的内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用.结果:细胞外Mn2+浓度分别为0、1.25、2.5、5、10和20 mmol/L,K+浓度为90 mmol/L,可见Mn2+对IRK1的瞬间电流(施加电压后2 ms)具有Mn2+浓度依赖性和电压依赖性阻断作用;细胞外加Mn2+后反转电位没有变化,因而IRK1对之不通透.细胞外Mn 2+浓度较低时,抑制作用的效力比Mn2+浓度较高时强;细胞外K+浓度为90 mmol/ L和Ba2+浓度为30 μmol/L时,Mn2+可竞争性与Ba2+争夺结合位点,随着Mn2+浓度增加,电流失活过程逐渐减缓,电场距离分数由0.45逐渐变小至0.28,Ba 2+在通道中的结合位点也逐渐离开通道,说明多离子通道IRKl中具有多离于阻断形式 ,同时也表明Mn2+与Ba2+.都是IRKl的一种快速开通道阻断剂.结论 :细胞外Mn2+对IRK1的抑制作用通过了表面电荷机制和快速开通道阻断.
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5-羟色胺转运体基因异体表达模型的建立
目的:探讨建立5-羟色胺转运体(5-HTT)基因异体表达模型的可行性,且为进一步探讨5-羟色胺重摄取的动力过程和条件以及其功能的调控机制奠定基础.方法:利用体外转录cRNA技术将克隆至pOTV中的5-HTT的cDNA转录、合成5HTT的cRNA,通过显微注射技术将该cRNA注入成熟雌性非洲爪蟾卵母细胞的胞质中,使其表达以建立5-羟色胺转运体(SERT)的异体表达模型,并用电压钳技术检测其转运功能.结果:爪蟾卵母细胞可被用做5-HTT的异体表达模型,其转运功能呈浓度依赖性并具饱和现象,转运过程可被特异阻断剂Desipramine阻断.结论:非洲爪蟾卵母细胞可作为5-羟色胺等单胺类神经递质转运体的异体表达系统,为进一步研究转运体蛋白的功能和调控提供了有效工具.
关键词： 5-HT转运体(SERT) 卵母细胞 异体表达 电压钳 -
膜片钳技术在高血压研究中的应用
膜片钳技术(patch - clamp technique)是1976年由Nehetr 和Sakroann在电压钳的基础上发展而来的一种记录细胞膜离子通道电生理活动的技术.通过微电机与细胞膜之间形成紧密接触,采用电压钳或电流钳技术对生物膜上离子通道的电活动进行记录.膜片钳技术的应用将细胞水平和分子水平的生理学研究联系在一起,已成为现代细胞电生理研究的常规方法,使人们对于疾病和药物作用的认识不断更新.膜片钳技术用于心血管领域的研究也越来越多.本文拟对膜片钳技术在高血压病研究中的应用作一综述.
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电压钳控制的电流钳的电路设计
针对传统膜片钳系统在检测快速膜电位方面的局限性,提出一种新的膜片钳工作模式--电压钳控制的电流钳模式,并对这一工作模式的电路原理和设计做了详细介绍.电路测试结果表明,该工作模式能够在保持一定的稳态膜电位的同时,实现对细胞膜的电流钳位,并且检测出膜电位的快速变化成分,另外也具有快电容补偿的功能.技术参数能够满足电生理实验的需要.
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爪蟾视觉发育过程中抑制性GABAa受体功能的变化
目的:阐明从幼年(变态脱尾后2～12周)到成年(变态脱尾后5～10月)爪蟾的视顶盖神经元突触受体变化.方法:盲法脑片全细胞电压钳技术.结果:成年视顶盖神经元的微抑制性突触后电流(mIPSCs)的发放频率(Hz)和平均振幅(pA)分别为2.65±0.69和9.82±1.30,而幼年的分别为0.68±0.23和15.36±2.40,其中成年动物的mIPSCs的频率是幼年频率的3.90倍;乙酰胆碱受体(nAChR)激动剂carbachol均可使幼年及成年的mIPSCs频率增加,增强效率有所不同,幼年增加至对照组的192.0%,而成年组仅为146.2%.结论:随着视顶盖神经元的成熟,其突触GABAa受体功能也相应增强.
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中华大蟾蜍卵母细胞质膜存在钙依赖性的氯离子通道
本文采用双微电极电压钳方法研究了中华大蟾蜍卵母细胞内源性电压门控型离子通道的成分及其生理特性.卵母细胞去极化至一30 mv及更正电压时,有一持续的电压依赖性外向电流出现.钾离子通道拮抗剂四乙基氯化氨(tetraethylammonium chloride,TEA,10 mmol/L)和4-氨基吡啶(4-aminopyridine,4-AP,10 mmol/L)协同作用时,该电流只能被抑制到大电流幅度的(23.4±0.72)%.但是,上述浓度的TEA和4-AP与氯离子通道拮抗剂5-硝基-2,3-苯酚丙胺苯甲酸盐(5-nitro-2,3-phenypropylamino benzoate,NPPB,30μmol/L)、无钙Ringer氏液或钙离子通道拮抗剂维拉帕米(40μmol/L)协同作用时,可分别将此外向电流抑制到大电流幅度的(2.1±0.08)%、(2.2±0.04)%和(3.1±0.15)%.结果表明,中华大蟾蜍卵母细胞质膜上除有钾离子电流之外,还存在钙依赖性的氯离子电流.
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Na+/HCO3-共转运体的电生理学原理
离子通道或离子转运体介导的离子跨膜运输是细胞中两种重要的离子跨膜运输方式.与离子通道介导的被动运输不同,离子转运体介导的离子跨膜转运是一种主动运输方式,具有多种独特的生物学特性.本文以Na+/HCO3-共转运体(Na+/HCO3-cotransporter,NBC)为例,对离子转运体的物理化学和电生理学基本原理及其特性进行分析与介绍.从本质上说,离子转运体是一种酶,本文首先从酶促反应的角度,对NBC介导的离子跨膜运输过程进行分析,介绍了离子转运体的化学计量比、表征离子转运效率的转换数及与此相关的离子转运体的运输通量等.本文进一步从热力学的角度对NBC介导Na+和HCO3-跨膜运输的电生理学原理进行了较为详细的分析.通过热力学分析,本文阐释了NBC依据化学计量比决定其离子转运方向的原理.后,本文对NBC化学计量比的实验测定和化学计量比的生理学意义,即NBC不同工作模式与其在特定组织中的具体生理学过程的关系,进行了讨论.
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普罗帕酮对Kv1.4ΔN钾通道的作用及细胞外钾离子和pH浓度变化时的影响
目的:探讨抗心律失常药物普罗帕酮对Kv1.4△N钾通道的作用,以及细胞外钾离子和pH浓度变化时对该作用的影响,并探讨该作用可能的机制.方法:将Kv1.4ΔN的mRNA注射入非洲爪蟾卵母细胞并使用双电极钳制法观察普罗帕酮对Kv1.4ΔN电生理特性的影响,以及细胞外钾离子和pH变化时的电生理特性改变.结果:pH7 4状态下,普罗帕酮对Kv1.4ΔN通道的峰电流有抑制作用,这种阻滞作用具有电压依赖性、浓度依赖性以及频率依赖性,并且随电位的升高而作用加强,符合单指数和线性关系.普罗帕酮加速电流的失活过程.在不同的钾离子浓度下,这种阻滞作用具有pH依赖性,细胞外高钾pH7 4时,不同浓度普罗帕酮灌流显示IC50为121 μmol/L;细胞外酸性环境下(pH6 0)IC50提高到463 μmol/L,碱性化的环境(pH8 0)降至58 μmol/L.结论:普罗帕酮是Kv1.4ΔN的阻滞剂,可能与作用于细胞内的某些位点有关.
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容量超负荷大鼠衰竭心室肌细胞肿胀激活内向整流阳离子流 Icir,swell变化的研究
目的探讨肿胀激活内向整流阳离子流Icir,swell在肥大和衰竭(CHF)心室肌细胞的变化.①建立大鼠腹腔动静瘘(ACF)致容量超负荷心力衰竭模型.②采用图文采集及分析系统测量并比较正常和CHF心室肌细胞在等渗(IT)及低渗(0.6T)溶液中体积的变化.③采用全细胞电压钳方式记录正常和CHF细胞在1T及0.6T溶液中体积的变化.
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非洲爪蟾卵母细胞内源性及表达的P2型嘌呤受体介导的膜电流记录方法
目的记录和区分卵母细胞内源性P2型嘌呤受体及表达的外源性P2型嘌呤受体介导的膜电流.方法应用双电极电压钳技术分别在带滤泡膜及去滤泡膜后注入RNA并经孵育的卵母细胞记录膜电流.结果根据所用卵母细胞标本的制备(是否去滤泡膜及是否注入RNA并孵育)以及电流的形式及幅值,可将内源性P2型嘌呤受体和表达的外源性P2型嘌呤受体介导的膜电流区分开来.结论应用以上方法可区分两种不同的三磷酸腺苷(adenosine triphos-phate,ATP)激活电流.
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GABAB受体对大鼠海马CA1区锥体细胞突触传递的作用
目的 研究激活GABAB受体对大鼠海马CA1区锥体细胞突触传递的影响.方法 对成年大鼠海马脑片CA1区锥体细胞采用"盲法"全细胞电压钳记录,分别检测和分析巴氯芬(10 μmol/L)对白发性的兴奋性突触后电流(EPSCs)和抑制性突触后电流(IPSCs)的影响. 结果巴氯芬可显著降低谷氨酸能EPSCs和γ-氨基丁酸能IPSCs的频率(P＜0.01),各自达58%±7%(n=17)和42%±10%(n=15),而对它们的幅度无显著性影响. 结论巴氯芬对海马CA1区锥体细胞EPSCs和IPSCs的抑制作用属于突触前抑制,推测GABAB受体所介导的这种抑制作用对CA1区神经元兴奋性的传出具有抑制作用,从而对癫痫的产生有控制作用.
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差分放大器在生理学中的应用
差分放大器的输出信号为两个完全对称的单管放大器的输出信号之差.其在生理学中的主要应用有两个方面:一是作为前置放大器,用于微弱生物电信号测量的输入端以提高共模抑制比;二是用作电压钳制实验中的负反馈放大器的输入端,从而维持细胞膜电位不发生改变.
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参松养心胶囊对Kv1.4钾电流特性的影响
目的:探讨中药复方制剂参松养心胶囊对KV1.4钾通道C型(KV1.4△N)失活的影响.方法:将Kv1.4△NmRNA注射入非洲爪蟾卵母细胞中,使用双电极钳制法(Two electrodes voltage clamp TEV)观察参松养心胶囊对KV1.4AN电生理特性的影响.结果:参松养心胶囊对Kv1.4△N通道的峰电流有抑制作用,这种阻滞作用具有电压依赖性,随电位的升高而作用加强,符合单指数和线性关系.参松养心胶囊可加速KV1.4△N钾通道电流的失活过程,同时可使KV1.4△N通道失活后的恢复减慢.结论:参松养心胶囊能显著抑制KV1.4钾通道电流,这可能是其抗心律失常作用的机制之一.
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细胞外Ba2+对双基因内向整流钾通道的阻断作用
目的:研究Ba2+对非洲爪蟾卵母细胞表达的双基因内向整流钾通道(IRK1-T )的阻断作用.方法:采用双微电极电压钳(TEV)法.结果:细胞外Ba2+浓度分别为1,3,10 和100 μmol/L,K+浓度为90 mmol/L,可见Ba2+的阻断作用对IRK1-T的瞬间电流( 施加电压后1 ms)具有浓度依赖性、时间依赖性和电压依赖性;快速开通道阻断剂Ba2+对IRK1-T 的通道开关特性几乎无影响作用,IRK1-T对之不通透.三级指数拟合表明:细胞外Ba2+低浓度(1和3 μmol/L)时,Ba2+与K+相互竞争同一结合位点,随着Ba2+浓度的增加,时间常数不增加但拟合的权数却浓度依赖性增加,所以失活过程随Ba2+浓度的增加越来越快;细胞外Ba 2+高浓度 (10和100 μmol/L)时,时间常数随Ba2+浓度的增加而减少,拟合的权数却浓度依赖性减少, 失活过程也越来越快,说明Ba2+作用位点由通道的表面部位进入通道更深的地方.结论:Ba2+对IRK1-T的阻断存在两种不同的机制.
