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构建促红细胞生成素表达载体及其在肾小管上皮细胞中的表达
目的 构建促红细胞生成素(EPO)表达质粒,并在人近端肾小管上皮细胞中稳定表达.方法 应用标准分子克隆技术构建EPO真核表达载体pcDNA3.1(-)-hEPO.磷酸钙法转染人肾小管近端上皮细胞(HK-2).酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养液上清中的EPO含量.MTT法绘制各组细胞生长曲线.结果 构建获得EPO基因的表达质粒,并成功转染肾小管上皮细胞,后者经G418筛选,稳定表达EPO.转染后第21天,其表达量为同期转染的293细胞的(35.0±5.3)%.转染后HK-2细胞生长曲线未见明显改变.结论 人近端肾小管上皮细胞可以稳定表达EPO,这为EPO基因治疗选择新靶点奠定了基础.
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雷公藤内酯醇对人肾小管上皮细胞补体C3的抑制
近年的研究表明[1,2],肾脏局部固有细胞尤其是肾小管上皮细胞,在病理因素诱导下过度产生和激活的补体,在肾免疫损伤中发挥重要作用,阻断这一作用将对保护肾功能、延缓肾病恶化具有重要意义.雷公藤内酯醇(T4)是雷公藤二萜化合物中免疫抑制活性强的单体,本研究通过观察其对肿瘤坏死因子(TNF)α诱导人近端肾小管上皮细胞补体C3mRNA和蛋白的影响,探讨雷公藤在分子水平治疗肾病的免疫抑制机制,并与免疫抑制剂环孢素A(CsA)和FK506比较,进一步探讨雷公藤的临床应用意义.
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脂联素对高糖介导的大鼠近端肾小管上皮细胞单核趋化蛋白-1表达的影响
目的 体外实验研究脂联素对高糖刺激下的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)单核趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA及蛋白表达的影响.方法 用含不同浓度葡萄糖的DMEM培养基体外培养NRK-52E细胞,分5组(每组4个样本,此实验重复4次):A组:含5 mmol/L葡萄糖培养基对照组;B组:含30 mmol/L葡萄糖培养基组;C组:含30 nmol/L葡萄糖培养基+1 mg/L脂联素组;D组:含30 mmol/L葡萄糖培养基+5 mg/L脂联素组;E组:含30 mmol/L葡萄糖培养基+10 mg/L脂联素组.以逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法榆测比较各组细胞MCP-1 mRNA及蛋白表达的变化.组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析.结果 A组细胞MCP-1 mRNA表达量为0.247±0.005,B组为0.691±0.009,显著高于A组(t=72.03,P＜0.01);C组为0.425±0.013,显著高于A组(t=46.31,P＜0.05);D组为0.307±0.012,与A组相近(t=73.24,P＞0.05);E组为0.253±0.011,与A组无差异.不同浓度脂联素各组间比较差异亦具有统计学意义(F=37.15,P＜0.05).A组MCP-1蛋白表达量为10.25±0.03,B组为58.47±0.02,显著高于A组(t=35.21,P＜0.01);C组为35.86±0.05,较B组显著下降(t=48.26.21,P＜0.05);D组为25.63±0.06,较B组显著下降(t=32.34,P＜0.01);E组为21.53±0.03,较B组显著下降(t=42.26,P＜0.05),但高于A组(t=64.28,P＜0.01).不同浓度脂联素各组间比较差异亦具有统计学意义(F=53.15,P＜0.05).结论 脂联素可呈剂量依赖性地抑制高糖环境下大鼠近端肾小管上皮细胞MCP-1 mRNA及蛋白的高表达.
关键词： 糖尿病肾病 大鼠 单核细胞趋化蛋白-1 脂联素 近端肾小管上皮细胞 -
糖化白蛋白诱导人近端肾小管上皮细胞产生损伤与炎性反应的表达
目的 探讨在糖化白蛋白(glycated albumin,GA)刺激下,人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞系)中肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)、中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)及炎性反应相关细胞因子的表达情况.方法 分别采用不同浓度的GA与白蛋白(albumin,Alb)刺激HK-2细胞12 h、24 h及48 h,通过real-time PCR和酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunesorbent assay,ELISA)分别检测NGAL、KIM-1的mRNA表达与蛋白释放水平,并运用流式液相多重蛋白定量技术检测血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)和可溶性细胞间黏附分子-1(soluble intercellular cell adhesion molecule-1,sICAM-1)等细胞因子的浓度.结果 与对照组与Alb组比较,GA刺激HK-2细胞12 h、24 h和48 h均能显著上调KIM-1和NGAL的mRNA表达(P<0.05)以及KIM-1和NGAL蛋白的释放(P<0.05);GA组sICAM-1、VEGF与IL-8水平在各时间点均高于Alb组和对照组(P<0.05).结论 GA能上调KIM-1和NGAL mRNA的表达与蛋白的释放,并促进炎性细胞因子的分泌从而对肾小管造成损伤,提示GA可反映糖尿病肾脏受累情况.
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Megalin和Cubilin在肾脏病中的作用
Megalin和Cubilin系多配体属低密度脂蛋白(LDL)受体家族成员,这两种多配体强烈表达在近端肾小管上皮细胞的顶端,在亚细胞水平它们共同定位于网格蛋白小窝和刷状缘小囊泡.起胞吞作用的这两种受体不仅在胞吞肾小球滤过的蛋白质、阻滞蛋白尿的发生中起着十分重要的作用,而且它们在维生素B12、铁等营养物质和微量元素的吸收也发挥十分重要的作用;它们的单独表达异常或共同表达异常出现在多种肾脏病中.本文就其在肾病中的作用作鼢一综述.
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益肾化瘀方含药血清对NRK52E转分化过程中TGF-β1、BMP-7表达的影响
目的:采用体外培养的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)为研究对象,观察益肾化瘀方含药血清对NRK52E转分化过程中TGF-β1、BMP-7 mRNA表达的影响.方法:以TGF-β1诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)为研究对象,采用血清药理学方法和RT-PCR法,观察空白对照组、TGF-β1刺激组、益肾化瘀方含药血清高、中、低剂量组、缬沙坦含药血清组6组细胞形态的变化,以及TGF-β1mRNA、BMP-7mRNA的表达.结果:NRK52E细胞经TGF-β1刺激48 h后,失去原有典型的铺路石样形态,拉长增大呈梭形,细胞间隙也增宽.而与益肾化瘀方含药血清共同作用后,细胞形态有所修复,梭形改变减轻,并随着含药血清浓度的增加在一定程度上渐趋向于正常形态.而同时加入不同浓度的益肾化瘀方含药血清与TGF-β1共刺激48 h后,呈现剂量依赖方式上调BMP-7mRNA表达,而TGF-β1mRNA的表达则有所下降,并表现出与缬沙坦对BMP-7和TGF-β1相互调控的高度一致性.结论:益肾化瘀方含药血清通过在基因水平抑制TGF-β1mRNA表达,并以剂量依赖方式上调BMP-7mRNA表达,而显示出对NRK52E细胞转分化过程的阻抑作用.
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miR-30b/Snail调控糖尿病肾病肾小管上皮细胞EMT
目的:探讨miR-30b/Snail调控高糖诱导人源肾小管上皮细胞(HK2)-间充质转化(EMT)的可能机制,为糖尿病肾病(DN)间质纤维化的防治提供新的实验依据及思路.方法:通过生物信息学预测调控Snail的候选miRNAs;在db/db小鼠肾组织中验证所有候选miRNAs的表达并分别与Snail做pearson相关性分析,筛选出与Snail负相关显著的miRNA;以高糖诱导的HK2细胞为载体,转染该miRNA mimics 72 h后,采用real-time PCR、western blot方法,观察该miRNA、Snail以及EMT相关蛋白的表达改变.结果:调控Snail的候选miRNAs共6个,分别是miR-30b-5p、miR-25-3p、miR-199a-5p、miR-128-3 p、miR-22-3p、miR-27-3p,其中miR-30b与Snail存在明显负相关,r2=0.77549;高糖诱导HK2细胞miR-30b表达下调,肾小管上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达减少;过表达miR-30b-5p可抑制HK2细胞Snail表达,同时上调E-cadherin表达,而Vimentin、α-SMA表达下调.结论:miR-30b/Snail参与调控高糖引起的肾小管上皮细胞EMT.
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衔接蛋白p66Shc在高糖诱导的肾小管上皮细胞线粒体活性氧簇产生中的作用
目的:观察高糖环境下人近端肾小管上皮细胞HK-2中p66Shc的表达和磷酸化,以及p66Shc瞬时高表达对高糖诱导的HK-2线粒体活性氧簇产生的影响,为探讨糖尿病肾病线粒体ROS产生的机制提供新的思路.方法:常规培养正常人近端肾小管上皮细胞(HK-2),将30 mmol/L D-葡萄糖在不同时间点作用于体外培养的HK-2细胞,采用Real-time-PCR检测p66Shc mRNA的表达变化,Westem blot检测p66Shc蛋白、磷酸化p66She-Ser36蛋白的表达;进一步将pcDNA3.1 hisp66Shc质粒转染HK-2细胞,采用激光共聚焦显微镜观察p66Shc高表达对高糖诱导的线粒体活性氧簇产生的影响.结果:30 mmol/L D-葡萄糖能呈时间依赖性上调p66Shc mRNA和蛋白表达水平,同时增强p66Shc第36位丝氨酸的磷酸化;在30 mmol/D-葡萄糖作用下,转染p66Shc的HK-2线粒体ROS水平明显高于未转染组及空载体转染组(P＜0.05).结论:p66Shc参与了高糖诱导的线粒体活性氧簇的产生,可能在糖尿病肾病早期肾小管氧化损伤过程中发挥重要作用.
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大黄酸对大鼠肾小管上皮细胞肥大抑制作用
目的 观察大黄酸(Rhein)对高糖培养大鼠近端肾小管上皮细胞肥大影响.方法 无菌分离SD大鼠单根近球小管并培养;高糖(30 mM)培养肾小管上皮细胞,加入30,15,5 mg/L大黄酸,作用72 h,检测细胞体积、3H-亮氨酸掺人量及蛋白质含量等细胞肥大指标.结果 高糖培养72 h导致细胞体积明显增大,3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质含量分别为(16 225.0±1 476.1)cpm/105细胞和(4.43±0.38)cpm/105细胞,明显增加;30 mg/t,大黄酸处理72 h后,3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质含量分别为(10 734.0±978.9)cpm/105细胞和(4.04±0.23)cpm/105细胞,大黄酸可明显抑剂高糖所致细胞体积增大、3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质含量的升高.结论 大黄酸可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞肥大.
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尿海藻糖酶活性催化光度法测定
海藻糖酶(Trehalase,T,EC3.2.1.28)是许多动物体内存在的一种胞外酶.人海藻糖酶仅产生于肾小管和小肠粘膜上皮细胞.由于尿海藻糖酶只特异性来源于损伤的近端肾小管上皮细胞,并且海藻糖酶在尿液中生理活性稳定,因此,尿海藻糖酶可作为一种较理想的反映近端肾小管损伤的标志物,其活性测定对于重金属盐中毒与药物的肾毒性、急慢性肾小球疾病以及肾小管-间质疾病等的诊断和病情监测具有重要应用价值[1-5].
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血清半胱蛋白酶抑制剂C在诊断儿童肾功能损害作用的评估
近年来发现半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatinC,CysC)能自由通过肾小球,被肾小管重吸收,在近端肾小管上皮细胞被分解代谢[1].为探讨血清CysC诊断儿童肾功能损害的价值,对我院患者进行检测,现将结果报道如下.
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大鼠近端肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定
目的 建立较好的大鼠近端肾小管上皮细胞原代培养模型.方法 无菌取Wistar大鼠肾脏,取皮质剪碎,经Ⅰ型胶原酶消化和45%Percoll连续密度梯度离心进行纯化,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基原代培养并传代,观察细胞形态并以免疫细胞化学染色及酶化学染色鉴定.结果 培养4～5 d细胞融合成单层,呈典型的鹅卵石样,细胞角蛋白18及碱性磷酸酶染色均呈阳性,细胞可传2～3代.结论 此法可在短期获得数量较多、重复性好的近端肾小管上皮细胞,为体外研究肾小管细胞的病变提供了实验平台.
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职业性铅接触人群肾损伤176例分析
铅是一种肾毒性物质，体内的铅主要由肾脏排出，近端肾小管上皮细胞是铅毒性损害的主要靶点，早期为近曲肾小管重吸收功能障碍，中期则可出现肾小管萎缩，晚期可出现慢性肾功能衰竭［1-2］。因此，应及早明确铅接触人群有无肾损伤，及时停止接触，阻止向慢性不可逆的肾损伤发展。但早期临床表现隐匿，不易发现，本研究通过研究职业性铅接触人群肾损伤情况，为临床铅性肾病的防治提供相关依据。
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人近端肾小管上皮细胞的原代培养
目的应用组织块培养法建立人近端肾小管上皮细胞的原代培养方法.方法取肾皮质组织块,应用无血清培养液进行原代培养,融合后用胰蛋白酶-EDTA消化传代.取第三代细胞检测细胞角蛋白、波形蛋白、碱性磷酸酶、结蛋白、Ⅷ因子、α-肌动蛋白的表达,应用扫描电镜和透射电镜观察细胞的超微结构.结果融合的上皮单层细胞呈铺路石样表现,伴圆顶(dome)形成.细胞角蛋白、波形蛋白和碱性磷酸酶染色阳性,α-肌动蛋白、Ⅷ因子相关抗原、纤维连接蛋白和结蛋白染色阴性.细胞存在极性,细胞尖端存在短的微绒毛,细胞之间连接紧密.结论应用组织块培养法结合无血清培养液可以成功建立原代人近端肾小管上皮细胞系.
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人肾近端小管上皮细胞的原代培养、传代及鉴定方法研究
目的:创建一种重复性好、细胞量多的人肾近端小管细胞(PTC)培养方法.方法:取新鲜正常人肾组织分离纯化,用含10%新生牛血清等营养充分的DMEM/F12(1:1)液进行近端小管细胞的原代培养及传代,并以免疫组化、酶化学染色、透射电镜鉴定.结果:培养5～6天后融合成单层细胞,形态呈鹅卵石样,可传代7～9代,鉴定确定为人肾近端小管细胞,重复培养10次,均能稳定获得同样细胞,每克肾皮质可分离培养出(6～12)×106个PTC.结论:此培养方法可在7天内获得人肾近端小管细胞,且重复性好,细胞数量多,为进行肾小管细胞治疗提供必需的细胞,也为研究肾小管病变提供实验平台.
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Percoll法分离培养肾小管上皮细胞
目的建立良好的肾小管上皮细胞培养方法.方法选用SD幼鼠的肾组织进行细胞培养,采用Percoll密度梯度离心法分离纯化肾小管后,选择含10%新生牛血清的DMEM/F12培养基、5%CO2、37℃孵箱进行细胞培养.利用传1代的细胞,制作细胞爬片,用免疫组化、透射电镜进行鉴定.结果细胞生长4～5天后基本达到融合,细胞呈多边鹅卵石铺路样.结合形态学及免疫组化鉴定,细胞培养传1代后98%的细胞为肾小管上皮细胞.结论用Percoll法分离培养的细胞数量多,均一性生长较好,可重复性操作较好.为体外研究接近组织原位RTECs细胞功能和特征及药物的筛选提供了可行性和可能性.
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ALB/RBP比值对妊娠高血压综合征的诊断价值
视黄醇结合蛋白(Retinol-binding protein,RBP)是体内一类将视黄醇(VitA)从肝中转运至靶组织以及实现视黄醇的细胞内转运代谢的特异的运载蛋白,在协助视黄醇储存、代谢及发挥生理功能中起着重要的作用[1].游离的RBP能自由滤过肾小球,其中绝大部分(99.97%)近端肾小管上皮细胞重吸收,当妊娠高血压征(妊高征)肾脏损伤时,由于肾小球率过滤和肾血流量下降,肾小管重吸收障碍,从而会导致血清RBP值升高,而又由于随妊高征的加重,肝功能下降使得各种蛋白的合成能力减弱,以及肾小球的扩张,能使复合RBP和其他微量蛋白自由滤过形成蛋白尿,从而导致血清RBP的降低[2].因此,单一血清RBP值或血清ALB值对妊高征意义不大.妊高征是妊娠期特有的疾病,是严重的妊娠并发症之一,也是严重影响孕妇及胎儿生命安全及生活质量的疾病.本研究对2011年在本院住院治疗的68例妊娠高血压,52例先兆子痫,2例子痫和100名健康孕妇的RBP、ALB值进行分析研究,现报道如下.
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多毛孢菌菌粉抑制庆大霉素诱导的猪肾小管上皮细胞凋亡及纤维化生长因子的表达
目的:研究人工培养的多毛孢菌菌粉水提物对庆大霉素诱导的近端肾小管上皮细胞损伤、凋亡的保护作用及对碱性纤维化生长因子(basic fibro-blast growth factor,bFGF)mRNA表达的影响.方法:将猪近端肾小管上皮细胞株(LLCPK)复苏培养,分成正常对照组、庆大霉素组和多毛孢菌组,除对照组外,用庆大霉素刺激,多毛孢菌组同时加多毛孢菌菌粉水提物干预.以MTT法观测存活细胞数;并测定细胞上清液N-乙酰-β-D-氨基糖苷酶(NAG)浓度;荧光标记细胞表面Annexin V,以细胞流式法测定其表达;RT-PCR检测细胞碱性纤维化生长因子mRNA的表达.结果与结论:庆大霉素可引起细胞存活率的显著降低,N-乙酰-β-D-氨基糖苷酶浓度显著增高;并提高细胞Annexin V的表达,即诱导白细胞调亡,和诱导LLCPK细胞bFGF mRNA的表达.多毛孢菌菌粉水提物能提高肾小管上皮细胞LLCPK存活率,降低细胞调亡数,并显著抑制bFGF mRNA的表达.
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高糖对人肾小管上皮细胞肌醇加氧酶表达的影响
目的:研究高糖环境下人近端肾小管上皮细胞肌醇加氧酶(MIOX)的表达.方法:将人近端肾小管上皮细胞株HK-2分组培养,正常对照组培养基含5.5 mmol/L D-葡萄糖,渗透浓度对照组培养基含19.5 mmoL/L甘露醇和5.5 mmoL/L D-葡萄糖,高糖组培养基含25 mmol/L D-葡萄糖.分别于培养12、24、48、72 h后取出爬片,应用免疫荧光细胞化学法检测MIOX蛋白的表达.结果:正常对照组和渗透浓度对照组HK-2细胞胞质MIOX蛋白微弱表达,各时间点表达量差异无统计学意义(P>0.05).高糖组培养12 h时,HK-2细胞MIOX蛋白表达即增高,随培养时间的延长,MIOX蛋白表达量逐渐升高,于48 h达高峰.高糖组MIOX蛋白表达水平较正常对照组升高(P<0.01).结论:高糖能促进人近端肾小管上皮细胞MIOX的表达,从而介导糖尿病患者体内肌醇耗竭.
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白蛋白胞吞受体及其在近端肾小管胞吞过程中的作用
近端肾小管通过胞吞作用重吸收白蛋白的理论在40余年前就已经被证实[1],其中受体介导的胞吞作用是近端肾小管上皮细胞重吸收和代谢经肾小球滤过的蛋白质及其他营养物质的重要途径[2,3],这个过程受损会直接导致这些物质的丢失和蛋白尿产生.
