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表皮生长因子受体信号途径和非小细胞肺癌个体化诊治进展
非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80％,近年来表皮生长因子受体(EGFR)在肺癌致瘤中的作用以及针对EGFR的靶向治疗备受关注,病理医师在如何筛选合理的EGFR靶向治疗对象及判定检测结果中起着关键作用.本文总结了检测EGFR突变、基因拷贝数、EGFR过表达、磷酸化以及EGFR通路下游靶基因改变在预测NSCLC患者EGFR靶向治疗疗效新研究成果中的价值,同时阐述了KRAS和BRAF突变以及ALK基因重排在肺癌靶向治疗中的作用.
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分子病理检测在非小细胞肺癌诊疗中的意义
病理学是在人类探索和认识自身疾病的过程中产生的,它的发展与自然科学、基础科学的发展和技术进步有着密切联系.近年来,随着细胞生物学、分子生物学、现代免疫学等新兴学科的发展,病理学已经从细胞核亚细胞器水平,深入到分子水平、基因水平去认识疾病,借助分子病理学,病理学家可以获得复杂的肿瘤分子资料,为临床工作者提供患者个体化用药/预测生物标志物以及评估疾病进展的有用信息[1].通过检测基因表达水平(蛋白、mRNA)、基因突变、基因拷贝数与扩增和甲基化等,可以指导精确的个体化治疗,并且用以判定患者的预后.
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荧光定量PCR检测细菌染色体上基因拷贝数
目的建立一种以细菌染色体上1个已知拷贝管家基因作为基准、通过荧光定量PCR检测其他被检基因拷贝数的方法.方法利用荧光定量PCR检测El Tor型霍乱弧菌染色体上目的基因zot与基准基因thyA的Ct(threshold cycle)值差值,根据已知拷贝数菌株N16961的两基因Ct值之差来推算待测菌株中zot基因的拷贝数.结果利用thyA基因作参照,确定11株E1 Tor型霍乱弧菌中zot基因的拷贝数在1～5个之间,对较少拷贝数的检测与Southern blot确认的相同,对多拷贝数检测优于Southern blot的判定.结论本方法可以准确检测菌株染色体上的基因拷贝数.
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广州东部妇女宫颈人乳头瘤病毒16型感染及基因分析
目的 研究广州东部妇女中人乳头瘤病毒16型(HPV-16)宫颈感染分布,分析其早基因E6/E7的多态性,分析L1和E6基因定量与病程的关系.方法 通过导流杂交基因芯片技术检测宫颈脱落细胞的HPV-16感染;通过特异性扩增获取病毒早基因E6/E7序列,克隆测序并进行多态性分析;荧光定量PCR技术对E6基因和L1基因进行定量分析.结果 806例宫颈脱落细胞样本中HPV-16感染阳性36例(4.5%),其中18例(50.0%)宫颈细胞发生高度以上病变;7例(4例低度或以下病变,3例高度以上病变或浸润癌)阳性标本得到E6/g7序列有15个位点分别出现变异;高度病变组(A组,11例)与低度或以下病变组(B组,14例)的L1基因和E6基因定量数据对数值均有显著差异(P<0.05),但L1/E6比值差异无统计学意义(P=0.19).结论 本地区在17～62岁妇女中HPV-16感染阳性发生率约4.5%,50.0%发生高度以上宫颈病变,本研究显示病毒基因拷贝数与宫颈病变程度可能有关,L1/E6比值未能提示病毒整合的发生.
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脊髓性肌萎缩症SMN1基因携带者筛查技术研究进展
1 背景介绍脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是全球常见的致死性常染色体隐性遗传疾病之一,活婴发生率为1/5000～1/10000,人群携带率为1/35～1/50[1].临床上根据SMA发病年龄和病程的不同,将患者分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型及Ⅳ型,其中占患者比例约70％的工型临床表型为严重,常于6个月内起病,多数于2岁内夭折[2].1995年,SMA相关基因被定位于5号染色体长臂1区(5ql1.2～13.3),并发现了反向重复的运动神经元生存基因(survival motor neuron,SMN)[3].该基因有2个序列高度相似的拷贝:靠近端粒的决定性基因SMN1及靠近着丝粒的修饰SMN2,两者之间仅存在5个碱基的差异,而在编码区内只存在1个碱基的差异,即第7号外显子上的840C＞T.由于SMN所在的染色体区域存在众多重复和假基因簇等易导致结构不稳定的序列,导致SMN基因发生缺失或转换的频率较高,相应的表现为人群SMN基因拷贝数组合复杂多变.
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hTERC基因与子宫颈上皮内瘤变相关性的研究进展
子宫颈癌是妇女常见的恶性肿瘤之一,其发病的主要原因是人乳头状瘤病毒(HPV)感染,约90％以上的宫颈癌患者伴有高危型HPV感染.且其发生发展的主要特点是由癌前病变即宫颈上皮内瘤变(CIN)逐步发展形成.所以,宫颈癌的筛查多采用高危型HPV检测和宫颈脱落细胞学检查.但两者均不能达到较高的敏感性及特异性.因此,探索更为有效、方便、敏感性及特异性更高的方法成为当务之急.宫颈细胞由非典型性异常向宫颈癌转变过程中几乎都伴有3号染色体长臂的扩增,其中涉及到的重要基因可能是人类染色体末端酶基因(telomerase human gene,hTERC),其有望成为非典型细胞癌变的基因[1].一、hTERC基因端粒酶是一种核糖核蛋白酶复合物,可以增加染色体末端的端粒重复序列.人类端粒酶RNA (hTERC)基因位于3号染色体26区,hTERC基因及其产物参与维持染色体的长度和稳定性,端粒酶的上调常常与恶性肿瘤的发生相关[1].细胞克隆进展伴随TERC基因拷贝数的增加,导致了端粒酶长度随正常细胞的增殖不断缩短,使癌细胞的增殖超过了正常增殖上限,进而导致了恶性肿瘤的发生[2].
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先天性心脏病遗传学机制的研究进展
先天性心脏病( congenital heart disease, CHD)，是胎儿期心血管发育异常、发育障碍或出生后应该退化的组织未能退化所造成的心血管畸形，是控制心脏发育的基因产生突变以及这些基因在时间(发育阶段)和空间(组织特异性)调控表达异常引起的。CHD是人类常见的出生缺陷疾病，是婴幼儿非感染性疾病中主要的死亡原因[1]。据国外文献报道的数据显示，CHD的发病率为（5.4～16.1）/1000[2]，而国内文献报道的出生缺陷监测结果中，CHD的发病率为25.1/10000[3]。CHD可因心脏结构和血流动力学异常而导致身体运动耐力下降、脑发育延迟、肺动脉高压、心脏扩大、心功能衰竭、艾森曼格综合征、血栓栓塞、亚急性细菌性心内膜炎、心律失常以及死亡[4-6]。近年来，随着对心脏发育分子机制的研究进展，发现了一系列参与心脏发育转录调节、信号传导和形态发生的关键基因，随后遗传学分析证实多个基因参与了CHD的发病[7]。随着对人类全基因组测序的成功和分子遗传学技术的发展，遗传因素在CHD中的作用受到越来越多的重视。因此，识别遗传缺陷对CHD的防治具有重要的临床意义。本文从近年来的CHD分子遗传学机制方面，对染色体异常、单基因突变、基因拷贝数变异(copy number variation，CNV)以及重要的转录调控因子的研究进展综述如下。
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非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因拷贝数与核苷酸切除修复交叉互补基因1和乳腺癌易感基因1的表达及其相关性分析
目的 探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因拷贝数与铂类耐药相关基因核苷酸切除修复交叉互补基因1(ERCC1)和乳腺癌易感基因1(BRCA1)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达情况,以及三者之间的相关性.方法 用荧光原位杂交(FISH)技术检测EGFR基因的扩增情况,应用免疫组化SP法检测132例NSCLC患者标本ERCC1和BRCA1蛋白的表达,并进一步分析EGFR基因拷贝数、ERCC1和BRCA1的蛋白表达与患者临床病理特征的关系.结果 EGFR基因FISH阳性率为24.1% (40/166).女性的扩增阳性率高于男性(31.9%和18.6%,P=0.048);无吸烟史的患者扩增阳性率明显高于有吸烟史的患者(32.8%和16.7%,P=0.045);基因拷贝数增加与患者的年龄、临床分期、病理类型及有无淋巴结或远处转移均无关.ERCC1蛋白表达阳性率为45.5% (60/132),在不同的病理类型分布比较,差异有统计学意义(P=0.046),与患者的性别、年龄、临床分期、有无淋巴结或远处转移及吸烟状况均无关.BRCA1蛋白表达阳性率为35.1%(46/131),与患者的性别、年龄、临床分期、病理类型、淋巴结或远处转移及吸烟状况无关.ERCC1与BRCA1的蛋白表达呈中等相关(r=0.449,P＜0.001),与EGFR扩增无相关性(P=0.785);BRCA1表达与EGFR基因拷贝数状态无相关性(P=0.143).结论 在肺癌的个体化治疗中,检测EGFR基因拷贝数、ERCC1和BRCA1的表达对靶向治疗和铂类药物化疗的选择具有重要的临床指导意义.
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非小细胞肺癌组织中表皮生长因子受体基因突变与拷贝数之间的相关性以及与患者临床病理特征之间的关系
目的 研究中国非小细胞肺癌(NSCLC)患者组织中表皮生长因子受体(EGFR)基因状态，分析EGFR基因突变与拷贝数之间的相关性以及与NSCLC患者临床病理特征之间的关系。方法 应用实时荧光定量PCR法检测118例NSCLC组织中EGFR基因的突变状态，同时采用荧光原位杂交(FISH)技术检测EGFR基因拷贝数。分析EGFR基因突变与拷贝数之间的相关性，探讨EGFR基因状态与NSCLC患者临床病理特征之间的关系。结果118例NSCLC组织中，EGFR基因的突变率为41.5％，其中腺癌为50.0％，鳞癌为5.0％。EGFR基因FISH阳性率为70.3％，其中29例为基因扩增，54例为高度多体性；腺癌FISH阳性率为78.1％，鳞癌为35.0％。EGFR基因突变与EGFR基因高拷贝数主要存在于腺癌、晚期、女性和不吸烟的患者，EGFR基因突变与EGFR基因拷贝数之间有显著的相关性。结论在中国NSCLC患者中，腺癌、晚期、女性、不吸烟的患者EGFR基因突变率和FISH阳性率较高，且二者具有显著的相关性；联合检测EGFR基因拷贝数和基因突变可能更有利于NSCLC靶向药物的筛选。
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毕赤酵母Muts与Mut+重组子表达蝎毒镇痛活性肽BmK AngM1水平比较
蝎毒镇痛活性肽BmK AngM1是从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离得到的一种新型长链蝎毒素,其镇痛活性强且毒性低,有望开发成镇痛新药.本文将BmK AngM1基因转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,筛选得到甲醇利用缓慢型(Muts)和快速型(Mut+)的重组子;采用实时荧光定量PCR方法,检测了Mut+ 重组子中BmK AngM1基因的拷贝数,筛选出含单拷贝BmK AngM1基因的Mut+重组子;在相同培养条件下,比较了含单拷贝BmKAngM1基因的Muts和Mut+重组子表达BmK AngM1的水平.结果表明,Muts重组子中BmKAngM1基因转录水平是Mut+重组子的2.7倍,Muts重组子中BmK AngM1蛋白表达量是Mut+重组子的1.5倍.因此,Muts重组子比Mut+重组子具有更强的BmK AngM1表达能力.
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PCR-荧光探针法在缺失型α-地中海贫血基因诊断中的应用
目的:探讨PCR-荧光探针法在缺失型α-地中海贫血基因诊断中应用的可行性.方法:选取2014年4～6月在该实验室检测的303例样本,经基因DNA提取后,按双盲对照试验,分别采用缺口PCR(Gap-PCR)和PCR-荧光探针法对各样本进行α-地中海贫血基因缺失突变检测,比较两种方法基因诊断的符合率,对两种技术检测结果不吻合的样本采取多重连接探针扩增(MLPA)技术进行验证.结果:应用Gap-PCR技术检测出α--珠蛋白基因缺失突变175例,无α-珠蛋白基因缺失突变128例;PCR-荧光探针法检测出α-地中海贫血基因缺失样本173例,无α-地中海贫血基因缺失样本130例,其中有2个样本与Gap-PCR方法的结果不符合,经MLPA方法验证2个样本结果与Gap-PCR结果一致.与Gap-PCR方法相比,PCR-荧光探针法对α-地中海贫血基因缺失检测的阳性符合率为98.85％ (173/175)、阴性符合率为100.00％(128/128)、Kappa值为0.987,总符合率为99.34％ (301/303).结论:PCR-荧光探针法用于缺失型α-地中海贫血的检测,具有快速、准确、简单实用、高通量低成本等优点,可结合血液学初筛技术应用于缺失型α-地中海贫血基因诊断.
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实时定量PCR法检测转基因CHO细胞中外源抗体轻重链基因的拷贝数
目的 建立实时定量PCR法检测转基因CHO细胞中外源抗体轻重链基因的拷贝数.方法 以分别带有抗体轻链和重链的质粒作为标准品,进行实时定量PCR反应,建立标准曲线.提取转染抗体轻重链基因的CHO细胞基因组DNA,进行定量PCR反应,通过标准曲线,再根据10 ng CHO基因组中含有的单拷贝基因的数量,分别计算得到抗体的轻链和重链基因在CHO细胞中的拷贝数.结果 分别建立了抗体轻链和重链基因的拷贝数标准曲线,标准曲线的相关系数均在0.99以上,PCR扩增效率分别为91.6％和91.8％,具有良好的特异性.随着细胞培养代次的增加,轻链基因和重链基因的拷贝数均出现降低的现象.结论 成功建立了实时定量PCR法检测转基因CHO细胞中外源抗体轻链和重链基因的拷贝数,可用于外源抗体基因在CHO细胞中的遗传稳定性研究,也为高表达细胞株的获得提供了一种检测方法.
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实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数
目的 建立实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的方法 .方法 采用双标准曲线法,分别利用含有GAP基因和绿色荧光蛋白(GFP))基因的质粒,进行实时荧光定量PCR反应,建立标准曲线.将含有外源GFP基因的毕赤酵母基因组进行实时荧光定量PCR,通过标准曲线计算出外源GFP基因在毕赤酵母基因组中的拷贝数.结果 毕赤酵母GAP基因Ct值与起始拷贝数对数的回归方程为:Y=-3.612x+39.28,GFP基因Ct值与起始拷贝数对数的回归方程为:Y=-3.544x+37.99,GAP基因和GFP基因的反应效率分别为0.89和0.90,两条标准曲线的相关系数均为0.999,且均有良好的重复性.检测10个转入GFP基因的毕赤酵母菌株,筛选到9个单拷贝整合GFP基因的菌株和1个多拷贝整合GFP基因的菌株.结论 已建立了检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR法,该方法 能够筛选出不同外源基凶拷贝数的毕赤酵母菌株.
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重组毕赤酵母中Textilinin-1基因拷贝数的荧光定量PCR检测
目的 利用荧光定量PCR检测重组毕赤酵母外源纤溶酶抑制剂Textilinin-1基因的拷贝数.方法 采用双标准曲线法,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因为内源参照基因,分别利用含有GAPDH和Textilinin-1基因的质粒,进行荧光定量PCR反应,建立标准曲线.对重组毕赤酵母基因组进行荧光定量PCR反应,通过标准曲线计算出外源Textilinin-1基因在毕赤酵母基因组中的拷贝数.结果 GAPDH和Textilinin-1基因的扩增效率分别为95.04％和96.36％.两条标准曲线的决定系数均为0.999,且均具有良好的重复性.共检测10个单菌落,均得到Textilinin-1基因拷贝数为2.结论 建立的方法能够鉴定重组毕赤酵母中Textilinin-1 基因的拷贝数.
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类1型-趋化因子配体3和趋化因子配体4基因与艾滋病患者抗病毒治疗后免疫重建的相关性
目的 探讨艾滋病患者血清类1型-趋化因子配体3 (CCL3L1)和趋化因子配体4(CCL4L)基因与抗病毒治疗后免疫重建的相关性.方法 实时定量PCR检测217例艾滋病患者接受抗病毒治疗前CCL3L1和CCL4L基因的表达水平,并与CD4+和CD8+T淋巴细胞计数作相关性分析.CD4+和CD8+T淋巴细胞变化值定义为开始抗病毒治疗后48个月内的月均变化值,变化率定义为抗病毒治疗后48个月时的数值与开始抗病毒治疗前数值比的对数值.组间比较采用方差分析.结果 CCL3L1基因中位数为2(0～8)拷贝,CCL4L基因中位数为3(0～7)拷贝.抗病毒治疗后,在CCL3L1基因为4～8拷贝、2～3拷贝和0～1拷贝组CD8+T淋巴细胞变化值(F=3.054,P＜0.05)、CD4+/CD8+T淋巴细胞变化率(F=3.520,P＜0.05)差异均有统计学意义.CCL3L1基因0～1拷贝组与4～8拷贝组间CD8+T淋巴细胞计数变化值(P=0.023)和变化率(P=0.038)差异有统计学意义.CD4+/CD8+T淋巴细胞变化率在CCL3L1基因为4～8拷贝与2～3拷贝组(P=0.010)、0～1拷贝组(F=4.397,P＜0.05)差异有统计学意义.CD4+/CD8+T淋巴细胞变化率在CCL4L为4～7拷贝组与0～2拷贝组间(P=0.030)、3拷贝组间(P=0.005)差异有统计学意义.随着CCL4L表达由低到高,CD4+/CD8+T淋巴细胞比值变化值随之递增.结论 CCL3L1和CCL4L基因表达可在一定程度上预测艾滋病患者接受抗病毒治疗后免疫重建的能力.
关键词： 获得性免疫缺陷综合征 趋化因子CCL3 趋化因子CCL4 基因拷贝数 免疫重建 -
RNA干扰技术在器官移植免疫中的研究进展
人们早就发现随着细胞内转入基因拷贝数目的增加,其表达水平随之降低,同时内源性同源基因也被转入的基因所抑制.目前已阐明这种抑制的主要机制就是RNA干扰(RNA interference,RNAi),现在认为RNAi是一种原始的细胞免疫机制和基因表达的调控机制,对于维持生物体基因组稳定性非常重要.
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小儿支原体肺炎肺泡灌洗液病原体基因拷贝数和临床表型的关系
肺炎支原体已成为儿童社区获得性肺炎十分重要的病原,近年来重症肺炎支原体肺炎(MPP)及难治MPP报道日益增多,多合并胸腔积液、肺实变、肺不张甚至肺坏死等肺部严重病变,可遗留支气管扩张、闭塞性支气管炎、单侧透明肺等肺部后遗症.2014年8月-2015年8月作者收治了确诊为重症或难治性MPP患儿50例,行电子支气管镜检查及肺泡灌洗术,并检查BALF中MP-DNA拷贝数,分析其菌量与其临床表型(持续高热、CRP显著升高、胸部影像学检查示肺不张和/或胸腔积液,严重气道黏膜损伤发生率)的关系.
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应用荧光原位杂交方法检测鼻咽癌细胞系中EGFR基因拷贝数变化
目的 检测鼻咽癌细胞系中表皮生长因子受体(EGFR)基因拷贝数扩增情况.方法 以人鼻咽癌细胞系CNE-1、CNE-2、HONE-1、 SUNE-1、HNE-1、HNE-2作为研究对象.应用探针LSI EGFR SpectrumOrange/CEP 7 SpectrumGreen probe(Vysis,Abbott Laboratoriesm,IL)以荧光原位杂交(FISH)方法进行EGFR基因拷贝数的检测.结果 经FISH法检测的6株鼻咽癌细胞株中,HNE-2存在基因扩增,其余细胞系为三倍体或多倍体.结论 鼻咽癌细胞系中存在EGFR基因拷贝数的扩增,能否作为酪氨酸激酶抑制剂有效的分子标记,值得进一步研究.
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IL-9和IL-10基因拷贝数与银屑病发病的相关性
目的:确定白介素-9(IL-9)和白介素-10(IL-10)基因拷贝数与银屑病发病的相关性.方法:采用RT-PCR对424例银屑病患者和424名健康者的IL-9和IL-10基因拷贝数变异进行检测和比较.结果:银屑病患者的IL-9和IL-10基因拷贝数较健康人基因拷贝数显著增高 (P<0.05).结论:IL-9和IL-10基因拷贝数增加可能会增加对银屑病的易感性.
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基因拷贝数定量检测在缺失型α-地贫快速诊断中的应用
目的 探讨目的基因拷贝数定量检测方法在缺失型α-地中海贫血快速诊断中的应用.方法 采用四重荧光定量PCR方法检测1 385例α-地中海贫血样本的α珠蛋白基因拷贝数,同时用gap-PCR法进行平行对照检测,对结果不符样本采用MLPA法进行确认. 结果 1 385例临床样本中,本方法检出αα/αα型531例、α-/αα型168例、-α/αα型93例、α-/α-型7例、-α/-α型2例、--/αα型558例、--/α-型13例、--/-α型11例、--/--型2例;其中与gap-PCR法结果不符的样本9例,MLPA复核结果显示5例检测结果一致、4例与多重荧光定量PCR结果不一致;拷贝数定量PCR法检测准确度达到99.71％,与gap-PCR检测符合率达到99.35％. 结论 α珠蛋白基因拷贝数定量PCR法能快速准确检测缺失型α-地中海贫血,适合大规模人群的缺失型α-地贫基因携带筛查.
