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急性淋巴细胞白血病耐药细胞株的建立及耐药机制的研究
目的:构建耐阿霉素的急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞株,并探讨其耐药机制.方法:采用阿霉素(ADR)小剂量浓度递增间歇诱导SUP-B15(Ph+)和RS4;11(Ph-)细胞,建立SUP-B15/ADR和RS4;11/ADR耐药细胞株;应用CCK-8法检测细胞的活力与增殖;Western blot检测P-糖蛋白(P-gp)的表达;RT-PCR检测MDR1基因的表达.结果:成功构建ALL耐药细胞株SUP-B15/ADR和RS4;11/ADR,耐药指数分别为14.088±0.763和10.473±1.024.冻存的SUP-B15/ADR和RS4;11/ADR细胞复苏后,细胞存活率分别为88.4±1.2％和89.3±1.6％,耐药指数分别为13.976±0.967和10.342±0.846,与冻存前相比差异无统计学意义(P＞0.05).撤药培养1个月,2株细胞的耐药指数明显降低,分别为12.893±1.255和9.327 ±0.321(P＜0.05).SUP-B15/ADR和RS4;11/ADR细胞对阿糖胞苷的耐药指数分别为3.459±0.451和3.992±0.795,对依托泊苷的耐药指数分别为3.564±0.365和3.654±0.251.MDR1和P-gp在耐药细胞中的表达较亲本细胞增高.结论:小剂量浓度递增间歇诱导法可成功诱导出ALL耐阿霉素细胞株,其耐药机制是上调MDR1与P-gp的表达.
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人大肠癌HCT-8/5-FU耐药细胞株的建立及P-gp测定
目的:建立人大肠癌多药耐药细胞株HCT-8/5-FU及并对其耐药机制进行探讨.方法:先采用较大剂量间歇诱导法进行筛选,再采用浓度梯度递增法作用,历时7 mo,至HCT8细胞可长期在5-FU浓度为2.0 mg/L的细胞培养液中稳定生长.电镜、HE染色观察2种细胞形态结构差异.体外细胞毒性实验观察他对5-FU, ADM,DDP的耐药性.绘制亲本细胞和耐药细胞的体外生长曲线.罗丹明染色法检测其两种细胞P-gp功能表达.结果:HCT-8细胞株经7 mo诱导,可在5-FU 2.0 g/L的培养液中稳定增殖,具有多药耐药性,命名为HCT-8/5-FU,该细胞株对5-FU的耐药指数为16.6,并对ADM,DDP有交叉耐药性.该细胞株体外群体倍增时间与亲本细胞差别不显著.HE染色观察耐药细胞胞体较亲本细胞大,细胞核不规则,可见双核、多形核,细胞形态不规则,呈多角形、细长形改变,可见巨核细胞.透射电镜下耐药细胞胞质内线粒体、内质网、溶酶体增多.流式细胞仪罗丹明染色法观察荧光强度曲线左移,提示耐药细胞有过度P-gp表达.结论:成功建立HCT-8/5-FU多药耐药细胞株.先采用较大剂量间歇诱导进行筛选,再采用浓度梯度递增法作用是诱导大肠癌耐药细胞株的较好方式.HCT-8/5-FU细胞株的耐药机制与P-糖蛋白表达有关.
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XIAP在急性髓系白血病患者及其细胞株中的表达及意义
急性髓系白血病(AML)为第一位的恶性血液系统肿瘤。近年来，通过化疗此类患者的生存率已明显提高，但随之而来的是化疗所导致的耐药。凋亡抑制基因的过度表达是肿瘤发生耐药的主要机制之一，其中XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein)在包括AML在内的许多恶性肿瘤中的过表达预示预后较差[1-2]。本研究以初治、复发AML患者及正常人为研究对象，同时选用HL-60、K562及HL-60/ADR、K562/ADR(阿霉素诱导)耐药细胞株，通过检测XIAP 的表达，来观察正常人与AML患者之间、耐药与非耐药细胞株之间XIAP表达的差异及意义。
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转基因法建立膀胱癌耐药细胞株
目的用转基因法建立膀胱癌耐药细胞株,研究细胞耐药机制. 方法利用脂质体(DOTAP)介导的基因转移方法,在浸润性膀胱癌细胞株T24中转入mdr1全长cDNA,经阿霉素筛选,获得耐药的T24细胞株TADM;免疫组化、MTT、流式细胞仪、基因组PCR、RT-PCR等方法鉴定TADM的耐药表型. 结果 TADM细胞的相对耐药指数为41.6,基因组中有mdr1 cDNA插入,P-糖蛋白及mdr1 mRNA表达增加. 结论 TADM细胞具有良好的耐药表型,其耐药性的产生是由mdr1全长cDNA稳定整合在T24细胞基因组中,大量表达P-糖蛋白引起.转基因法建立膀胱癌耐药细胞株具有耗时短、耐药强度高而稳定等特点.
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转染核因子κB decoy寡核苷酸在肝癌耐药细胞株的定位及对其活性的影响
本研究我们通过阿霉素逐步诱导肝癌HepG2细胞,建立稳定表达MDR1的肝癌耐药细胞株HepG2/ADM,转染核因子(NF-κB) decoy寡核苷酸,观察NF-κB在肝癌耐药细胞株转染前后的动态变化.
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短发夹状RNA抑制MDR1基因表达逆转卵巢上皮性癌多药耐药的研究
多药耐药性的产生是导致肿瘤化疗失败的重要原因.多药耐药基因MDR1及其所编码的细胞膜P糖蛋白(P-gp)表达增加介导的耐药在化疗中为主要、为常见.在过去20多年中,学者们探求各种逆转多药耐药的方法,如反义寡核苷酸技术、核酶技术等,取得了一定的成果.RNA干扰(RNAi)技术抑制MDR1基因表达是研究逆转多药耐药的新途径.本研究设计并构建针对人MDR1基因特定位置的短发夹状RNA(shRNA)质粒pEGFP-H1/MDR1,观察其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)紫杉醇耐药细胞株MDR1基因和P-gp表达的抑制作用,探索耐药肿瘤基因治疗的有效方法.
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雷公藤内酯醇对人多发性骨髓瘤细胞耐地塞米松细胞株的实验研究
我们前期的研究表明,雷公藤内酯醇(triptolide,TPL)在体外能诱导多发性骨髓瘤(MM)细胞系RPMI 8226和U266细胞的凋亡,而对正常骨髓单个核细胞无明显的细胞毒作用[1].但TPL对骨髓瘤耐药细胞株是否有作用尚不清楚.因此,我们以人MM耐地塞米松细胞株MM.1R细胞及其敏感株MM.1S细胞为研究对象,观察TPL对耐药细胞株的作用以及是否与地塞米松(Dex)有协同作用.
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K562/A02耐药细胞NF-κB活性测定及葛根素部分逆转耐药效应的初步研究
白血病细胞的多药耐药(MDR)的产生是导致化疗失败的主要原因.目前发现MDR的产生机制是多因素的,且有不同的耐药表型.核转录因子Kappa B(NF-κB)在细胞增殖和凋亡中起关键调控作用.为明确NF-κB是否与细胞MDR产生有关及葛根素是否通过抑制NF-κB活性而逆转耐药,我们观察了慢性粒细胞白血病急变细胞株K562及其耐药细胞株K562/A02的NF-κB活性,P糖蛋白(P-gp)、耐药相关蛋白(MRP)表达情况,以及葛根素干预前后NF-κB活性,P-gp、MRP表达的变化,为揭示白血病细胞耐药机制,寻求有效的逆转耐药药物提供实验依据.
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阿霉素和吡喃阿霉素对K562/A02细胞体外抑制作用的比较
蒽环类抗生素阿霉素(ADM)、吡喃阿霉素(THP)等是临床上常用的化疗药物.为阐明THP在耐药白血病治疗中的作用,我们以K562/A02耐药细胞株为研究对象,采用MTT法观察了ADM和THP对K562/A02细胞株体外的抑制作用的差异.
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多发性骨髓瘤耐药细胞株核基质蛋白的变化
为进一步阐明多发性骨髓瘤(MM)细胞的耐药机制,我们从核基质蛋白(nuclear matrix protein,NMP)水平研究MM细胞的多药耐药(MDR)机制.
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黄独乙素对人胃癌SGC-7901细胞及其耐药细胞株体外抑制作用的研究
目的：研究黄独乙素（Diosbulbin B）对人胃癌SGC-7901细胞与其耐药细胞株的体外抑制作用。方法采用药物浓度递增法诱导人胃癌SGC-7901细胞，分别建立其顺铂、5-FU、阿霉素的耐药细胞株，应用MTT法检测黄独乙素对SGC-7901、SGC-7901/顺铂、SGC-7901/5-FU及SGC-7901/阿霉素的增殖抑制率，比较黄独乙素对以上四种细胞株的增殖抑制率是否有差异。结果黄独乙素对人胃癌SGC-7901细胞及其顺铂、5-FU、阿霉素耐药细胞株均表现出一定程度的剂量依赖性的增殖抑制作用（P＜0.05），加入黄独乙素后人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制率与其顺铂、5-FU、阿霉素耐药细胞株的增殖抑制率近似（P＞0.05）。结论黄独乙素对人胃癌SGC-7901细胞株表现出较低的交叉耐药性，能够在该细胞对顺铂、5-FU、阿霉素产生耐药后同样发挥增殖抑制作用。
关键词： 黄独乙素 人胃癌SGC-7901细胞 耐药细胞株 交叉耐药性 体外抗肿瘤活性 -
莪术油与SKOV-3和SKOV-3/DDP增殖的量效时效关系
卵巢癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，其致死率居妇科恶性肿瘤之首［1］，已成为严重威胁女性生命健康的疾病。卵巢癌治疗以手术为主，辅以放、化疗。又因卵巢癌早期诊断困难，疾病进展迅速，确诊时多属晚期，故其治多依赖化疗。然而化疗药物毒副作用大，化疗耐药常致卵巢癌高复发率、高病死率。研究显示即使初次治疗有效率可达70％，很多患者仍因耐药导致复发、死亡［2］。美国国立癌症研究所监测流行病学及结果数据库资料显示，近30年卵巢癌5年生存率不足40％［3］。统计显示，美国卵巢癌年新发约2．2万例，死亡约1．4万例［4］；我国卵巢癌年新发约5．5万例，死亡约2．3万例［5］。近年来中药成分抑制肿瘤细胞增殖的研究广受关注。中药成分多元、药理作用广泛，可以在多层次、多靶点发挥抑制增殖的作用，且毒副作用小，同时还具有协同治疗肿瘤的作用。研究证实莪术油能抑制人卵巢癌敏感细胞株（SKOV）-3增殖，发挥抗肿瘤作用［6］。本实验以SKOV-3和SKOV-3/DDP为研究对象，采用四甲基偶唑蓝比色法（MTT），研究莪术油能否抑制SKOV-3/人卵巢癌耐药细胞株（DDP）增殖及药物浓度和作用时间与SKOV-3和SKOV-3/DDP增殖的关系。
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莪术油协同卡铂对人卵巢癌耐药细胞株增殖的影响
卵巢癌化疗多采用铂类为基础的联合化疗，目前铂类药物多用卡铂，卡铂是继顺铂的二代铂类化合物，对顺铂耐药株有抑制作用，但因二者生化特性相似，存在交叉耐药，影响了卡铂的临床疗效。如何增加卡铂对顺铂耐药个体的敏感性值得探究。研究证实莪术油可以增加人卵巢癌耐药细胞株SKOV-3/DDP对顺铂的敏感性，增加顺铂对SKOV-3/DDP的细胞毒性［1］。基于此探讨莪术油能否增加SKOV-3/DDP对卡铂的敏感性、增大卡铂对SKOV-3/DDP的细胞毒性就有一定的实验基础和临床意义。本实验以人卵巢癌敏感细胞株SKOV-3及其耐药细胞株SKOV-3/DDP为研究对象，采用噻唑蓝（MTT）法，研究莪术油协同卡铂对SKOV-3/DDP增殖的影响。
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口腔鳞癌亲本细胞株与耐药细胞株蛋白谱差异
目的 探讨人口腔鳞癌体外培养亲本细胞株KB与耐药细胞株KBV200的蛋白质表达差异.方法 在体外培养KB及KBV200细胞株,采用表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术(SELDI)及蛋白质芯片技术检测KB及KBV200蛋白质谱.结果 体外培养的口腔鳞癌亲本细胞株与耐药细胞株的蛋白质存在差异表达,CM-10芯片共捕获102个蛋白,发现差异峰19个,其中15个差异蛋白在KBV200细胞中高表达,4个差异蛋白在KBV200细胞中低表达.结论 SELDI蛋白芯片技术检测口腔鳞癌亲本细胞株与耐药细胞株蛋白质的差异表达方法 简便、敏感、重复性好.
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人淋巴瘤Raji/DEX耐药细胞株的建立及其耐药机制
目的 建立人淋巴瘤耐药细胞株Raji/地塞米松(DEX)并对其耐药机制进行探讨.方法 分别采用噻唑蓝还原法(MTT)确定Raji细胞的半数抑制浓度(IC50)值,DEX浓度递增和持续作用的方法体外诱导Raji细胞的耐药性并检测其耐药指数,Westem blot法检测人核转录因子p65(NF-κBp65)蛋白.结果 历时3个月后建成的细胞株Raji/DEX增殖速度减慢,体积变小,且对DEX低度耐药,耐药指数为1.7(P＜0.05);Raji/DEX的NF-κBp65蛋白表达显著高于Raji亲本细胞(P＜0.05).结论 成功建立Raj∥DEX耐药细胞株.NF-κBp65蛋白表达增强可能是淋巴瘤细胞产生获得性耐药的主要机制之一.
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Hedgehog信号通路相关蛋白在人胰腺癌SW1990耐药株中的表达及意义
目的;探讨Hedgehog信号通路蛋白在人胰腺癌吉西他滨耐药细胞株SW1990中的表达,为克服胰腺癌获得性耐药提供实验基础.方法:采用浓度梯度递增法建立人胰腺癌SW1990耐药株,采用噻唑蓝法测定SW1990亲代与耐药细胞IC50.实时荧光定量PCR检测亲代与耐药细胞mRNA中hedgehog信号通路成员Shh 、SMO 、Gli-1的表达差异.Western印迹法检测亲代与耐药细胞中上述蛋白质的表达.结果:人胰腺癌耐药株SW1990的IC50从亲代的(3.1±0.2) μmol/L提高到(232.2±12.3) μmol/L.荧光定量PCR结果显示耐药株中Shh 、Gli-1的表达提高了(12.07±1.71)倍和(4.15±0.42)倍.亲代SW1990中未检测到SMO表达,而耐药细胞中却可以检测到SMO的表达.Western印迹结果同样显示,人胰腺癌SW1990耐药细胞株中高表达上述蛋白质.结论:人胰腺癌耐药株中高表达部分hedgehog信号通路蛋白.针对hedgehog信号通路的靶向治疗可能为克服胰腺癌耐药提供新的理论基础.
关键词： 胰腺癌 耐药细胞株 Hedgehog信号通路 -
胶质瘤耐药细胞株的建立及其继发性耐药相关基因的筛查
目的: 构建胶质瘤耐替尼泊苷(teniposide,又称VM-26)细胞株,利用基因芯片筛查该细胞株继发性耐药相关基因并证实其表达.方法: 选用人胶质瘤细胞系SHG44为靶细胞,从低剂量起始逐步递增用药量(每4 000个细胞VM-26剂量由0.135 ng至4.5 ng)诱导建立对VM-26耐药的细胞株,绘制亲代细胞系和耐药细胞株增殖曲线比较两者倍增时间,采用细胞毒性实验计算半数抑制浓度(IC50)比较两者耐药程度的差异.应用人类cDNA表达谱芯片检测耐药和敏感细胞基因表达谱的变化,筛查出与耐药有关的基因并经半定量RT-PCR验证.结果: 经过72代诱导培养,建立了稳定耐药的细胞株SHG44/VM-26,耐药性是亲代细胞的52.6倍;耐药细胞倍增时间明显长于亲代细胞(25.6 vs 48.9 h);cDNA芯片筛选出11个基因表达上调,42个基因表达下调;半定量RT-PCR证实基因MDR1、NGFR、HSP22、CX IX、CDKN3和NADE的表达与基因芯片结果基本一致.结论: 成功建立胶质瘤耐替尼泊苷细胞株SHG44/VM-26,该细胞株的继发性耐药与基因MDR1、NGFR、HSP22的高表达和CX IX、CDKN3和NADE的低表达相关.
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"乳癌术后方"拮抗乳腺癌三苯氧胺治疗耐药的体外实验研究
目的:观察乳癌术后方对乳腺癌三苯氧胺(TAM)耐药细胞株的生长抑制作用,探讨乳癌术后方对乳腺癌TAM治疗耐药的拮抗作用.方法:构建乳腺癌TAM耐药细胞株(MCF-7/TAM),以噻唑蓝(MTT)法检测细胞耐药性.取雌性SD大鼠,卵巢去势后随机分为对照组、TAM组、中药组、TAM+中药组,分别灌胃给予相应药物或生理盐水3d后取血清.各组血清分别作用于MCF-7/TAM细胞,培养2、4、6、8、10d后,MTT法测定各组各时段OD值.结果:成功构建MCF-7/TAM细胞株,耐药指数为8倍.经各组血清培养2d时4组细胞OD值差异无统计学意义(P>0.05);4d时TAM组、TAM+中药组OD值明显低于对照组(P<0.05),但TAM组和TAM+中药组、对照组和中药组OD值比较无统计学差异;培养6、8、10d时TAM+中药组、TAM组、中药组细胞OD值均明显低于对照组(P<0.05),且TAM+中药组、TAM组、中药组值依次增高,组间差异有统计学意义(P<0.05).随着培养时间的延长,中药乳癌术后方逐渐发挥拮抗TAM耐药作用,其与TAM联用较单用TAM更能抑制MCF-7/TAM细胞的生长.结论:乳癌术后方与TAM联用对乳腺癌TAM耐药细胞株有协同作用,可拮抗乳腺癌TAM耐药的发生.
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miRNA在乳腺癌耐药细胞株中的表达研究
目的 分析miRNA34a和miRNA200c在人乳腺癌细胞MCF-7和耐药株中的不同表达,探讨miRNA在乳腺癌MDR中的调节作用及其分子机制.方法以人乳腺癌细胞株 MCF-7为亲本细胞,采用阿霉素(adriamycin,Adr)及多西紫杉醇(docetaxel,Doc)低浓度持续加量诱导法建立多药耐药的人乳腺癌细胞株MCF-7Adr及MCF-7Doc.应用real-time RT-PCR法对miRNA检测并比较其在MCF-7和多药耐药细胞株MCF-7Adr及MCF-7 Doc间的表达差异.结果 real-time RT-PCR结果显示,miRNA200c的表达在MCF-7Adr及MCF-7Doc细胞中较MCF-7细胞中显著降低(均P<0.01);miRNA34a的表达在MCF-7Adr细胞中较MCF-7细胞中显著降低(P<0.01),在MCF-7Doc中两者无明显差异(P>0.05).结论 miRNA在乳腺癌多药耐药细胞和其亲本细胞中有表达差异,可能参与了乳腺癌多药耐药的发生.
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水飞蓟素逆转人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM耐药性实验研究
目的 观察水飞蓟素(Silymarin,Sily)对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM的逆转耐药作用.方法 以CCK-8法测定阿霉素(Adm)对人乳腺癌敏感细胞株MCF-7/S和耐药细胞株MCF-7/ADM的毒性作用,计算出耐药倍数.以无细胞毒性的Sily(10μg/mL)作为逆转耐药剂,联合Adm观察其对耐药细胞株MCF-7/ADM的逆转耐药作用,计算得逆转倍数.结果 (1)Adm对MCF-7/S和MCF-7/ADM的半数抑制浓度(IC50)分别为1.773μg/mL和43.812μg/mL,耐药倍数为24.7倍.(2) Sily能够增强ADM对MCF-7/ADM的细胞毒作用.以10μg/mL(抑制率为2.0%)的Sily联合Adm作用于MCF-7/ADM 48h后,耐药细胞株的IC50降至7.798μg/mL,逆转倍数为5.6倍(P<0.01).结论 Sily能够逆转人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADM的耐药性.
