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髓样分化因子88与人卵巢癌紫杉醇耐药细胞系A2780/Taxol耐药性相关
目的 本研究希望通过外源改变MyD88的表达,明确其与紫杉醇耐药的相关性,检测MyD88对细胞生物学活性的影响.方法 通过在A2780/Taxol细胞中敲低和过表达MyD88后,利用real-time PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测MyD88的表达变化；CCK-8法检测细胞转染前后对紫杉醇耐药性的变化,流式技术检测MyD88对细胞周期和凋亡的影响.结果 敲低MyD88表达水平,耐药细胞系A2780/Taxol对紫杉醇的耐药性明显降低(P＜0.01),抗凋亡能力减弱(P＜0.01)；过表达MyD88后,细胞对紫杉醇耐药性增加(P＜0.05).结论 抑制卵巢癌细胞中MyD88的表达,能促进耐药细胞系对紫杉醇的敏感性,为临床卵巢癌耐药患者以MyD88为靶向的基因治疗提供了新思路和手段.
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紫杉醇耐药人胃癌细胞HGC-27/PTX的建立及其特征鉴定
目的 建立紫杉醇(PTX)耐药人胃癌细胞HGC-27/PTX,探讨耐药前后细胞特征的变化并初步分析紫杉醇耐药机制.方法 逐步递增紫杉醇浓度并间歇作用于人胃癌细胞系HGC-27,建立紫杉醇耐药细胞HGC-27/PTX.用CCK-8及流式细胞仪检测细胞的半数抑制浓度(IC50)及细胞周期分布,RNAseq法筛选紫杉醇耐药前后差异表达基因及通路.结果 9个月后,相同浓度紫杉醇对HGC-27/PTX细胞的增殖抑制作用较亲本HGC-27细胞明显减弱(P<0.05),耐药细胞的形态较亲本细胞略有不同.与亲本HGC-27细胞相比,HGC-27/PTX细胞的S期及G2/M期细胞比例明显增多(P<0.01).HGC-27/PTX细胞较亲本HGC-27细胞具有274个显著差异表达基因(DEGs),表达上调与下调基因分别有130个和144个,差异基因主要富集在ECM-receptor interaction通路(P<0.001)和PI3K-Akt信号通路(P<0.05),这为逆转紫杉醇耐药提供有力线索.结论 成功建立紫杉醇耐药胃癌细胞HGC-27/PTX并可体外稳定传代,为深入研究耐药机制提供了理想的体外实验模型.
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TLR4/MyD88信号通路介导卵巢癌紫杉醇耐药机制的研究进展
卵巢癌(epithelial ovarian cancer)是病死率高的妇科恶性肿瘤.目前,手术加以紫杉醇为基础的联合化疗仍然是卵巢癌的主要治疗方法,但化疗耐药制约着卵巢癌患者的长期生存,而紫杉醇耐药是卵巢癌复发的主要原因之一[1-2].
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卵巢上皮性癌紫杉醇耐药及治疗策略的思考
近年来，对卵巢上皮性癌（卵巢癌）紫杉醇耐药及其机制的研究不断深入，但无论是何种机制，均与卵巢癌治疗中的紫杉醇相关靶标分子和信号通路有关。紫杉醇自1992年被美国食品药品管理局（FDA）批准用于卵巢癌治疗至今，所获得的益处已经到了上升的平台期或者说遇到了瓶颈。卵巢癌紫杉醇耐药新机制的发现对现有化疗模式提出了挑战和再思考。尽管卵巢癌对以紫杉醇为基础的联合化疗的反应率较高，但其复发的风险仍居高不下，且大约80%的患者终将产生化疗耐药，导致再次化疗失败[1]。这使临床工作者感到束手无策或望而却步，同时对药物研发者也是1个十分严峻的挑战。毋庸置疑，临床工作中迫切需要了解哪些患者会在紫杉醇化疗中获益，哪些会出现耐药？只有解决了这个问题，卵巢癌化疗的个体化才能实现。因此，揭示究竟什么是导致卵巢癌紫杉醇耐药的“元凶”，对于促进临床治疗策略的创新显得尤为重要。
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多西他赛解救治疗紫杉醇耐药的转移性乳腺癌的临床研究
目的 评价多西他赛解救治疗紫杉醇耐药复发转移性乳腺癌的临床疗效.方法 回顾性分析60例多西他赛治疗紫杉醇耐药的复发转移性乳腺癌患者的临床资料,对临床疗效及其影响因素等进行统计分析.结果 全组患者中位年龄51岁.雌/孕激素受体阳性率65%,Her-2状态阳性率28.3%.多西他赛解救治疗紫杉醇耐药的复发转移性乳腺癌患者,客观缓解率为18.3%,临床获益率25.0%,中位PFS 4.0个月(3.38～4.62个月);耐药亚组分析结果显示原发耐药组与继发耐药组的客观缓解率及临床获益率无明显统计学差异(P=1.000;P=0.762),但多西他赛治疗紫杉醇耐药复发转移性乳腺癌继发耐药组的无进展生存期(PFS)要优于原发耐药组(2个月vs 6个月,P=0.008).COX多因素分析显示多西他赛PFS与单位体表面积剂量、年龄、病理类型、Her-2状态、雌/孕激素受体表达状态、同侧腋窝淋巴结转移数目、复发转移部位数目等因素均无关,但与耐药情况、无病生存期、解救治疗线数、临床分期(P=0.001;P=0.029;P=0.037;P=0.034)等因素相关.结论 紫杉醇耐药患者接受多西他赛解救治疗仍可获得一定的客观缓解率及临床获益率,二者部分交叉耐药.
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错配修复基因2与卵巢癌紫杉醇化疗耐药相关性研究
目的 检测人类错配修复基因2 (human mismatch repair gene2,hMSH2)在卵巢癌紫杉醇耐药细胞株及卵巢癌组织中蛋白表达的变化,探讨其与卵巢癌紫杉醇化疗耐药的相关性.方法 选用卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TAX及敏感细胞株SKOV3,选取北京世纪坛医院2010-01-01-2014-06-30卵巢癌患者石蜡标本58例,其中紫杉醇化疗后复发行二次手术的患者标本19例(化疗组),术前未化疗患者39例(未化疗组).采用免疫组化二步法,检测卵巢癌细胞及组织中hMSH2蛋白表达.结果 耐药细胞株SKOV3/TAX中hMSH2蛋白表达强度为50 214.64±27 218.39,明显高于敏感细胞株SKOV3的11 791.79±7 385.98,P=0.016;卵巢癌组织中化疗组hMSH2蛋白表达累积光密度值为74 322.52±27 162.82,较未化疗组的57 244.96±24 332.86明显增加,P=0.019;化疗组及未化疗组两组患者在病理分级(P=0.366)、病理类型(P=0.768)和手术病理分期(P=0.533)差异均无统计学意义;全部卵巢癌组织中hMSH2蛋白表达在病理分级(P=0.161)、病理类型(P=0.649)和手术病理分期(P=0.519)中的分布差异均无统计学意义.结论 错配修复基因hMSH2在卵巢癌紫杉醇耐药细胞株及组织中表达上调可能与紫杉醇耐药机制有关.
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X射线对人肺腺癌A549细胞顺铂及紫杉醇耐药相关基因表达的影响
目前放化疗综合治疗已成为肺癌常用的治疗手段.再次或多次化疗可以诱导多药耐药导致肿瘤的化疗敏感性降低已无异议,但目前放疗后耐药基因及其蛋白表达情况及相应的放疗对化疗敏感性的影响这方面的研究较少,结果也不一致.
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Transgelin 2在人乳腺癌紫杉醇耐药和侵袭转移中作用的研究
目的 探讨transgelin 2在人乳腺癌紫杉醇耐药细胞(MCF-7/PTX)紫杉醇耐药和侵袭转移中的作用.方法 在倒置显微镜下观察细胞的形态;采用MTT法测定细胞活性;运用Western blot和Real-time PCR检测细胞中transgelin 2,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin的蛋白和mRNA表达;通过细胞划痕和Transwell侵袭实验分别测定细胞的迁移和侵袭能力;运用小干扰RNA技术降低MCF-7/PTX细胞中transgelin 2的表达.结果 MCF-7/PTX细胞发生EMT过程,并具有较强的耐药和侵袭迁移能力;干扰transgelin 2后,增强MCF-7/PTX细胞对紫杉醇的敏感性,抑制它们的侵袭和迁移能力.结论 高表达transgelin 2不仅能够诱导MCF-7/PTX对紫杉醇的耐药,还能促进侵袭转移的发生,提示transgelin 2可望成为乳腺癌新的肿瘤标志物及治疗靶点.
关键词： transgelin 2 乳腺癌 紫杉醇耐药 侵袭 转移 -
真核表达质粒pcDNA 3.1/EGR-1的构建和体外效应研究
目的 构建早期生长反应基因(early growth response gene-1,EGR-1)真核表达载体,体外观察其对卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/Taxol的影响.方法 将EGR-1基因重组于pcDNA 3.1质粒中,稳定转染A2780/Taxol细胞,流式细胞仪检测转染对A2780/Taxol细胞凋亡的影响;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察A2780/Taxol细胞对紫杉醇的半数抑制浓度(IC50);RT-PCR检测转染前后EGR-1及MDR1 mRNA的表达水平.结果 经酶切和测序鉴定,成功构建质粒peDNA 3.1/EGR-1;RT-PCR显示,外源性EGR-1基因已整合于A2780/Taxol细胞并获稳定表达;转染使细胞凋亡明显增加(P<0.01);恢复A2780/Taxol细胞对紫杉醇药物敏感性;MDR1 mRNA表达显著下调.结论 转染EGR-1可降低A2780/Taxol凋亡的阈值和下调MDRl的表达,从而减少A2780/Taxol细胞对紫杉醇的耐受性.
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紫杉醇耐药与敏感细胞的差异表达蛋白分析
目的 比较人肺腺癌细胞系A549与肺腺癌紫杉醇耐药细胞系A549-Taxol的差异表达蛋白.方法 提取A549和A549-Taxol总蛋白,应用双向凝胶电泳技术(2-DE)分离,ImageMaster 5.0软件分析并筛选出两者间差异表达的蛋白点,质谱分析加以鉴定.结果 获得分辨率高且重复性好的肺腺癌耐紫杉醇细胞系及亲代细胞系2-DE图谱.ImageMaster软件分析差异大于2倍的蛋白质点共有80个,其中33个在耐药细胞系中上调,47个下调.质谱分析鉴定出19种差异表达蛋白,其中A549-Taxol中上调蛋白11种,涉及细胞骨架蛋白、代谢酶类、分子伴侣和信号转导相关蛋白质.结论 应用2-DE技术整体展示了紫杉醇耐药细胞系及敏感细胞系的蛋白表达谱,质谱法鉴定的差异蛋白为进一步从多因素角度研究紫杉醇耐药机制提供了新线索.
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DHA 逆转卵巢癌细胞 A2780／T 紫杉醇耐药的机制研究
目的：探讨二十二碳六烯酸（ DHA）对卵巢癌耐药细胞的耐药逆转作用及其机制。方法：利用MTT评估细胞对紫杉醇耐药性的改变，罗单明实验验证细胞的药物外排能力，流式细胞仪检测细胞周期的分布，实时定量PCR及蛋白质印迹检测多药耐药蛋白1（ MDR1）的mRNA水平、耐药相关蛋白及通路蛋白的蛋白水平。结果：DHA作用48 h后A2780／T对紫杉醇的半数抑制率（ IC50）下降（ P＜0.05），且罗丹明在胞内的含量增加，呈剂量依赖性（ P＜0.05）。同时紫杉醇与DHA联合使用可以改变细胞周期的分布，GO／G1期的细胞百分比上升（P＜0.05），P-糖蛋白（P-gp）及其他MDR相关蛋白的表达下降，NF-κB及磷酸化p38 MAPK表达下降，而p38 MAPK未见明显变化。结论：DHA可以通过改变细胞周期分布，抑制P-gp及MDR相关蛋白的功能和表达，逆转卵巢癌耐药细胞的耐药性，同时该机制还可能与抑制NF-κB通路、抑制p38 MAPK的磷酸化有关。
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PAK5和MDRl/P-gp在卵巢癌细胞紫杉醇耐药中的表达和临床意义
卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其病死率居女性生殖系统肿瘤首位，由于大多数卵巢癌发病隐匿，且缺乏准确有效的早期诊断方法。目前手术联合化疗的综合治疗在一定程度上延长了晚期卵巢癌患者的生存时间，但多数患者在18~24个月后复发，其5年生存率<30%。肿瘤细胞减灭术加以铂类和紫杉醇为基础的联合化疗已成为当前卵巢癌的标准治疗手段。虽然多数患者初始反应敏感，甚至可达到近期缓解，但是由于化疗耐药的产生，限制了化疗药物的抗肿瘤效应，严重影响了卵巢癌患者的远期疗效和总体生存率。以往针对耐药机制进行了一些耐药逆转的研究。但是大多数研究结果均未显示上述方法的有效性。因此，深入探索与化疗耐药相关的细胞及分子生物学机制，寻找有效干预靶点，成为改善化疗效果和解决耐药问题的关键。
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凋亡抵抗与人肝癌细胞对紫杉醇耐药关系的研究
[目的]体外建立紫杉醇（Taxol）耐药的人肝癌细胞株Hep3B/TAX，并以此为模型对凋亡抵抗现象与紫杉醇耐药的相关性进行研究。[方法]采用浓度梯度间歇刺激法建立Hep3B/TAX耐药细胞株，MTT法检测Hep3B/TAX对紫杉醇的耐药性，流式细胞术检测Hep3B/TAX的细胞凋亡水平，荧光定量PCR检测Hep3B和Hep3B/TAX细胞株中Bcl－2、Bax、caspase3、caspase8和caspase9基因的表达水平，蛋白质免疫印迹（Western－blot）检测Hep3B、Hep3B/TAX细胞株中Bcl－2、Bax、caspase3、caspase8和caspase9的蛋白表达。[结果] Hep3B细胞对紫杉醇的IC50为0．2mΜ，而耐药细胞株Hep3B/TAX对紫杉醇的IC50升为4．33μM。耐药指数（RI）为21．65。流式细胞术结果显示，0．1μM、0．2μM紫杉醇处理24h后，亲本细胞Hep3B的凋亡率显著高于耐药细胞株Hep3B/TAX。RT－PCR结果显示，与Hep3B细胞株相比，Hep3B/TAX细胞株中Bcl－2 mRNA的表达量显著升高（P<0．01），而caspase3、caspase8、caspase9和Bax mRNA的表达量显著降低（P<0．01）。Western－blot实验结果显示，与Hep3B细胞株相比，Hep3B/TAX耐药细胞株的抗凋亡蛋白Bcl－2的表达量显著升高，相关促凋亡蛋白caspase3、caspase8、caspase9和Bax的表达量降低。[结论]成功建立紫杉醇耐药的人肝癌细胞株Hep3B/TAX，人肝癌细胞株Hep3B对紫杉醇耐药的产生与改变凋亡相关因子的表达而导致的凋亡抵抗现象有关。
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Lin28与肝癌细胞紫杉醇耐药关系的研究
[目的]Lin28是一种重编程因子和保守的RNA结合蛋白，存在Lin28A和Lin28B两种同源基因，两者结构和功能类似。本研究旨在探讨Lin28与肝癌细胞对紫杉醇耐药的关系。[方法]MTT法检测紫杉醇对HepG2、Hep3B、SMMC-7721肝癌细胞的IC50；用荧光定量PCR法（简称RT-PCR）在RNA水平检测Lin28A和Lin28B在Hep3B、HepG2、SMMC-7721中的表达，蛋白质印迹法分析Lin28A和Lin28B蛋白在Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞中的表达情况。[结果]Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞株对紫杉醇的IC50分别为：Hep3B为0.194μM、HepG2为19.54μM、SMMC-7721为0.444μM。HepG2、SMMC-7721细胞株中的Lin28A基因表达量分别是Hep3B的5.06、3.10倍；HepG2、SMMC-7721细胞株中的Lin28B基因表达量分别是Hep3B的7.16、3.16倍。Hep3B、HepG2、SMMC-7721细胞株中Lin28A和Lin28B蛋白的表达量与从荧光定量数据显示的趋势一致。[结论]Lin28与肝癌细胞对紫杉醇耐药密切相关，肝癌细胞中Lin28表达与肝癌细胞对紫杉醇的耐药性成正比，暗示Lin28表达可能是肝癌细胞紫杉醇耐药的潜在机制并有望成为逆转肝癌紫杉醇耐药的靶点。
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乳腺癌紫杉醇耐药细胞中lncRNA和mRNA表达谱筛选
目的:分析紫杉醇诱导的乳腺癌MCF-7耐药细胞(MCF-7/PR)中长链非编码RNA(lncRNA)和信使RNA(mRNA)表达谱的变化,研究筛选出调控乳腺癌紫杉醇耐药的关键lncRNAs,为逆转紫杉醇耐药的分子靶点提供理论依据.方法:利用ArraystarlncRNA芯片技术检测MCF-7/PR细胞中lncRNAs和mRNAs的表达谱;使用Agilent GeneSpring GX v12.1软件筛选差异表达的lncRNAs和mRNAs,对差异mRNAs进行GO和KEGG通路分析,得到mRNA参与的生物学途径;并同时进行lncRNAs与相应mRNAs联合分析推断lncRNAs功能.结果:通过MCF-7/PR细胞和MCF-7亲本细胞相比,共有1 504个lncRNAs和2264个mRNAs存在差异性表达(差异倍数＞2.0);通过GO聚类分析表明:上调的mRNAs和下调的mRNAs分别参与多种不同的生物过程;差异性lncRNAs可能通过影响相应mRNAs发挥其生物学功能.结论:乳腺癌紫杉醇耐药细胞中lncRNAs和mRNAs的表达存在差异,差异表达的基因可以为寻找新的化疗敏感靶点或生物标志物提供线索.
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紫杉醇耐药人卵巢癌细胞株中线粒体DNA基因突变的研究
目的:研究紫杉醇耐药的人卵巢癌细胞株SKOV3/Tax和OC3/Tax中线粒体DNA( mtDNA)突变.方法:提取细胞DNA,分析mtDNA突变,比较SKOV3/Tax和OC3/Tax与亲本敏感细胞SKOV3及OC3之间mtDNA突变数量和突变类型的差异.结果:紫杉醇耐药及敏感细胞mtDNA的突变热点依次是ND5基因、Cytb基因、ND4基因、CoⅡ基因及NDI基因；与敏感细胞株相比,耐药细胞株中mtDNA测序中发现更多的基因突变频率,主要表现为A→C,A→G,T→C,A→T,缺失A、C,插入T、C等,其中以缺失A为明显.结论:人卵巢癌细胞株OC3及SKOV3中mtDNA编码区的ND5基因、Cytb基因、ND4基因和CoⅡ基因是具有高度突变性的区域,其与卵巢癌的发生、发展有重要关系.耐药细胞株中的突变明显高于敏感细胞株,推测突变的增加可能与卵巢癌耐药有关.
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应用抑制性消减杂交筛选卵巢癌紫杉醇耐药差异表达基因
目的:应用抑制性消减杂交技术研究人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/Tax300与其亲本细胞OC3(敏感株)之间基因表达的差异,筛选耐药相关基因,探讨基因表达差异与卵巢癌耐药的相关性.方法:以卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC3/Tax300 mRNA为检测子(tester),以其亲本细胞OC3(敏感株)mRNA为驱赶子(driver),构建cDNA消减文库.随机挑取文库克隆测序,所得结果在GenBank中做同源性比较分析.结果:成功构建了卵巢癌紫杉醇耐药细胞株的特异性cDNA消减文库.从文库中选取阳性克隆,其中76个测序成功,再随机选取36个序列与GenBank数据库进行初步比对,8个可能新基因,1个为蛋白序列,另27个来源于16个已知基因,这些差异表达基因主要涉及细胞代谢、信号转导、细胞骨架、凋亡、蛋白翻译合成、发育等相关基因.结论:部分基因表达差异与卵巢癌紫杉醇耐药有关.
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筛选MDA-MB-231乳腺癌耐药细胞株两种方法的比较
目的 比较间歇刺激法和浓度梯度递增法对雌激素受体(estrogen receptor,ER)阴性的乳腺癌耐药细胞株的建立,为进一步探讨ER阴性乳腺癌可能的耐药机制.方法 采用间歇刺激法和浓度梯度递增法,用紫杉醇诱导6个月,分别建立了耐药细胞系231 TIM10和231 TAX8,并用倒置相差显微镜、MTT法、Western印迹、流式细胞术比较了两株耐药细胞的形态学变化、耐药表型、ER-α蛋白表达及紫杉醇诱导细胞G2/M期阻滞效应的改变等生物学特性.结果 间歇刺激法比浓度梯度递增法更容易诱导ER阴性的乳腺癌细胞获得耐药表型,231 TIM10耐药指数为11.9,231 TAX8耐药指数为2.3.用紫杉醇处理后,231 TIM10细胞能够抵抗100 nmol/L紫杉醇引起的G2/M期阻滞效应,231 TAX8细胞仅能够抵抗10 nmol/L紫杉醇引起的G2/M期阻滞效应.231 TIM10细胞在诱导过程中形成了两个细胞亚群,体积增大明显,细胞之间黏连更加明显.MDA-MB-231敏感细胞和两株耐药细胞均无ER-α蛋白的表达.结论 间歇刺激法更合理地模拟了临床上ER阴性乳腺癌的耐药过程,建立了可靠的细胞耐药模型,为耐药机制研究建立了基础.
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靶向stathmin和mdr1基因逆转卵巢癌细胞紫杉醇耐药的研究
目的 探讨以RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术靶向stathmin和mdrl基因逆转卵巢癌细胞紫杉醉耐药的可行性.方法 分别构建靶向stathmin和mdrl基因的质粒:pGU6-GFP-neo-STMNI和pGU6-GFP-neo-MDRI;将质粒转染到卵巢癌紫杉醉耐药细胞株SKOV3/TAX,Real-time RTPCR检测stathminm和mdrl的mRNA变化;Western blot检测其蛋白表达变化;荧光显微镜检测细胞凋亡情况;CCK-8法分析细胞对紫杉醉的敏感度.结果 Real-time RT-PCR及Western blot显示pGU6-GFP-neo-MDRl质粒对mdrl基因,pGU6-GFP-STMN1-294shRNA质粒对stathmin基因在mRNA水平和蛋白水平均有明显抑制(P＜0.05),荧光显微镜下共转染组细胞凋亡增多,CCK-8示共转染组逆转紫杉醉耐药效果明显.结论 体外RNAi可有效沉默卵巢癌紫杉醉耐药株SKOV3/TAX细胞内:tathmin基因和mdrl基因,逆转其紫杉醇耐药.
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地西他滨联合紫杉醇对耐药MCF-7细胞增殖抑制和诱导凋亡的增敏作用
目的：：本研究旨在探讨地西他滨联合紫杉醇对紫杉醇耐药细胞MCF-7的细胞增殖抑制和诱导凋亡作用的影响。方法：采用CCK-8方法检测联合用药(地西他滨+紫杉醇)或单独用药(地西他滨、紫杉醇)组不同给药浓度在24,48,72 h对耐药细胞的增殖抑制作用,流式细胞仪检测不同给药组给药后48 h的细胞凋亡率。结果：CCK-8结果显示联合用药组相较于单药组对细胞增殖抑制作用显著增加(P<0.05),呈剂量依赖性,不同给药组的细胞增殖抑制率随着时间延长而增大；诱导细胞凋亡结果显示,48 h地西他滨单药组和紫杉醇单药组的细胞凋亡率分别是(20.4±1.98)%和(21.8±3.34)%,联合用药组的细胞凋亡率增加至(70.8±8.23)%。结论：地西他滨联合紫杉醇对紫杉醇耐药MCF-7细胞株的增殖抑制作用增加,促进耐药细胞的凋亡,地西他滨联合紫杉醇对耐药细胞株具有协同抗肿瘤作用。
