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基因芯片技术在致病微生物研究中的应用
高密度寡核苷酸DNA芯片技术可以通过一次杂交试验获得大量的基因组信息,在基因组结构与基因表达分析中应用广,在与人类健康有关的遗传病、传染病等许多疾病中具有广泛的应用前景.本文重点对基因芯片技术在细菌、病毒等致病微生物病原鉴定、分类与致病机制研究中的应用作一简要介绍.
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16S rRNA基因序列分析在临床微生物学中的应用
20世纪70年代前,生物类群的区分主要是根据形态和结构、生理和生化特征、行为习性表现以及少量的化石资料来进行的.这种通过表型特征鉴定的方法对细菌之间的亲缘性判断有时不够准确.随着分子生物学的发展,人们开始利用生物大分子特别是蛋白质和核酸的结构特征,作为判断生物进化关系的主要特征.其中Woese等[1]通过寡核苷酸编目的方法,在20世纪70年代逐渐发展出1种新的鉴定细菌的标准,即通过比较1段稳定的遗传编码--16S rRNA基因序列来分析和鉴定细菌的种系发生关系,判断其亲缘性,对细菌进行分类.
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065 短的非CpG磷酸二酯寡核苷酸作为免疫刺激剂的开发
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CpG脱氧寡核苷酸的免疫活性
CpG寡核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides,CpG ODN)的免疫活性具有多态性,表现为种属特异性、细胞特异性以及不同类型的CpG ODN之间的相互拮抗性.对CpG ODN免疫活性多态性进行分析有助于如下实验研究:①根据细胞种类的不同,选择合适的CpG ODN及检测指标,以获得理想的实验结果;②选择适当的CpG ODN以达到治疗目的.
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从细粒棘球绦虫获得的包含加帽的寡核苷酸和剪接转录产物及高水平的预测信号肽序列富含全长的cDNA文库
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138用核糖体寡核苷酸探针分析新型热带利什曼原虫的地理分布
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同时进行HBV、HCV检测60-mer长链寡核苷酸芯片的研制
基因芯片主要有cDNA芯片和寡核苷酸(Oligo)芯片两种.我们已经对cDNA芯片用于病毒性肝炎联合诊断进行了研究[1-3],而对于Oligo芯片,其探针的制备更为简化,直接通过分子生物学软件设计好探针序列后,人工合成相应的Oligo探针,调整浓度后,将其打印并固定在芯片上即可.本文研制乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)联合检测芯片,探讨其应用于临床检测的可能性.
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应用干扰RNA技术抑制乙型肝炎病毒抗原的体外表达
RNA干预(RNAi)是双链RNA(dsRNA)启动的选择性基因沉默作用,是一种基因水平的调控机制.序列特异性小干扰RNA(siRNA)可特异性抑制病毒复制[1],而HepG 2.2.15细胞系包含完整的HBV基因组,能介导HBV的高水平复制与表达,作为siRNA作用的靶向模型,实验结果更客观,更有说服力.我们观察HBV X区和核心区(C区)的4对特异性寡核苷酸片段对HepG 2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响,现将结果报道如下.
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氨基胍减轻高糖培养系膜细胞的肥大程度与降低周期素激酶抑制物p27有关
Wolf等发现无血清高糖培养导致系膜细胞(mesangial cell,MC)停顿于G1[1],MC肥大在糖尿病肾病(DN)肾小球系膜区扩大中起重要作用[2],氨基胍(aminoguanidine,AG)可改善DN早期的肾小球系膜区扩大[3].现已明确细胞是否肥大和周期停顿均由细胞周期调节蛋白(cell cycle regulatory protein,CCRP)控制[4].其中周期素激酶抑制物p27是一种十分重要的CCRP,在DN早期的MC肥大中起重要作用[4,5].本研究旨在观察AG对高糖培养MC肥大程度及MC中p27水平的影响,从而探讨AG的作用机制.一、材料和方法1.细胞培养:SD大鼠MC按谌贻璞等[6]方法培养和鉴定(抗desmin和抗vimetin染色阳性,抗Ⅷ因子染色阴性).MC培养于含10%小牛血清的正常糖(5.56 mmol/L)DMEM中,常规置于37℃、5%的CO2培养箱中孵育,每周传代2次.实验用MC为亚培养6~8代MC.进入实验前行无血清正常糖培养24h,然后分别无血清正常糖(G100组)、高糖(25 mmol/L)(G450组)及高糖+AG(Sigma公司,AG终浓度0.25 mmol/L,溶于无血清高糖DMEM中)(G450+AG组)培养72h;另外,对MC分别转染p27错义(missense)或反义(antisense)寡核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)后无血清高糖(G450+错义ODN组及G450+反义ODN组)培养72h.
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生物信息学(5):药物设计与生物信息学
生物信息学、基因组学、蛋白质组学与药物设计基因药物是直接以DNA或RNA为靶标的药物或以DNA或RNA自身作为药物.1993年美国政府以立法的形式准许开展基因治疗,基因药物的研究将是未来新药研究的热点.目前已有3类基因药物用于临床试验:①"反义"寡核苷酸:可抑制基因的转录或阻止mRNA翻译产生蛋白质;②肽核酸:可与基因的启动因子结合从而调节基因转录;③多氨基化合物:可阻断基因产物的生成.DNA疫苗是以DNA或RNA自身作为药物的基因药物,近年来已成为基因药物研究的热点.如对导致腺鼠疫的耶森菌400多万个碱基对的测序后,通过生物信息学分辨各个基因的作用,在此基础上,计划研制新型腺鼠疫DNA疫苗.随着人类基因组计划和生物信息学的发展,将会涌现更多的基因药物.
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特定序列寡核苷酸对人骨髓间充质干细胞体外扩增及成骨分化的影响
目的 探讨特定序列人工合成的寡核苷酸(Oligodeoxynucleotide,ODN)MT01对人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)增殖及成骨分化的影响.方法 采用Ficoll梯度密度离心法分离培养hBMSCs并进行鉴定.以1μg/mL的ODN MT01处理hBMSCs,细胞计数试剂盒检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶试剂盒检测成骨分化情况.结果 经1 μg/mL的ODN MT01处理的hBMSCs体外培养,第3、4、5、6、7天hBMSCs增殖明显;成骨诱导的第4、14、21天,碱性磷酸酶表达明显增加.结论 特定浓度人工合成ODN MT01能够在体外促进hBMSCs的扩增及成骨分化.
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细胞周期素D1反义寡核苷酸对胃癌细胞株BGC-823的作用
目的:通过基因反义封闭技术体外抑制细胞周期素D1(cyclin D1)的表达,并对胃癌细胞增殖的影响.方法:以胃腺癌BGC-823细胞株为研究对象,采用硫代修饰的cyclin D1反义寡脱氧核苷酸(ASODN)处理BGC-823细胞后,观察cyclin D1ASODN对BGC-823细胞基因表达及体外增殖活性的影响.结果:MTT法测细胞增殖活性见不同浓度ASODN均能抑制BGC-823细胞增殖,抑制作用在48小时强.RT-PCR检测结果cyclin D1mRNA减少.免疫组化S-P法结果cyclin D1蛋白表达明显降低.结论:使用人工合成的cyclin D1ASODN可以特异性的抑制胃腺癌BGC-823细胞株cyclin D1的表达,从而调控细胞周期,抑制细胞增殖.
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嵌合寡核苷酸对端粒酶活性的抑制作用
目的: 研究嵌合寡核酸对端粒酶活性的抑制作用.方法: 合成各种寡核苷酸(ODNs),利用HL-60细胞溶解液实施体外实验,U-87细胞系观察这些寡核苷酸在细胞水平的作用.结果: 硫代磷酸酯寡核甘酸(PS-ODNs)和RNA模板反义ODNs都可以抑制端粒酶的活性,且可产生累积效应.PS-ODNs的3′端延长一段与端粒酶RNA模板区域互补的各种修饰的ODNs则可以更进一步地提高它们的抑制效率.结论: 研究设计的嵌合反义寡核苷酸(cODNs)作为目前较有效的端粒酶活性抑制剂,可成为肿瘤治疗中较有前途的药物之一.
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Survivin反义寡核苷酸对卵巢癌细胞株凋亡和侵袭、迁移的影响
目的:观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人卵巢癌细胞株SKOV3凋亡和侵袭、迁移的影响,探讨其作用的分子机制和临床价值.方法:用脂质体LipofectamineTM2000介导ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力的改变,流式细胞学技术检测细胞凋亡指数及survivin、Smac、VEGF蛋白表达改变,逆转录酶链反应(RT-PCR)检测survivin、Smac/DIABLO、VEGF基因表达改变.结果:脂质体LipofeetamineTM2000介导ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,FCM及共聚焦显微镜(SLM510)检测结果显示转染率>95%.用600 nmol/L ASODN转染48 h后,细胞迁移和侵袭能力下降(t=3.47,P<0.05;t=5.72,P<0.01).细胞凋亡指数(AI)明显增加(t=6.37,P<0.05).Survivin mRNA和蛋白表达明显下调(t=3.50,P<0.05;t=7.81,P<0.01),Smac mRNA和蛋白表达上调(t=-2.80,P<0.05;t=11.39,P<0.01),VEGF mRNA和蛋白表达明显下调(t=2.54,P<0.05;t=33.84,P<0.01).结论:ASODN可诱导卵巢癌细胞凋亡,降低卵巢癌细胞侵袭和迁移能力.这些作用是通过下调survivin、VEGF基因,上调Smac基因表达来共同完成的,他们之间的相互作用可能是卵巢癌发生、发展和转移的重要分子机制,survivin可能在其中起关键性作用.针对survivin的基因治疗将成为卵巢癌治疗的重要手段,有重要的临床价值.
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端粒酶反义寡核苷酸及顺铂对恶性脑胶质瘤治疗的协同作用
目的观察端粒酶反义寡核苷酸(ODN)及顺铂对恶性脑胶质瘤治疗的协同作用.方法用15例Ⅲ、Ⅳ级端粒酶活性阳性表达的脑恶性胶质瘤制备单细胞悬液并原代培养,以5μmol/L端粒酶反义ODN抑制恶性胶质瘤细胞端粒酶活性后,用不同浓度顺铂处理细胞.流式细胞仪检测处理前后胶质瘤细胞PCNA、TUNEL阳性百分率变化情况.结果端粒酶反义ODN作用于恶性胶质瘤细胞72h后,TRAP法检测端粒酶活性转为阴性,此时0.3μg/mL顺铂即可对胶质瘤细胞有明显抑制增殖、促进凋亡作用.结论端粒酶反义ODN能抑制端粒酶活性,增加恶性胶质瘤细胞对顺铂的敏感性,与顺铂在治疗恶性胶质瘤细胞过程中有协同作用.
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ASON对急性早幼粒白血病细胞株HL60/VCR多药耐药的逆转作用
目的:探讨反义寡核苷酸(ASON)对耐长春新碱的急性早幼粒白血病细胞(HL60/VCR)多药耐药(mdr1)的逆转效果.方法:以HL60/VCR细胞为模型,合成正、反义寡核苷酸作用于HL60/VCR细胞,采用RT-PCR方法、流式细胞术及药敏试验等观察细胞mar-1 mRNA表达、mdr-1基因产物P-糖蛋白(P-gp)的表达和对药物长春新碱(VCR)的敏感性.结果:反义寡核苷酸处理的细胞mar-1 mRNA表达、P-gp表达较正义组及HL60/VCR细胞显著降低,且可明显提高HL60/VCR细胞株对长春新碱的敏感性.结论:反义寡核苷酸具有逆转HL60/VCR细胞多药耐药的作用.其作用机制可能是抑制mar1 mRNA的转录,使P-gp的表达受到明显抑制,提高对长春新碱的敏感性.
关键词: 抗药性 反义 寡核苷酸 耐长春新碱的急性早幼粒白血病细胞株 -
miR-15a/miR-16-1增强Raji细胞对阿糖胞苷的敏感性
目的 探讨miR-15a和miR-16-1寡核苷酸能否增强Raji细胞对阿糖胞苷(cytarabine,Ara-C)的敏感性.方法 将化学合成的miR-15a和miR-16-1寡核苷酸利用脂质体2000转染入Raji细胞后,联合Ara-C,CCK8法检测Ara-C的IC50值变化;锥虫蓝细胞计数法检测细胞增殖活性;Hoechst染色观察细胞的凋亡形态;流式细胞仪Annexin V/PI双染法测凋亡率.结果 miR-15a和miR-16-1寡核苷酸转染Raji细胞后,再加入Ara-C,24 h Ara-C的IC50值分别为10.41和10.86,明显低于单用Ara-C组(15.43)和随机序列联用Ara-C组(14.92,P<0.05).锥虫蓝拒染法结果显示,转染后各时间点miR-15a/miR-16-1+Ara-C组较单用miR-15a/miR-16-1组、单用Ara-C组及随机序列+Ara-C组明显抑制了Raji细胞的生长,Ho-echst染色可见大量凋亡细胞;流式细胞仪AnnexinV/PI双染色法检测显示,miR-15a+Ara-C组早期凋亡率和晚期凋亡率分别为20.93%和25.27%,miR-16-1+Ara-C组早期凋亡率和晚期凋亡率分别为20.69%和23.13%,均明显高于miR-15a组、miR-16-1组、Ara-C组及随机序列+Ara-C组(P<0.05),后四者的早期凋亡率分别为6.99%、4.73%、10.88%和14.39%,晚期凋亡率分别为10.08%、10.64%、11.83%和11.93%.结论 miR-15a和miR-16-1寡核苷酸可增强Raji细胞对Ara-C的敏感性.
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NF-κB"诱骗"寡核苷酸对小鼠巨噬细胞iNOS表达的影响
目的:研究NF-κB"诱骗(decoy)"寡核苷酸(ODNs)对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞株J774.1细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响.方法:体外培养巨噬细胞,LPS刺激后脂质体转染NF-κB"decoy"ODNs,用硝酸还原酶法测定培养液中NO水平以及iNOS含量,RT-PCR观察细胞iNOS的mRNA表达变化.结果:NF-κB"decoy"ODNs可降低巨噬细胞培养体系LPS诱导的NO合成,阻断iNOS mRNA的表达;对照序列的ODNs和转染剂对NO、iNOS无明显影响.结论:NF-κB"decoy"ODNs可以抑制iNOS的活性,减少NO生成,可能与其特异性竞争抑制活化NF-κB结合位点有关.
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医用生物蛋白胶携载反义寡核苷酸的实验研究
血管内膜增生是各类血管手术后造成中远期通畅率较差的一个主要原因,临床上应用抗增生药物防治,但效果不理想。反义寡核苷酸防治血管内膜增生有良好前景,在反义基因防治内膜增生的研究中,血管外膜给药已成为一紧密结合临床的方法,即将反义寡核苷酸混于各种胶或异分子共聚物中涂于血管外壁,缓慢释放反义寡核苷酸以达到持续抑制血管内膜增生的效果,但研究和应用较多的是多聚凝胶。医用生物蛋白胶可模拟人体凝血后阶段,形成乳白色蛋白凝胶,将其与麻醉药混合应用于患者术后镇痛,效果良好。我们设想同样将反义药物溶于生物蛋白胶中,将胶直接涂于血管外膜,使反义药物持续释放,从而达到理想地抑制血管内膜增生的效果。1 材料和方法1.1 实验材料 (1)医用生物蛋白胶,规格2.5 ml,广州倍特生物技术有限公司制造;(2)反义寡核苷酸18 bp的反义C-myc,由上海生工生物工程公司合成,序列为:5′GA A GCT CAC GTT GAG GGG 3′;(3)SP8-100紫外分光光度计,美国Beckman公司产品;(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及电泳仪,美国BIO-RAD公司产品; (5)1%亚甲蓝溶液,上海生物化学制药厂生产。1.2 医用生物蛋白胶物理性状观察先将生物蛋白胶主体与催化剂分别以各自的溶解液溶解(注意器具不能混用,以免凝胶提前形成),取2只一次性注射器,一只专用于抽取生物蛋白胶主体溶液,另一只专用于抽取催化剂溶液,分别卡入推液支架上(注意两注射器内的液体一定要等容量,不要留有气泡),将两注射器锥头牢固地连接到连接针座上,再把喷嘴安装到连接针座的锥头,检查无松动渗漏后,将生物胶注入透明塑料试管中,肉眼及显微镜进行观察。
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脂质体介导的c-myc反义硫代寡核苷酸诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡
目的探讨c-myc反义硫代寡核苷酸(antisense phosphorothioate oligodeoxynucleotide, APSODN)对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响.方法人工合成c-myc APSDDN,通过脂质体转染法处理人胃癌细胞系SGC-7901后,于不同时间收集细胞,采用Northern blot、Western blot检测c-myc基因mRNA及蛋白表达,采用TUNEL方法检测凋亡指数,以流式细胞仪检测细胞周期.结果TUNEL显示c-myc APSODN可诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡,并与APSODN的浓度和处理时间有关.流式细胞仪检测显示细胞阻滞于G0/G1期.结论c-myc APSODN可诱导胃癌细胞凋亡.