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HPV感染、宫颈炎、CIN及宫颈癌患者的宫颈黏膜脱落细胞端粒酶定量研究
目的 检测研究表明女性在感染人乳头瘤病毒(HPV)后引起宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)及进而发展为宫颈癌时其宫颈黏膜脱落细胞端粒酶活性量发生变化,探其对筛查和早期诊治女性宫颈癌患者的临床价值.方法 选HPV检测阴性的正常对照组26例、HPV阳性组28例、HPV阳性宫颈炎组27例、HPV阳性CIN组26例、宫颈癌组24例、HPV阴性宫颈炎组26例、HPV阴性CIN组23例共七个检测组,采集宫颈黏膜脱落细胞标本以293细胞为阳性标准进行端粒酶TRAP实时荧光定量检测.结果 端粒酶活性定量值:正常对照组,范围0～3.15、平均0.36；HPV阳性组,范围0～21.6、平均1.98,＞10的3例；HPV阳性宫颈炎组,范围0～71.5、平均4.88,＞10的4例；HPV阳性CIN组,范围0～ 407、平均20.8,＞10的5例；宫颈癌组,范围1.2 ～5.5×106、中位数346,其中＜10的4例；HPV阴性宫颈炎组,范围0～66.6、平均4.19,＞10的3例；HPV阴性CIN组,范围0 ～158、平均14.2.统计学分析宫颈癌组与其他各组比较差异有统计学意义(P＜0.01),HPV阳性CIN组与正常对照组比较有统计学意义(P＜0.05),其余各组间两两比较无统计学意义(P＞0.05).结论 女性在感染HPV并引起宫颈炎、CIN阶段,其宫颈黏膜脱落细胞端粒酶活性逐步增高,在宫颈癌阶段增高为显著,因此对采取宫颈黏膜脱落细胞进行端粒酶活性定量检测,可作为对女性宫颈癌的有效筛查和早期诊断手段之一.
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粪中脱落细胞端粒酶活性检测筛查大肠癌初探
目的探讨粪中脱落细胞端粒酶活性检测筛查大肠癌的敏感性和特异性.方法对45例大肠癌患者,34例非大肠癌患者,从新鲜大便中分离脱落细胞并裂角,用聚合酶链端粒重复扩增(PCR-TRAP)银染技术观察端粒酶活性表达情况.同时采用试纸法做受检者粪隐血试验.结果45例大肠癌患者粪便标本中有30例端粒酶阳性表达,1例大肠腺瘤、1例溃疡性结肠炎端粒酶表达为阳性,提示粪便脱落细胞端粒酶活性检测对大肠癌的敏感性为66.67%,特异性为94.12%.粪便隐血试验中大肠癌的敏感性为82.22%,特异性为58.82%.两种方法对大肠癌阳性检出率差异无显著性(P＞0.05).端粒酶阳性表达与其大肠癌Duke's分期、淋巴结转移和癌肿部位均未见显著相关(P＞0.05).结论粪中脱落细胞端粒酶活性检测有望成为一种新的大肠癌筛选方法.
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衰老对大鼠阴茎组织NO-cGMP通路及端粒酶活性的影响研究
目的 探讨衰老对大鼠阴茎组织结构、NO(nitric oxide)-cGMP(cyclic Guanosine Monophosphate)通路及端粒酶活性的影响作用.方法 本课题以不同月龄大鼠阴茎组织及培养的平滑肌细胞为研究对象,检测不同月龄大鼠阴茎组织中NO量、NOS(Nitric Oxide Synthase)活性、cGMP量、端粒酶活性及海绵体结构的变化,并比较大鼠、人阴茎组织及大鼠原代海绵体平滑肌细胞的端粒酶活性.结果 (1)大鼠阴茎组织中NO量、NOS活性均先升高后降低,各月龄组间有显著差异.阴茎组织cGMP含量逐渐降低,各月龄组间差别显著;(2)随龄增加,平滑肌纤维逐渐减少,胶原纤维增多,粗大成团,窦状隙变少、变窄;(3)大鼠阴茎组织端粒酶活性以2月龄活性高,随龄增加逐渐下降.人阴茎组织中无端粒酶活性.结论 (1)衰老对大鼠阴茎组织结构、NO-cGMP通路及端粒酶活性有显著影响,提示衰老与ED关系密切;(2)大鼠阴茎组织有端粒酶活性,可作为研究细胞衰老与ED关系有关端粒酶的模型.
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短发夹RNA抑制喉癌细胞hTERT基因表达及诱导细胞凋亡
目的:探讨DNA载体途径的RNA干扰技术抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因表达及诱导喉癌细胞Hep-2凋亡的作用.方法:构建靶向hTERT mRNA的质粒pshRNA1、pshRNA2及对照质粒pshRNA3、pEGFP,并将其分别转染喉鳞癌Hep-2细胞.共聚焦荧光显微镜观察质粒转染及表达情况;RT-PCR测定hTERT mRNA表达;Western印迹测定hTERT蛋白表达;末端重复片断扩增-酶联免疫吸附(TRAP-ELISA)方法测定细胞端粒酶活性;MTT法研究细胞增殖活性变化;原位细胞凋亡(TUNEL)及透射电子显微镜研究细胞凋亡.结果:①共聚焦荧光显微镜下见大量的细胞呈现绿色荧光,与其他组比较,pshRNA1、2组呈现荧光的死亡细胞显著增加.②pshRNA1、2转染细胞后hTERT mRNA及hTERT蛋白表达显著降低;其端粒酶活性明显受到抑制:转染后2 d pshRNA1组活性为:0.159±0.039、pshRNA2组活性为0.163±0.028,与空白对照组1.523±0.076比较,差异有非常显著性(P＜0.005).③pshRNA1、2转染细胞后可显著抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡.这两组细胞透射电镜可见典型细胞凋亡特征.结论:DNA载体途径的RNA干扰技术能有效抑制hTERT基因的表达及端粒酶活性并诱导癌细胞凋亡,此法可能成为抑制肿瘤细胞的新途径.
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端粒酶在人胚肾上皮细胞转化中的作用
目的:利用原代人胚肾上皮细胞转化模型阐明端粒酶在细胞癌变过程中的作用.方法:用逆转录病毒介导的基因导入法,使人端粒酶催化亚基(human telomerase catalytic subunit,hTERT)、H-Ras癌基因、猿猴病毒40(simian virus 40,SV40)编码的早期抗原在原代人胚肾上皮细胞中稳定地表达,观察细胞的生长特性、染色体畸变率以及细胞转化特征.结果:端粒酶的激活虽然能延长细胞的寿命,但不能使细胞永生化.如果细胞同时表达端粒酶和SV40编码的大T抗原(large T antigen,LT),细胞就能获得永生化.在此永生化细胞株中导入H-Ras癌基因以及SV40编码的小T抗原(small T antigen,ST),细胞发生恶性转化,表现为在软琼脂上形成克隆并在裸鼠皮下形成肿瘤.与原代细胞相比,永生化细胞株的染色体畸变率无改变,而恶性转化细胞的畸变率明显增加.此外在转化细胞和几种肿瘤细胞中表达阻抑人端粒酶的特异性siRNA,能显著地抑制肿瘤细胞的生长、诱导细胞凋亡并减少软琼脂上形成的克隆数目.结论:细胞永生化是癌变过程的必要阶段,端粒酶的激活不仅是细胞永生化的重要环节,而且在维持肿瘤细胞生长中起重要的作用.
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ATM对辐射后AT细胞端粒酶活性的影响
目的:探讨ATM对电离辐射照射的毛细血管扩张-共济失调症(ataxia telangiectasia,AT)患者皮肤的成纤维细胞系AT细胞(AT5BIVA)端粒酶活性的影响.方法:以源于正常人皮肤的成纤维细胞系GM细胞(GM0639)为对照,应用基于PCR的端粒重复扩增技术(telomeric repeat amplification protocal,TRAP)与高效液相色谱(HPLC)技术,定量分析细胞分别经0、1、3、5 Gy60Coγ射线照射后以及经3 Gy60Coγ射线照射后继续培养2、24、48、72 h,AT、空载体AT、ATM+-AT和GM细胞的端粒酶活性的变化.结果:未照射时,除GM细胞外,AT、空载体AT、ATM+-AT细胞均呈现较高的端粒酶活性表达,但ATM+AT细胞的端粒酶活性明显低于AT和空载体AT细胞的端粒酶活性(P＜0.01),而后二者无明显差异(P＞0.05);电离辐射照射后,AT、空载体AT、ATM+-AT和GM细胞的端粒酶活性均呈剂量依赖性和时间依赖性增强,且在相同剂量点与时间点,ATM+-AT细胞的端粒酶活性高于GM细胞(P＜0.01)(除5 Gy计量点外),但低于AT和空载体AT细胞(P＜0.01),而后二者无明显差异(P＞0.05).结论:电离辐射可诱导细胞端粒酶活性表达;并且细胞端粒酶活性水平随剂量与时间的增加而增加;ATM可下调AT细胞端粒酶活性水平.推测端粒酶参与电离辐射诱导DNA损伤的修复.
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端粒酶反义寡核苷酸及顺铂对恶性脑胶质瘤治疗的协同作用
目的观察端粒酶反义寡核苷酸(ODN)及顺铂对恶性脑胶质瘤治疗的协同作用.方法用15例Ⅲ、Ⅳ级端粒酶活性阳性表达的脑恶性胶质瘤制备单细胞悬液并原代培养,以5μmol/L端粒酶反义ODN抑制恶性胶质瘤细胞端粒酶活性后,用不同浓度顺铂处理细胞.流式细胞仪检测处理前后胶质瘤细胞PCNA、TUNEL阳性百分率变化情况.结果端粒酶反义ODN作用于恶性胶质瘤细胞72h后,TRAP法检测端粒酶活性转为阴性,此时0.3μg/mL顺铂即可对胶质瘤细胞有明显抑制增殖、促进凋亡作用.结论端粒酶反义ODN能抑制端粒酶活性,增加恶性胶质瘤细胞对顺铂的敏感性,与顺铂在治疗恶性胶质瘤细胞过程中有协同作用.
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手术对肺癌患者外周血中癌细胞端粒酶活性的影响
目的:检测肺癌患者手术前后外周血中癌细胞端粒酶活性,了解手术对其影响及意义.方法:应用端粒酶重复序列扩增法(PCR-TRAP)检测30例肺癌患者手术前及术后第5天外周血中癌细胞端粒酶活性,随访其预后.本院同期30例非肿瘤患者为对照组.结果:非肿瘤患者外周血端粒酶活性均为阴性,肺癌患者手术前后阳性率分别为60%(18/30)及50%(15/30),手术前后阳性率无显著差异(P＞0.05),手术后有6例端粒酶活性上升,其中4例存活不足1年;15例端粒酶活性明显下降(P＜0.01),其中6例转阴性,15例存活均超过1年.结论:肺癌患者外周血端粒酶活性可能对诊断、指导治疗、判断预后有参考价值,手术治疗能减少外周血中癌细胞.
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端粒酶在鳞状细胞癌和Bowen病组织中的表达
目的探讨端粒酶在皮肤鳞状细胞癌(SCC)及Bowen病(BD)病变组织中的表达及其临床意义.方法应用原位杂交方法检测30例皮肤SCC和30例BD病变组织中端粒酶基因hTR和hTERT mRNA的表达.结果在BD组织中hTR和hTERT mRNA呈弱表达,阳性率为23.33%和16.67%.在SCC中,hTR和hTERT mRNA的阳性率分别为86.67%和93.33%.其中Ⅰ、Ⅱ级SCC阳性率分别为82.35%和88.24%,无强阳性;Ⅲ、Ⅳ级SCC阳性率分别为92.31%和100%、强阳性表达率分别为69.23%和76.92%.SCC和BD两者比较差异有显著性(P＜0.05).SCC Ⅰ、Ⅱ级与Ⅲ、Ⅳ级比较差异有显著性(P＜0.05).结论端粒酶hTR和hTERT mRNA的表达增多是预测皮肤SCC的重要因素.
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香烟烟雾提取物对外周血内皮祖细胞衰老的影响及其机制研究
目的：观察香烟烟雾提取物（CSE）对外周血内皮祖细胞（EPC）衰老的影响，探讨其可能机制。方法密度梯度离心法获取人外周血单核细胞，培养4d 后，收集贴壁细胞，分别加入2.5％，5％，10％和15％的 CSE 干预。采用SA β半乳糖苷酶染色试剂盒检测衰老细胞；MTT 比色法检测 EPC 的增殖能力；端粒重复序列扩增法（TRAP） ELISA 定量检测 EPC 端粒末端转移酶活性；逆转录 PCR 法检测人端粒酶逆转录因子（human telomerase reverse transcriptase ， hTERT）mRNA 水平；Western 蛋白印迹检测 EPC Akt Ser473磷酸化水平。结果 CSE 能显著增加 SA β半乳糖苷酶阳性细胞数量，15％ CSE 影响为明显，同时显著抑制 EPC 增殖能力；CSE 能显著抑制端粒酶活性及 hTERT mRNA 表达；另外，CSE 能抑制 EPC Akt 磷酸化。结论 CSE 诱导 EPC 衰老，伴随 EPC 增殖能力的损害，提示细胞衰老也许是 CSE 影响 EPC 功能的机制之一；CSE 诱导 EPC 衰老可能与抑制 EPC 端粒末端转移酶活性、减少 hTERT mRNA 表达及抑制 Akt磷酸化有关。
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以端粒酶为靶治疗肺癌研究进展
端粒酶是一种可以维持端粒长度的RINA酶,抑制端粒酶可能会使端粒缩短并使肿瘤无限增殖停止.该文就端粒酶在肺癌治疗中的研究进展作一综述.
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端粒酶和erbB4基因在非小细胞肺癌中表达的研究
目的 研究端粒酶和erbB4基因在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及与肺癌临床、病理的关系.方法 应用TRAP法测定56例肺癌组织标本中端粒酶的表达.同时应用免疫组化法检测56例肺癌石蜡组织中eabB4的表达.记录56例肺癌患者5年生存情况.结果 NSCLC组织中端粒酶和erbB4阳性表达率分别为75%(42/56)及89.3%(50/56).端粒酶、erbB4表达与不表达在临床分期组间的差异有统计学意义(P=0.004、0.005),端粒酶表达与不表达患者5年生存率差异有统计学意义(P=0.0005).结论 检测端粒酶及erbB4表达有助于判断NSCLC临床特点及预后.
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hTERC基因的FISH检测对良恶性腹水鉴别诊断的价值
目的 检测腹水脱落细胞端粒酶(hTERC)基因的状态,以探讨其在良恶性腹水鉴别诊断中的价值.方法 采用荧光原位杂交(FISH)方法 ,检测26例恶性腹水和15例良性腹水(对照组)脱落细胞hTERC基因的状态.结果 ① hTERC基因在良性腹水和恶性腹水中的扩增阳性率分别为6.7%和88.5%,恶性组显著高于良性组(P<0.05).② 恶性腹水中,FISH检测阳性率88.5%明显高于细胞学检测阳性率46.2%(P<0.05);良性腹水中,FISH诊断特异性略低于细胞学检查结果 (93.3% 和100%),但无统计学意义(P>0.05).③不同肿瘤引起的腹水hTERC基因扩增阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05).结论恶性腹水hTERC基因高度扩增,检测该基因对良恶性腹水有重要鉴别诊断价值,尤其对细胞学检查阴性的患者.
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乳腺癌组织中端粒酶活性的定量检测及其与临床病理的关系
背景与目的:端粒酶是一种在细胞永生化及癌症发生过程中起重要作用的核蛋白酶.近关于乳腺癌中端粒酶活性与预后因素间的关系,因研究方法的差异而呈现出不一致的报道.本研究旨在建立一种可行的银染端粒酶定量检测法,以探讨乳腺癌中端粒酶活性与临床病理学预后因素间的关系.方法:运用银染端粒重复序列扩增法 (SS TRAP)检测了 52 例新鲜乳腺癌及其癌旁组织, 32 例乳腺良性病变和 14 例正常乳腺组织中端粒酶的活性表达,对结果予以定量并结合临床资料进行分析.结果:乳腺癌、癌旁组织、良性病变及正常乳腺组织中端粒酶阳性率分别为 90.38% (47/52)、 28.85% (15/52)、 31.25% (10/32)、 0(0/14).端粒酶分别为 36.91± 15.35、 8.27± 4.37、 14.10± 5.28、 0 (TPG单位 ),单因素方差分析结果显示,乳腺癌组端粒酶活性水平明显高于其他 3组 (P值均 < 0.01). Logistic回归分析结果表明,乳腺癌中端粒酶的表达与病理类型、分化程度明显相关 (P=0.003及 0.004),即随着肿瘤的进展,端粒酶活性亦增加.其中,浸润性非特殊癌端粒酶活性水平明显高于浸润性特殊癌 (P< 0.05);中、低分化癌端粒酶活性均高于高分化癌 (P< 0.05),中、低分化癌间无显著性差异 (P >0.05).端粒酶活性表达在患者病程、年龄、绝经状况间均无显著性差异 (P >0.05).结论:与经典 TRAP法相比,定量 SS TRAP同样敏感、特异,但更快速、简便;端粒酶的激活可能是乳腺癌发生、发展过程中的重要分子事件,端粒酶可望成为乳腺癌早期诊断及预后判断的指标之一.
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hTERC和高危HPV及细胞学联合检测在宫颈癌筛查中的价值
目的:探讨联合应用hTERC、高危HPV检测及液基细胞学检查TCT在宫颈癌筛查中的意义.方法:选择2010年5月至2012年1月因宫颈异常在佛山市妇幼保健院宫颈门诊行TCT检查的患者100例为研究对象,同时行HC2检测高危HPV感染,FISH技术检测hTERC基因扩增及阴道镜下病理活组织检查,以病理学结果为金标准,将三种检测方法的结果与其进行比较.结果:非CIN组、CIN1、高级别CIN及浸润癌中TCT检查与病理学结果符合率分别为88.9％ (16/18)、58.33％ (14/24)、68.29％ (28/41)、76.47％ (13/17),高危HPV阳性率分别为27.78％ (5/18)、91.67％ (22/24)、97.56％ (40/41)、100％ (17/17),hTERC阳性率分别为11.1％ (2/18)、29.17％(7/24)、87.80％ (36/41)、100％ (17/17).随着宫颈病变病理级别的递增,高危HPV的表达及hTERC基因扩增出现递次增高.非CIN组高危HPV感染率低于CIN组,差异有统计学意义(P＜0.01),CIN1、CIN2及CIN3三组间比较差异无统计学意义(P＞0.05),CIN组与宫颈浸润癌组差异无统计学意义(P＞0.05).hTERC基因扩增率高级别CIN组及浸润癌组明显高于低级别CIN1组(P＜0.01).结论:在宫颈癌筛查中,细胞学检查具有较高的特异性(92.5％),但灵敏度较差(53.4％),高危HPV检测灵敏度高(96.7％),但特异性差(44.6％),hTERC基因扩增筛查高级别CIN病变特异性高(98.6％),灵敏度稍低(71.7％),在宫颈组织的表达率与宫颈病变程度密切相关,三种方法联合检测可以大大提高宫颈癌前病变的阳性检出率,有利于较特异地识别出具有较高的转化为宫颈癌潜能的高级别CIN病变.
关键词： 端粒末端转移酶 高危型人乳头瘤状病毒 液基细胞学 宫颈癌 宫颈上皮内瘤样病变 -
人端粒末端转移酶反转录酶及bcl-2在病理性瘢痕成纤维细胞中的表达
端粒末端转移酶的激活与肿瘤的发生密切相关[1].随着对其研究的深入,人们逐渐认识到人端粒末端转移酶反转录酶(human telomerase revere transcriptase,hTERT)可能在端粒末端转移酶活性调节中发挥重要作用.
