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环境表观基因组学相关技术
继人类基因组计划圆满完成之后,"人类基因组表遗传计划(Human Epigenome Project)"也于2003年10月7日正式启动.这是世界上首项针对控制人类基因"开"和"关"的主要成分进行的图谱绘制工作,它将帮助科学家建立人类遗传、疾病与环境之间的关键联系.
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间充质干细胞成脂分化过程中SREBP-1对SIRT1的调控
目的:研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSC)成脂分化过程中转录因子SREBP-1对SIRT1的调控作用.方法:通过油红O染色鉴定BMMSC成脂分化;RT-PCR检测AP2、LPL、SREBF-1和SIRT1的mRNA转录水平;Western-blot检测SREBP-1表达水平;染色质免疫沉淀技术验证SREBP-1与SIRT1启动子之间的结合情况.结果:成脂诱导培养液中的BMMSC 14 d后被诱导成为成熟的脂肪细胞;RT-PCR显示AP2、LPL和SREBF-1、SIRT1在BMMSC成脂分化过程中表达上调;SREBP-1的蛋白水平也明显高表达;SREBP-1抗体免疫沉淀的基因组DNA成功扩增出SIRT1基因条带.结论:在BMMSC成脂分化过程中,SREBP-1能与SIRT1启动子区域特异性结合,可能参与SIRT1表达的调控.
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Pol Ⅱ-ChIP-PE-MS方法的建立及其在SNP功能研究中的应用
目的:建立RNA多聚酶Ⅱ-染色质免疫沉淀-引物延伸-飞行时间质谱技术(PolⅡ-ChIP-PE-MS),并利用该方法检测SNP等位特异磷酸化PolⅡ结合量,为活体状态下研究疾病关联基因SNP的功能研究提供一种高通量的研究手段.方法:采用PCR-RFLP方法对HepG2细胞印迹基因SNRPN(仅父源等位基因表达)基因组DNA和cDNA进行基因分型,利用PolⅡCTD末端Ser5特异性抗体进行染色质免疫沉淀,针对SNP位点两侧序列设计PCR引物和延伸引物,以外侧引物进行PCR扩增,采用延伸引物进行VLET引物延伸,产物纯化后经MALDI-TOF质谱鉴定.结果:对SNRPN杂合子细胞的SNRPN C1654312T SNP进行PolⅡ-ChIP-PE-MS分析发现,基因组DNA样本和染色质免疫沉淀前样本在C、T等位点都包含相同PolⅡ结合量,但免疫沉淀后标本(被磷酸化RNA多聚酶Ⅱ结合的染色质)就仅在T等位点有结合,与产生mRNA转录的等位点相对应.结论:成功建立起PolⅡ-ChIP-PE-MS方法,利用该方法检测SNP等位特异磷酸化PolⅡ结合量是可靠的,可以利用PolⅡ-ChIP-PE-MS策略鉴定疾病关联基因SNP的功能.
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Ezh2在全反式维甲酸诱导的P19神经细胞分化过程中的作用
目的 探讨组蛋白甲基转移酶Ezh2在P19神经细胞分化中的作用.方法 通过Western印迹检测全反式维甲酸 (RA)诱导TuJ1蛋白的表达;通过染色质免疫沉淀技术检测Ngn1基因启动子区Ezh2的结合与H3K27三甲基化的变化;通过实时定量RT-PCR检测RA诱导P19细胞分化后 Ezh 2 mRNA表达.结果 在RA诱导P19细胞中,Ezh2与H3K27me3在Ngn1启动子区的结合逐渐升高,并在诱导后第2天达到高峰,然后迅速降低,随后出现神经分化特异标志.结论 Ezh2在RA诱导的P19细胞早期产生一种抑制性的组蛋白修饰标志H3K27me3,通过避免Ngn1的过早表达,确保P19细胞的正常分化.
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采用ChIP-DSL启动子芯片筛选Kid下游调控基因
目的:前期研究发现驱动蛋白样DNA结合蛋白(kinesin-like DNA binding protein,Kid)的编码基因(ki-nesin-like 4,KNSIA)在乳腺原发癌中的表达下调与患者差的预后相关.本研究的目的是筛选Kid下游调控基因.为探讨Kid在乳腺癌发生和发展中的作用机制提供依据.方法:采用染色质免疫沉淀技术和舍人类20 045个功能基因启动子序列的Oligo芯片,筛选Kid抗体染色质免疫沉淀的DNA与芯片杂交的荧光强度.与无抗体对照比较差异达2倍以上的基因作为Kid调控的候选基因;采用ChIP-PCR方法验证候选基因的启动子与Kid的结合:采用实时定量RT-PCR方法验证Kid蛋白量改变对候选基因mRNA表达水平的影响.结果:筛选出287个Kid调控的候选靶基因;候选基因ATF7IP和CDC25C的Kid特异性染色质免疫沉淀扩增产物量与非特异对照比较差异分别为2.2倍和2.4倍;ATF7IP和CDC25C在KNSL4 siRNA干扰的乳腺癌细胞中的表达水平较对照细胞分别下调1.6倍和5.8倍.结论:Kid对ATF7IP和CDC25C的转录呈负向调节作用;Kid可能通过对靶基因表达的转录调控进而影响乳腺癌的生物学行为.
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低氧对人肝癌HepG2细胞中HIF-1α及miR-210表达的影响
目的:研究低氧对人肝癌细胞株HepG2细胞表达缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor一1 alpha,HIF-1a)及缺氧特异性微小RNA一210(microRNA一210,miR-210)的影响,探讨肿瘤细胞在低氧环境下miR-210表达的变化情况.方法:HepG2细胞经体外常规培养后,用体积分数为1%的氧气分别培养HepG2细胞6、12、18和24 h.应用实时荧光定量RT-PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)和蛋白质印迹法分别检测细胞中HIF-1α mRNA和蛋白的表达变化,同时用茎环RT-PCR检测miR-210的表达变化,分析HIF-1α与miR-210的表达关系.染色质免疫共沉淀PCR(chromatin immunoprecitation PCR,ChIP-PCR)分析HIF-1α与miR-210启动子结合的可能性.结果:低氧培养6～12 h,HIF-1α mRNA的表达量存在明显改变(P<0.05),而其蛋白的表达量从低氧培养开始直至24 h均有明显变化(P<0.005);与此同时,miR-210的表达量在低氧培养6～18 h时出现明显改变(P<0.01),且与HIF-1α蛋白表达存在明显的线性相关(R=0.795,P=0.037).进一步的ChIP-PCR实验表明,HIF-1α在HepG2细胞内可与miR-210启动子区近转录区的低氧反应元件(hypoxia response element,HRE)结合,从而发挥转录调控作用.结论:适度的低氧环境可能影响miR-210表达,其机制可能是通过HIF-1α结合其启动子来调节实现的.
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锌指蛋白ZBTB20是调控肝脏甲胎蛋白基因转录的关键抑制因子
甲胎蛋白(AFP)在胎肝中高表达,出生后不久就快速下调至很低水平.有关肝脏AFP基因出生后的转录抑制机制一直是未解之谜.AFP基因的增强子、抑制区域和启动子等顺式调控元件可能参与其转录抑制的调节,但有关的关键性转录抑制因子尚不明确.我们发现了一种新型锌指蛋白ZBTB20,为研究其体内的生理功能,我们利用条件打靶技术,建立了ZBTB20的组织特异性基因敲除小鼠模型,发现肝细胞特异性ZBTB20基因敲除小鼠出生后的肝脏AFP基因一直维持近乎胎肝的高水平表达,而其肝细胞处于正常的静息状态.生化分析显示,ZBTB20具有转录抑制活性,体外可有效抑制AFP启动子的转录活性;染色质免疫沉淀和EMSA实验结果显示ZBTB20 体内和体外能直接结合AFP启动子.在小鼠肝脏的发育过程中,ZBTB20基因被渐进激活,与AFP基因的表达水平呈负相关,提示激活的ZBTB20参与了AFP基因的转录抑制.上述结果表明ZBTB20是调控AFP基因表达的关键转录因子,由此我们认为肝脏ZBTB20基因出生后的表达上调及其发挥的转录抑制作用是导致AFP基因出生后快速下调的主要原因.
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HIF-1α调控Snail基因启动子活性及作用位点的鉴定
[目的]探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对Snail启动子活性的作用,并鉴定其作用位点.[方法]应用transfac软件分析Snail启动子区域潜在的HIF-1α结合位点.通过荧光素酶报告基因载体、电泳迁移率实验(EMSA)和染色质免疫沉淀(ChIP)实验研究HIF-1α是否能够与Snail启动子区域潜在的位点结合,直接调控Snail的表达.[结果]生物信息学分析发现Snail启动子区域存在2个HIF-1α可能的结合位点(-653,-649)和(-543,-538).双荧光素酶报告基因检测发现(-543,-538)位点是HIF-1α特异性结合于Snail的位点,HIF-1α蛋白与之结合后调节Snail基因转录活性.EMSA和ChIP实验证实了HIF-1α蛋白和Snail启动子区(-543,-538)结合,直接上调Snail的表达.[结论]Snail启动子区域存在HIF-1α的结合位点,HIF-1α与之结合后直接调控Snail的表达.
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染色质免疫沉淀ChIP技术检测传代培养细胞Grb1O组蛋白乙酰化水平
目的 检测传代培养过程鼠尾成纤维样细胞中印迹基因Grb10中组蛋白乙酰化水平的改变.方法 应用染色质免疫沉淀ChIP技术和荧光定量PCR (Q-PCR)分析,检测传代培养细胞中印迹基因Grb10组蛋白乙酰化水平.结果 应用ChIP和Q-PCR检测出印迹基因Grb10组蛋白乙酰化水平上升.结论 ChIP技术与实时荧光定量PCR技术的结合,通过免疫共沉淀作用和后续PCR定量分析,可以有效地检测目的基因的组蛋白修饰水平;鼠尾成纤维样细胞中印迹基因Grb10的乙酰化水平受体外传代培养的影响.
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组蛋白H3K9me3在胆管癌发生机制中的作用
目的 观察组蛋白H3K9me3修饰在胆管癌发病机制中的作用.方法 收集9例病理确诊的胆管腺癌组织和5例正常的肝外胆管组织,采用染色质免疫共沉淀联合芯片技术(ChIP-chip)检测两种组织细胞全基因组的蛋白H3K9me3修饰水平,进行基因验证,并检测mRNA的表达水平.结果 与胆管组织细胞比较,胆管癌细胞全基因组范围共筛选出67个基因存在H3K9me3修饰显著差异,其中35个基因升高,32个基因降低.在癌细胞中,6个挑选基因[钙结合蛋白A2(S100A2)、GTP酶激活蛋白基因2亚型(ANAPC2)、CBFA2T3、GTP酶激活蛋白4(ARHGAP)、鸟嘌呤核苷酸交换因子3(RAPGEF3)、α型蛋白激酶C基因(PRKCA)]的H3K9me3修饰水平分别为:(3.51±0.21)％、(8.45±0.16)％、(0.89±0.27)％、(0.66±0.22)％、(0.04±0.01)％、(5.21±1.53)％,与正常胆管细胞比较差异有统计学意义,并且其修饰水平与基因表达呈负直线相关(r=-0.539,P＜0.05).结论 与正常胆管细胞比较,胆管癌细胞中多个基因的组蛋白H3 Kme3修饰水平存在显著改变;并导致了多个相关的癌基因及抑癌基因转录表达的改变.
关键词： 组蛋白H3K9me3 基因芯片 染色质免疫沉淀 胆管癌 -
胃癌全基因组蛋白H3K27三甲基化水平的研究
目的 研究胃癌肿瘤细胞全基因组蛋白H3K27的三甲基化水平.方法 收集我科2007年10月～2008年1月间8例胃癌患者肿瘤组织和正常胃黏膜组织,采用染色质免疫沉淀联合芯片技术(ChIP-chip)在全基因组范围内对两种组织细胞的组蛋白H3K27进行高通量的检测.随后采用染色质免疫沉淀-实时定量聚合酶链反应(ChIP-qPCR)验证芯片结果 ,定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测H3K27显著差异基因的mRNA表达水平.用统计软件进行基因筛选.结果 两种组织细胞组蛋白H3K27三甲基化水平对比,筛选出234个基因存在H3K27显著差异,肿瘤细胞中有71个基因显示有H3K27三甲基化程度增高,161个基因H3K27甲基化程度降低;ChIP-qPCR验证结果 与CpG岛芯片检测结果 一致.结论 和正常胃黏膜组织细胞相比,胃癌肿瘤细胞多个基因组蛋白H3K27三甲基化存在显著改变.ChIP-chip检测技术有利于进一步揭示胃癌肿瘤发生的分子机制,发现新的基因治疗靶点.
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染色质免疫沉淀技术分析红藻氨酸处理后的大鼠大脑皮质神经元中p53与p21基因启动子的结合
目的 检测红藻氨酸(KA)处理后的大鼠大脑皮质神经元中p53蛋白与p21基因启动子的结合情况.方法 原代培养大鼠大脑皮质神经元经KA或对照溶剂(双蒸水)处理后,采用染色质免疫沉淀(ChIP)及聚合酶链反应(PCR)技术检测神经元中p53蛋白与p21基因启动子区p53反应元件1(RE1)及反应元件2(RE2)的结合情况,Western印迹检测免疫沉淀中的p53蛋白以验证ChIP抗体特异性.结果 KA处理组,p53抗体沉淀的染色质中包含p21基因启动子区含有p53 RE1的DNA序列,免疫沉淀样品中含有p53蛋白.结论 KA处理后神经元内p53蛋白与p21基因启动子区p53 RE1结合增加.
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苯中毒病人 TOPO Ⅱα启动子调控因子 Sp1组蛋白化学修饰改变
目的：研究拓扑异构酶Ⅱα（ TOPOⅡα）启动子调控因子SP1组蛋白化学修饰在苯中毒病人中的改变。方法：25例临床慢性苯中毒患者骨髓单个核细胞为病例组，25例正常人骨髓单个核细胞为对照组，染色质免疫沉淀技术探讨TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白乙酰化和甲基化水平的变化，RT－PCR法测定Sp1 mRNA的表达水平。结果：与对照组相比，临床苯中毒病例TOPOⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白H4和H3乙酰化水平下降（P＜0．01），组蛋白H3K9甲基化水平升高（P＜0．01），组蛋白H3K4甲基化水平无明显改变。与正常对照组相比，临床苯中毒病例TOPOⅡα启动子调控因子Sp1的mRNA表达水平降低（ P＜0．05）。结论：慢性苯中毒TO－POⅡα启动子调控因子Sp1组蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化修饰水平的改变伴随着mRNA水平的变化。TOPOⅡα启动子调控因子Sp1可能通过组蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化修饰改变在苯中毒所致的造血毒性中发挥作用。
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PDCD5对肥厚心肌的保护作用及作用机制
目的：探讨程序性细胞死亡分子5（PDCD5）在心肌肥厚发生发展过程中的作用及机制。方法：腹主动脉缩窄术（AAC）建立大鼠心肌肥厚病理模型；苯肾上腺素（ PE）刺激分离培养的乳鼠心肌细胞肥大；RT－PCR和蛋白印迹实验分别检测mRNA及蛋白表达；含PDCD5 cDNA腺病毒或PDCD5 shRNA腺病毒转染心肌细胞以过表达或敲低PDCD5；萤光素酶报告基因系统及染色质免疫沉淀技术检测活化T细胞核因子（ NFAT）与PDCD5启动子区的结合。结果：在AAC所致肥厚心肌组织及PE刺激的肥大心肌细胞中，PDCD5表达量均显著增加；PDCD5过表达可抑制PE诱导的心肌肥大，而敲低PDCD5则诱导心肌细胞肥大并加重PE刺激的心肌肥大。肥大心肌细胞中NFAT表达量增高，升高的NFAT可与PDCD5启动子结合，上调PDCD5表达量。结论：心肌肥大过程通过NFAT信号通路上调PDCD5表达量，增高的PDCD5反馈性抑制心肌肥大，从而对心肌起保护作用。
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细胞色素P450表氧化酶2J2及其代谢产物EETs通过PPARα发挥抗心肌肥厚的作用及机制研究
目的：心肌肥厚是心脏对于压力负荷或者容量负荷所产生的适应性反应。细胞色素P450表氧化酶2J2（CYP 2J2）及其代谢产物EETs可以发挥抵抗心肌肥厚的作用，而其中的机制仍有待进一步探索。方法和结果：在体内研究中，我们采用PPARα缺陷小鼠以及野生小鼠为研究对象，并采用血管紧张素II（ Ang II）诱导小鼠发生心肌肥厚。结果表明，Ang II可以明显诱导心肌肥厚，具体包括心脏肥大、心脏功能减低和心肌肥厚标志物表达增加。而在野生小鼠中，CYP 2J2过表达可以抑制Ang II所诱导的心肌肥厚，但是这一抑制作用在PPARα缺陷小鼠则没有体现。在离体研究中，我们以大鼠乳鼠心肌细胞作为研究对象并采用Ang II作为诱导因子。研究表明，外源性加入11，12－EET可明显抑制Ang II所诱导的心肌肥大，而PPARα特异性阻断剂GW6471可以阻断11，12－EET的作用，并且这一作用可能与Ras／MAPK以及NF－κB通路有关。另外，我们通过荧光报告基因系统以及染色质免疫沉淀实验证实， PPARα可以直接结合到caveolin－1的转录子区，并诱导caveolin－1的表达，而且采用siRNA介导caveolin－1的沉默，可以抑制11，12－EET抵抗Ang II的效应。结论：CYP 2J2及其代谢产物EETs可以通过PPARα缓解Ang II诱导的心肌肥厚，这一作用可能与其在转录水平上调caveolin－1的表达，并进一步抑制Ras／MAPK和NF－κB通路有关。
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MIPU1上调基质金属蛋白酶14促进血管新生
目的：探讨转录因子心肌缺血预处理上调蛋白1（ myocardial ischemic preconditioning upregulated protein 1， MIPU1）促进血管新生的分子机制。方法：mRNA测序分析MIPU1过表达人脐静脉内皮细胞（ HUVEC ）的mRNA差异表达；染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation， CHIP）检测MIPU1与基质金属蛋白酶14（matrix metalloproteinase 14， MMP14）启动子区结合情况；采用Matrigel、划痕和Transwell分析HUVEC管型形成和迁移；采用Western blot和定量PCR分别检测MIPU1和MMP14蛋白质和mRNA表达；采用LAD建立慢性心肌缺血小鼠模型，采用HE染色和CD31免疫组化分析缺血心肌组织形态学变化及微血管形成。结果：免疫组化和HE染色显示与假手术组相比，缺血心肌中组织损伤加重伴随有CD31＋微血管数目增加，同时心肌组织中MMP14和MIPU1蛋白和mRNA表达增加。 RNA测序显示与对照组相比MIPU1过表达HUVEC中MMP14 mR－NA增加约4倍。 MMP14特异性siRNA转染显著下调MMP14蛋白表达后，可抑制MIPU1促HUVEC管型形成和迁移作用；相反，MMP14过表达可增加MIPU1的上述作用。生物信息学分析显示MMP14启动子区含有2个MIPU1结合元件核心序列（“CTTA”），CHIP结果显示MIPU1与MMP14启动子区－217～－221 bp和－110～－106 bp处的“CTTA”有结合。结论：MIPU1通过上调MMP14促进HUVEC的管型形成和迁移作用，这一调节机制可能参与缺血心肌中微血管新生过程。
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ZNF667调节VEGF－VASH1通路促进血管新生
目的：VEGF－VASH1（vasohibin－1）通路在血管新生过程的精细调节中发挥重要作用，转录因子锌指蛋白667（zinc finger protein 667， ZNF667）具有促进血管新生作用。本研究主要探讨ZNF667对上述通路中VEGF和VASH1表达的调控，以期阐明ZNF667促进血管新生的分子机制。方法：采用LAD建立慢性心肌缺血小鼠模型，采用HE染色和CD31免疫组化分析缺血心肌组织形态学变化及微血管形成。采用Matrigel、划痕和Transwell分析HUVEC管型形成和迁移；采用Western blot、ELISA和定量PCR分别检测ZNF667和VASH1蛋白质和mRNA表达；mRNA测序分析ZNF667过表达HUVEC的mRNA差异表达；染色质免疫沉淀（ chromatin immunoprecipitation ， ChIP）检测ZNF667与VEGF和VASH1启动子区结合情况。结果：免疫组化和HE染色显示与假手术组相比，缺血心肌中组织损伤加重伴随有CD31＋微血管数目增加，同时心肌组织中VEGF和ZNF667蛋白和mRNA表达呈时间依赖性增加，而VASH1表达降低。 mRNA测序、ELISA和定量PCR显示ZNF667过表达可促进HUVEC中VEGF表达而抑制VASH1表达。 VASH1过表达可抑制VEGF和ZNF667的促HUVEC管型形成和迁移作用。 ChIP显示ZNF667与VEGF（－346～－350 bp；－265～－269 bp）和VASH1（－170～－175 bp）基因启动子区结合。结论：HUVEC中ZNF667靶向调节VEGF－VASH1通路促进管型形成和迁移作用，这一调节机制可能参与缺血心肌中微血管新生过程。
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染色质免疫沉淀技术及其在结直肠癌研究中的应用
基因表达调控是当前功能基因组学的一个重要领域,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核基因表达机制的基本途径.染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)技术近年被广泛用于研究体内染色质结构、组蛋白修饰在基因表达中的作用、灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况,并已成为研究染色质水平基因表达调控的有效的方法[1],活跃表达基因的启动子和增强子等调节区域呈现组蛋白的高乙酰化,而沉默基因的相应区域则呈现组蛋白的低乙酰化[2,3].
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人肝细胞中雌激素受体α基因启动子使用情况的鉴定
目的 鉴定人肝细胞中雌激素受体α(estrogen receptorα,ESR1)基因启动子使用情况.方法 常规培养和刺激HepG2和L02细胞,甲醛固定细胞,超声剪切染色质,采用利用PolⅡ CTD末端Ser5特异性抗体进行染色质免疫沉淀(PolⅡ-ChIP),针对文献报道的8个可能启动子区设计引物进行PCR扩增,鉴定ESR1基因启动子的使用情况.结果 β-雌二醇刺激不同肝细胞后进行PolⅡ-ChIP发现,HepG2肝癌细胞株中ESR1启动子E1、E2、F沉淀出有PolⅡ的结合的片段,而在L02细胞株中则仅启动子D有PolⅡ的结合的片段沉淀出来.结论 不同肝细胞中ESR1的表达受不同的启动子的调控.HepG2肝癌细胞株中ESR1的表达受启动子E1、E2、F调控,而在L02细胞株中ESR1的表达受启动子D调控.
关键词： 雌激素受体α(ESR1) 启动子 RNA多聚酶Ⅱ 染色质免疫沉淀 -
染色质免疫沉淀分析胰岛β细胞中TCF7L2与GPR40的结合
目的 探讨转录因子TCF7L2与GPR40基因启动子的相互作用.方法 采用染色质免疫沉淀(CHIP)技术,在胰岛βTC6细胞株中,用TCF7L2特异性抗体沉淀DNA,聚合酶联式反应(PCR)检测GPR40基因5′特异性序列.结果 在TCF7L2特异性抗体免疫沉淀的DNA片段中,扩增出GPR40基因5′特异性序列.结论 在胰岛βTC6细胞中,转录因子TCF7L2与GPR40基因启动子存在特异的结合区域,TCF7L2可能参与GPR40的表达调控.
