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α-鹅膏蕈碱诱导小鼠肝细胞凋亡的实验研究
目的探讨α-鹅膏蕈碱(α-amanitin AMA)是否可诱导在体小鼠肝细胞凋亡,以及可能的剂量依赖性效应和时间依赖性效应.方法 30只健康雄性昆明小白鼠被分为6组,每组5只. A组经腹腔注射生理盐,B,C,D组分别经腹腔注射AMA 0.8,1.2,2.0 μg/g(体重),观察终止时点为24 h,用于观察肝细胞凋亡剂量依赖性效应.E和F组经腹腔注射AMA 2.0 μg/g(体重).观察终止时点为16 h和36 h,与A和D组一起用于对凋亡的时间依赖性效应进行分析.采用光学显微镜、透射电镜、琼脂糖凝胶电泳技术和TUNEL法检测小鼠肝细胞是否存在凋亡以及凋亡的效应.结果实验组小鼠肝脏切片中均出现典型的凋亡形态学改变,琼脂糖凝胶电泳呈现DNA"梯带",TUNEL检测可见细胞核着色呈棕黄色的凋亡细胞.从剂量依赖性效应分析,A～D组的肝细胞凋亡指数分别为1.08%,4.88%,7.36%和9.20%,差异具有显著性(P＜0.05).从时间依赖性效应分析,A,E,D和F组的肝细胞凋亡指数分别为1.08%,5.68%,9.20%和14.44%,差异具有显著性(P＜0.05).结论α-鹅膏蕈碱能诱导小鼠肝细胞凋亡,并且在一定剂量范围内具有剂量依赖性和时间依赖性效应,肝细胞凋亡率随剂量的增大和作用时间延长而增加.
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Pol Ⅱ-ChIP-PE-MS方法的建立及其在SNP功能研究中的应用
目的:建立RNA多聚酶Ⅱ-染色质免疫沉淀-引物延伸-飞行时间质谱技术(PolⅡ-ChIP-PE-MS),并利用该方法检测SNP等位特异磷酸化PolⅡ结合量,为活体状态下研究疾病关联基因SNP的功能研究提供一种高通量的研究手段.方法:采用PCR-RFLP方法对HepG2细胞印迹基因SNRPN(仅父源等位基因表达)基因组DNA和cDNA进行基因分型,利用PolⅡCTD末端Ser5特异性抗体进行染色质免疫沉淀,针对SNP位点两侧序列设计PCR引物和延伸引物,以外侧引物进行PCR扩增,采用延伸引物进行VLET引物延伸,产物纯化后经MALDI-TOF质谱鉴定.结果:对SNRPN杂合子细胞的SNRPN C1654312T SNP进行PolⅡ-ChIP-PE-MS分析发现,基因组DNA样本和染色质免疫沉淀前样本在C、T等位点都包含相同PolⅡ结合量,但免疫沉淀后标本(被磷酸化RNA多聚酶Ⅱ结合的染色质)就仅在T等位点有结合,与产生mRNA转录的等位点相对应.结论:成功建立起PolⅡ-ChIP-PE-MS方法,利用该方法检测SNP等位特异磷酸化PolⅡ结合量是可靠的,可以利用PolⅡ-ChIP-PE-MS策略鉴定疾病关联基因SNP的功能.
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α-鹅膏蕈碱与细胞凋亡
鹅膏菌毒素的研究已有100多年的历史,但直到50年代以后随着分离新技术的发展,才使鹅膏蕈碱以及毒理作用的研究达到较高的深度.鹅膏菌毒素按其氨基酸的组成和结构分为鹅膏毒环肽(amatoxins)、鬼笔毒环肽(phallotoxins)和毒伞肽(virotoxins)三类.其中α-鹅膏蕈碱是致死鹅膏菌属中毒的成分,它是一种含有几种特殊氨基酸的环八肽[1],作用于真核生物细胞时,能专一性的抑制真核生物的RNA多聚酶Ⅱ,阻止mRNA的延长,从而抑制细胞内转录和蛋白质合成,α-鹅膏蕈碱被肝细胞吸收后出现肝功能衰竭,当时的病理学研究表现为坏死性改变[2,3].但是,在近的一些研究过程中发现,α-鹅膏蕈碱对肝细胞的毒理作用可能存在第二种机制即导致肝细胞凋亡[4,5].
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人p100蛋白:可增强STAT6基因转录活性的新因子
目的:建立可稳定表达人类p100蛋白的细胞株,研究细胞内p100蛋白参与STAT6介导的基因转录调控的机制.方法:利用免疫共沉淀法检测蛋白与蛋白间结合,荧光素酶法测定STAT6基因转录活性.结果:p100既可与STAT6结合,亦可与RBA多聚酶Ⅱ结合,并能增强STAT6介导的基因转录活性.结论:p100蛋白是STAT6共激活因子,可桥连STAT6和基本转录调控元件,促进STAT6介导的基因转录活性.
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人肝细胞中雌激素受体α基因启动子使用情况的鉴定
目的 鉴定人肝细胞中雌激素受体α(estrogen receptorα,ESR1)基因启动子使用情况.方法 常规培养和刺激HepG2和L02细胞,甲醛固定细胞,超声剪切染色质,采用利用PolⅡ CTD末端Ser5特异性抗体进行染色质免疫沉淀(PolⅡ-ChIP),针对文献报道的8个可能启动子区设计引物进行PCR扩增,鉴定ESR1基因启动子的使用情况.结果 β-雌二醇刺激不同肝细胞后进行PolⅡ-ChIP发现,HepG2肝癌细胞株中ESR1启动子E1、E2、F沉淀出有PolⅡ的结合的片段,而在L02细胞株中则仅启动子D有PolⅡ的结合的片段沉淀出来.结论 不同肝细胞中ESR1的表达受不同的启动子的调控.HepG2肝癌细胞株中ESR1的表达受启动子E1、E2、F调控,而在L02细胞株中ESR1的表达受启动子D调控.
关键词： 雌激素受体α(ESR1) 启动子 RNA多聚酶Ⅱ 染色质免疫沉淀
