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染色质免疫共沉淀(ChIP)
染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
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胰岛素样生长因子-1受体在肿瘤细胞的内化和泛素化分析
我们采用免疫印迹法(Western blot)、免疫沉淀技术(IP)和流式细胞仪(FACS)技术对鼠胚胎成纤维瘤三种细胞株胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1R)的内化进行检测,探讨IGF-1R的内化在受体下行调节和β-arrestin在IGF-1R蛋白内化/泛素化降解中的作用.
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二甲双胍通过激活AMPK和抑制HNF4α而抑制血管紧张素II引起的TGF-β1产生
目的:近年来研究发现一线降糖药二甲双胍( metformin)可通过激活AMPK发挥心血管保护作用。本研究旨在探讨met-formin能否通过激活AMPK抑制Ang II引起的心脏成纤维细胞TGF-β1产生及其相关机制。方法:10周龄野生型C57BL/6和AMPKα2-/-小鼠,皮下植入微渗泵给予Ang II (3 mg? kg-1? d-1)7 d,同时皮下注射metformin(200 mg? kg-1? d-1)。原代分离培养成年小鼠心脏成纤维细胞( AMCF)。采用real-time PCR、Western blot、双萤光素酶报告基因实验、染色质免疫沉淀技术( ChIP)等方法进行研究。结果:在野生型C57BL/6小鼠,metformin可抑制Ang II引起的心脏纤维化及TGF-β1的产生,而在AMPKα2-/-小鼠中,metformin则不能抑制Ang II引起的纤维化和TGF-β1产生。在野生型AMCF,metformin抑制Ang II引起的TGF-β1的产生,Compound C( AMPK抑制剂)能够逆转metformin的抑制作用。进一步研究发现,Ang II上调肝细胞核因子4α( HNF4α)蛋白表达,增加HNF4α与TGF-β1基因启动子区的结合,双萤光素酶报告基因实验证实HNF4α作用于TGF-β1基因启动子区,并介导其转录。 HNF4α腺病毒过表达可增加AMCF中TGF-β1的产生;相反,通过慢病毒转染HNF4αsiRNA后,Ang II引起的TGF-β1生成增加被抑制。这些结果提示HNF4α介导Ang II引起的TGF-β1转录表达。 Metformin可抑制Ang II引起的HNF4α蛋白上调,Compound C可以逆转此作用,同时ChIP结果也表明metformin能够抑制Ang II引起的HNF4α与TGF-β1的结合。结论:Metformin通过激活AMPK抑制HNF4α蛋白表达及其与TGF-β1转录区的结合,进而抑制Ang II引起的TGF-β1转录表达增加。
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血管内皮TRPP2/TRPV4通道复合体参与调节盐敏感性高血压大鼠血管内皮功能
目的:探讨肠系膜动脉内皮细胞上( MAECs)是否天然共定位TRPP2/TRPV4通道复合体,且该复合体在盐敏感高血压发展过程中的作用。方法:利用免疫沉淀技术证实MAECs形成天然TRPP2/TRPV4复合体;将盐敏感( SS)和盐抵抗( SR)大鼠分别喂养正常盐和高盐饲料,3周后检测血压和血浆醛固酮水平;利用血管开放式膜片钳,观察高盐饮食是否影响MAECs上TRPP2/TRPV4活性;利用分子生物学和膜片钳体外观察高盐和醛固酮对该复合体的影响。结果:TRPP2/TRPV4在MAECs上天然定位,并介导内皮细胞NO产生;在SS鼠中,高盐导致该通道活性和表达降低;体外实验证明高盐和醛固酮均抑制TR-PP2/TRPV4活性。结论:在盐敏感高血压发展过程中,MAECs上TRPP2/TRPV4通道活性和表达下降,其机制可能是由高盐和醛固酮协同介导。
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染色质免疫沉淀技术及其在结直肠癌研究中的应用
基因表达调控是当前功能基因组学的一个重要领域,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核基因表达机制的基本途径.染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)技术近年被广泛用于研究体内染色质结构、组蛋白修饰在基因表达中的作用、灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段的结合情况,并已成为研究染色质水平基因表达调控的有效的方法[1],活跃表达基因的启动子和增强子等调节区域呈现组蛋白的高乙酰化,而沉默基因的相应区域则呈现组蛋白的低乙酰化[2,3].