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双基因共表达在血管再狭窄研究中的应用
目的观察携带反义凝血酶受体(ATR)和p21的双基因载体共表达后对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用,为再狭窄基因治疗寻求新途径. 方法以携带ATR或/和p21的单、双基因载体重组腺病毒伴随病毒(rAAV)感染培养的人主动脉平滑肌细胞(hASMC),用半定量RT-PCR检测各基因的整合与表达,MTT法测定病毒感染后不同时间点的细胞存活率.将携带AP双基因的rAAV导入WKY大鼠拉伤侧的颈总动脉,免疫组织化学法分别检测凝血酶受体(TR)和p21两基因在动脉壁中的表达. 结果 RT-PCR结果显示,TR单基因的mRNA表达降低,p21单基因表达升高,AP双基因得到了共表达;MTT法测定的生长曲线显示,双基因对hASMC增殖的抑制作用大于两个单基因;免疫组织化学证实,AP双基因导入后,TR基因的表达受到完全抑制,p21基因的表达明显增加,血管新生内膜与平滑肌细胞的增殖受到了抑制. 结论 ATR和p21双基因共表达在体外可明显抑制ASMC的增殖,在体内可明显抑制血管内膜新生和中膜的增生.
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P53,P21,nm23和PCNA在原发性肝癌中的表达与预后的关系
用免疫组化方法检测P53、P21、nm23和PCNA在原发性肝细胞癌(primary hepatocellular carcinoma, PHC)中表达与预后的关系,并探讨PHC的某些致癌机制.
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RNA干扰p21对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响
目的:探讨RNA干扰技术沉默p21基因对肝癌细胞SMMC-7721增殖及恶性表型变化的影响.方法:通过慢病毒载体将p21小干扰RNA片段稳定转染入SMMC-7721细胞,通过RT-PCR,Western blot分别检MJp21 Mrna和蛋白表达变化,流式细胞仪检测7721-p2l RNAi组(感染p21 siRNA慢病毒载体组)、7721-NC组(感染阴性对照慢病毒载体组)、7721组(未转染组)细胞生长周期,MTT法检测转染后SMMC-7721细胞生长情况,细胞克隆形成实验检测单细胞锚定依赖性成克隆能力.结果:慢病毒载体可有效介导p21小干扰RNA片段进入SMMC-7721细胞,经RTPCR及West-ern blot检测,p2l小干扰RNA可以明显降低SMMC-7721细胞p21 Mrna和蛋白的表达.流式细胞仪检测细胞周期发现,各组G0/G1期比例分别为32.82%±3.27%,61.25%±0.76%,57.77%±4.08%,S期比例分别为42.56%±5.62%,22.91%±1.53%,25.13%±5.11%.经统计学分析,7721-p2l RNAi组.G0/G1期比例较其余两组下降(P<0.05),S期比例较其余两组升高(P<0.05),而7721-NC组与7721组相比差异无显著性.MTT法检测细胞生长速度发现,与7721-NC和7721组细胞相比,7721-p21RNAi组细胞的生长速度较快,每天的活细胞数目均多于另外两种细胞系(P<0.05).细胞克隆形成实验发现7721-p21 RNAi组、7721-NC组及7721组克隆形成数分别为81.24±1.5,51.67±2.08,52.73±1.53个.7721-p21 RNAi组克隆形成数明显多于7721-NC组、7721组(P<0.05),7721-NC组克隆形成数与7721组无明显差异.表明p21表达下降可加速SMMC-7721细胞从G1期进入S期,细胞生长速度加快,单细胞锚定依赖性成克隆能力增强.结论:本研究通过RNA干扰技术反向验证了p21具有抑制肝癌细胞生长及细胞周期进程的作用,为下一步深入研究p21抑制细胞增殖的机制及在肝癌发生发展中所起的作用打下了基础.
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联合转染P21基因及反义c-fos核酸对自体移植静脉内膜增生的影响
目的探讨联合转染P21基因及反义c-fos核酸对自体移植静脉内膜增生的影响,探索一种理想的血管再狭窄的基因疗法.方法选择20只新西兰家兔,实验组10只,对照组10只,均行自体颈外静脉、颈总动脉移植手术,实验组行腺病毒介导的P21cDNA溶液浸泡和反义c-fos聚核酸凝胶涂布;对照组行空载腺病毒溶液浸泡和凝胶涂布.术后2周取出移植血管,分别行病理学、免疫组织化学检测移植血管内膜厚度,内膜血管平滑肌细胞(VSMC)数及内膜平滑肌细胞增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达情况.结果实验组移植血管内膜厚度、管腔狭窄度及VSMC数均较对照组减少(P＜0.01),PCNA阳性表达情况亦较对照组明显减少(P＜0.01).结论联合转染P21基因及反义c-fos核酸可有效地抑制移植静脉内膜增生,是一种有效防治移植静脉再狭窄的基因疗法.
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ras和p53基因在原发性胆囊癌早期诊断中的应用研究
目的研究p53和ras基因在原发性胆囊癌早期诊断中的应用价值.方法用免疫组化的方法分别检测炎症组、增生组、非典型增生组、癌变组的胆囊黏膜P53和P21蛋白的阳性表达.结果 P53蛋白在非典型增生组开始表达,与癌变组的阳性表达率无显著性差异;P21蛋白在癌变组高表达,炎症组低表达,两组间有显著性差异;两种蛋白的阳性强度随病变的恶性程度逐渐增加.结论 p53和ras基因在胆囊癌早期诊断方面有较高的应用价值.
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微小核糖核酸miR3619-5p对膀胱癌细胞系EJ和T24细胞增殖的影响
目的 探讨微小核糖核酸miR-3619-5p对膀胱癌细胞系EJ和T24细胞增殖的影响.方法 2015年10月至2016年3月对膀胱癌细胞系EJ和T24细胞分别分为3组:阴性对照组转染随机序列dsControl,阳性对照组转染dsP21-322,实验组转染miR-3619-5p.实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测3组细胞p21、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)以及细胞周期依赖性激酶(CDK4、CDK6)mRNA的表达;蛋白质印迹法检测p21、CyclinD1、CDK4及CDK6蛋白的表达;流式细胞术测定3组的细胞周期分布;集落形成实验检测单个细胞克隆增殖情况;细胞增殖实验检测转染后各组细胞的增殖能力.结果 qPCR结果显示,阴性对照组EJ和T24细胞中p21、CyclinD1、CDK4、CDK6 mRNA的相对表达量△Ct分别为(11.4±1.3)和(12.8±1.6)、(5.8±1.2)和(6.2±1.2)、(4.1±0.8)和(7.8±1.2)、(9.7±1.1)和(10.8±1.2),实验组分别为(9.5±0.9)和(8.7±0.8)、(7.1±0.9)和(7.6±0.8)、(5.6±0.9)和(9.1±0.9)、(10.9±0.9)和(12.0±0.8),两组比较差异均有统计学意义(均P ＜0.05).蛋白质印迹法检测结果显示,实验组EJ和T24细胞中p21、CyclinD1、CDK4、CDK6蛋白相对表达量分别为(0.92 ±0.27)、(0.16±0.05)、(0.51±0.14)、(0.13±0.04)和(0.78±0.24)、(0.15±0.06)、(0.63±0.18)、(0.23±0.11);阴性对照组分别为(0.23±0.05)、(0.42±0.08)、(1.13 ±0.14)、(0.52±0.11)和(0.14 ±0.04)、(0.85±0.13)、(0.62±0.14)、(0.57±0.12),两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).流式细胞术检测结果显示,实验组EJ和T24细胞中G0/G1期细胞比例分别为(56.64±1.10)％和(62.33±0.98)％,阳性对照组分别为(65.07±0.94)％和(70.46±1.56)％,阴性对照组分别为(46.48±1.03)％和(65.07±0.94)％,实验组和阳性对照组与阴性对照组比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).细胞集落形成实验结果显示,阳性对照组EJ和T24细胞集落形成相对数量分别为(0.102±0.013)和(0.089±0.011),实验组分别为(0.119 ±0.012)和(0.110 ±0.013),阴性对照组分别为(0.218 ±0.016)和(0.210±0.017),实验组和阳性对照组与阴性对照组比较差异均有统计学意义(均P ＜0.05).细胞增殖实验结果显示,实验组EJ和T24细胞转染48 h、72 h、96 h的吸光度A值分别为(0.661 ±0.072)、(0.911 ±0.118)、(1.057 ±0.107)和(0.672 ±0.063)、(0.990 ±0.096)、(1.138 ±0.095),阳性对照组分别为(0.705±0.087)、(0.900±0.092)、(1.055 ±0.127)和(0.704 ±0.087)、(0.975 ±0.119)、(1.118±0.071),阴性对照组分别为(0.812 ±0.079)、(1.052 ±0.083)、(1.450±0.097)和(0.858 ±0.058)、(1.195±0.059)、(1.474±0.102),实验组和阳性对照组与阴性对照组比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 miR3619-5p可以通过上调p21蛋白的表达,将细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制膀胱癌细胞的增殖作用.
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维甲酸诱导基因G蛋白调控p21基因表达的机制
目的 研究维甲酸诱导基因G(RIG-G)蛋白调控p21基因表达的相关机制.方法 采用Western blot法检测白血病细胞株NB4中过表达RIG-G蛋白对p21蛋白表达的影响,以及U937细胞中过表达RIG-G蛋白对c-Jun和JNK蛋白磷酸化水平的影响.将c-Jun表达质粒与含p21基因启动子的报告基因质粒共同转染至293T细胞,采用荧光素酶报告基因实验研究c-Jun蛋白对p21基因的表达调控作用.结果 Western blot法检测结果显示,在NB4细胞中过表达RIG-G蛋白能明显上调p21蛋白的表达水平;而且在全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞分化的过程中,随着内源性RIG-G蛋白被明显地诱导表达,p21蛋白的表达水平也明显升高.在过表达RIG-G蛋白的U937细胞中,JNK和c-Jun蛋白的磷酸化水平均明显下降,而JNK和c-Jun总蛋白的表达水平则无明显变化.当U937细胞中加入JNK抑制剂SP600125后,尽管JNK蛋白的磷酸化被完全抑制,但与对照细胞U937T-pTRE比较,过表达RIG-G蛋白的U937T-RIG-G细胞中,c-Jun蛋白的磷酸化水平依然明显下降.表明RIG-G蛋白不仅能通过JNK信号通路抑制c-Jun蛋白的磷酸化,也可以以不依赖JNK信号途径的方式下调c-Jun蛋白的磷酸化水平.荧光素酶报告基因检测结果则显示,当293T细胞中分别转染0.1、0.5、1.0和2.0 μg c-Jun表达质粒时,荧光素酶报告基因的活性分别为转染空载体组的(83.0±1.7)％、(73.7±0.7)％、(68.9±0.9)％和(64.1±0.9)％,提示c-Jun蛋白能抑制p21基因的转录表达活性.结论 在U937细胞中,过表达RIG-G蛋白能通过多条不同的信号途径共同下调c-Jun蛋白的磷酸化水平,终使p21基因的表达水平升高,发挥阻断细胞周期进程,抑制细胞生长的功能.
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曲古抑菌素A抑制肿瘤细胞增殖及提高p21基因表达
目的:探讨组蛋白乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对人肿瘤细胞的杀伤作用和机制.方法:选用3种人肿瘤细胞株,即白血病细胞株HL-60、非小细胞肺癌细胞株A549、乳癌细胞株MCF-7,采用MTT法检测TSA作用后肿瘤细胞的增殖状态;用流式细胞仪定量分析肿瘤细胞增殖周期的改变;用半定量RT-PCR法测定细胞周期相关基因p21的表达.结果:TSA能有效抑制肿瘤细胞的增殖,呈剂量依赖性;在接近各细胞IC50浓度的TSA作用下,可使肿瘤细胞主要阻滞在G2/M期,而S期细胞明显减少;TSA作用48 h内即可引起细胞周期相关基因p21的表达显著增强.结论:TSA在体外能有效抑制多种人肿瘤细胞的生长,具有广谱抗肿瘤效应;其抗肿瘤生长机制可能是通过细胞周期阻滞和上调p21基因表达水平实现的.
关键词： 肿瘤 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 曲古抑菌素A p21基因 细胞周期 -
辐射对Jurkat细胞P21蛋白及ICR小鼠胸腺细胞p21基因表达的影响
目的 探讨电离辐射对Jurkat细胞P21蛋白和ICR小鼠胸腺细胞p21基因表达的影响.方法 采用流式细胞术(FCM),检测0、0.5、1.0、2.0、4.0及6.0 Gy X射线照射后Jurkat细胞中P21蛋白表达的变化.采用实时定量PCR技术,分别检测0、0.5、1.0、2.0、4.0及6.0 Gy X射线照射后4和24 hd'鼠胸腺及脾细胞中p21基因表达的变化.结果 不同剂量X射线照射后12和24 h,Jurkat细胞中P21蛋白表达在0.5～4.0 Gy范围内均随剂量的增大而升高(t=-24.23～-3.96,P<0.05),6 Gy时均出现表达下降(t=-11.19、-14.50,P<0.05);与假照射组相比,在0～6.0 Gy照射后4和24 h,小鼠胸腺及脾细胞中p21基因的相对表达量均随剂量增大逐渐增加(t=-29.96～8.80,P<0.05);并于6.0 Gy时达高(t=-11.84～-3.42,P<0.05),仅胸腺细胞1 Gy照射后4 h除外(t=-3.42,P>0.05).结论 x射线能诱导P21蛋白及基因表达增加,并在一定剂量范围内存在良好的剂量-效应关系.
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反义TR和p21双基因共表达对人主动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的作用
目的观察携带反义凝血酶受体(ATR)或/和p21的单、双基因重组腺病毒伴随病毒(rAAV)载体对人主动脉平滑肌细胞(ASMC)增殖与凋亡的影响.方法以携带ATR或/和p21的单、双基因rAAV感染人ASMC.半定量RT-PCR检测各基因的整合与表达;MTT法测定感染不同时间点的细胞存活率;流式细胞术检测细胞周期与凋亡细胞数目的变化;吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色检测凋亡细胞的比率.结果单、双基因在ASMC中均获得整合,且双基因发生了共表达;病毒感染4 d时,ATR组、p21组和AP双基因组的细胞存活率与对照组相比分别降低了16.7%、21.6%和29.4%;三组的G0/G1期细胞数分别为(61.8±2.9)%、(82.5±4.0)%和(80.4±6.1)%;凋亡细胞数为(4.8±0.5)%、(5.7±0.1)%和(9.2±0.9)%;AO/EB染色显示的凋亡细胞比率分别为:对照组(1.5±0.8)%、ATR组(7.2±3.3)%、p21组(10.7±5.6)%、AP组(18.3±2.7)%.结论(1)双基因共表达对抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用均较单基因具有较强的生物学效应.(2)为再狭窄的基因治疗提示了更优化的途径.
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p21抑制人血管平滑肌细胞增殖的研究
目的探讨p21基因转染诱导体外培养的人血管平滑肌细胞( HVSMC)凋亡进而抑制其增殖的可能作用机制.方法通过腺病毒介导将外源性p21基因转入HVSMC,利用印迹杂交分析、荧光染色分析等对p21基因的表达、靶细胞增殖抑制及凋亡、组织型转谷氨酰胺酶(tTG)的表达进行分析.结果外源性p21基因高水平的表达显著抑制了靶细胞的增殖(P<0.01),tTG表达的显著升高及荧光染色检测均提示靶细胞发生了凋亡.结论 p21基因的过度表达可诱导HVSMC凋亡并能抑制其增殖,这一过程可能与tTG的高表达有关.
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砷及其代谢产物对P21基因表达的影响
目的 探讨砷及砷化物对人肺腺癌细胞系A549细胞、云南宣威肺腺癌细胞XWLC-05细胞、人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中的P21基因表达的影响.方法 以亚砷酸钠、一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)处理A549细胞、XWLC-05细胞、MDA-MB-231细胞并以荧光定量聚合酶链式反应(qRTPCR)法检测P21mRNA的表达;以不同浓度的亚砷酸钠处理A549细胞、XWLC-05细胞、MDA-M B-231细胞并以qRT PCR法检测P21基因mRNA的表达.结果 亚砷酸钠可诱导P21基因mRNA的表达,MMA、DMA不能诱导细胞中P21基因mRNA的表达;不同的亚砷酸浓度处理的细胞,可影响细胞中P21基因mRNA的表达.结论 砷可影响细胞中P21基因的表达,并且与剂量存在一定的关系.
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辐射及细胞因子对p21基因表达的调控作用
p21基因是细胞周期的负向调控因子,在一定的因素诱导下,p21基因可有效地引起细胞周期G1期和G2期阻滞,从而在维持基因组稳定性中起重要作用.辐射及TGFβ1、TNFα、PTEN、IGF等因子均可诱导p21基因表达增高,而E1A、c-jun、Tbx2、PLD1和PLD2等因子则抑制p21基因表达.
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p21基因与肿瘤的研究进展
p21基因是Clp家族中的一员,它是位于p53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子.p21可以和p53共同构成细胞周期G1检查站,因DNA损伤后不经过修复则无法通过,减少了受损DNA的复制和积累,从而发挥抑癌作用.研究表明,p21与肿瘤的分化、浸润深度、增生和转移有关,具有判断预后的价值[1].1 p21及肿瘤的关系1.1p21与肿瘤的关系p21与肿瘤的分化、浸润深度、增生和转移有关,具有预后价值.
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血管平滑肌细胞增殖与p21基因启动子甲基化的影响
背景：血管平滑肌细胞增殖、迁移及表型改变是动脉粥样硬化发生的中心环节，一系列相关基因的甲基化参与该过程。
目的：观察血管平滑肌细胞p21基因启动子甲基化对其增殖活性的影响。
方法：采用组织贴块法培养人脐血管平滑肌细胞，给予不同质量浓度氧化低密度脂蛋白(0，10，20，40 mg/L)孵育24 h，甲基化特异PCR检测p21基因启动子区CpG岛甲基化程度，反转录PCR检测p21 mRNA表达， MTT比色法测定血管平滑肌细胞增殖活性。
结果与结论：氧化低密度脂蛋白呈浓度依赖性促进p21启动子甲基化和降低p21 mRNA表达，同时平滑细胞增殖活性增高。提示氧化低密度脂蛋白可以通过p21基因甲基化促进血管平滑肌细胞增殖，p21基因甲基化可能在动脉粥样硬化发生中起到一定作用。 -
肾小管上皮细胞衰老过程中klotho与p53/p21信号通路关系的研究进展
klotho基因是独立的抗衰老基因,而细胞周期调节蛋白p53和p21的激活在肾小管上皮细胞衰老的发生中占据重要地位,研究显示Klotho的抗衰老作用可能与其抑制p53/p21通路的激活有关.
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银屑病患者骨髓HPP-CFC集落形成及p21基因启动子甲基化的研究
目的:研究银屑病患者骨髓高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)集落形成能力及集落细胞p21基因启动子甲基化状态,探讨银屑病患者骨髓造血前体细胞的活性.方法:密度梯度离心法分离银屑病患者及正常对照骨髓单个核细胞,培养于含SCF+GM-CSF+IL-3+IL-6细胞因子组合的甲基纤维素半固体培养基,培养14天时计数HPP-CFC集落,然后收集集落.提取纯化集落细胞DNA,经亚硫酸盐修饰后,采用甲基化特异性PCR(MSP)检测HPP-CFC集落细胞p21基因启动子甲基化状态.结果:(1)在甲基纤维素半固体培养基中,银屑病患者骨髓HPP-CFC集落数显著低于正常对照组,且集落形态较小;(2)正常对照骨髓HPP-CFC p21基因启动子甲基化阳性率较高,而银屑病患者骨髓HPP-CFC p21基因启动子甲基化阳性率低于正常对照组.结论:银屑病患者骨髓造血前体细胞活性有异常;银屑病患者骨髓HPP-CFC p21基因甲基化降低可能与其相对较低的HPP-CFC集落形成能力密切相关.
关键词： 银屑病 高增殖潜能集落形成细胞 p21基因 -
p21WAF1/GIP1基因转染人宫颈癌Hela细胞对顺铂敏感性的影响
目的 探讨转染p21WAF1/CIP1基因(p21基因),对宫颈癌Hela细胞生长抑制作用及p21基因转染Hela细胞对顺铂敏感性的影响.方法 应用脂质体转染技术,将质粒pcDNA3转入人宫颈癌Hela细胞中,经G418筛选,转染阳性克隆细胞连续传代培养,并采用中性红摄入法测定顺铂对p21基因转染人宫颈癌Hela细胞增殖抑制作用,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期变化.结果 经G418筛选,Hela细胞全部死亡,转染质粒pcDNA3的Hela细胞存活,并可连续传代.p21基因转染后,细胞生长明显受到抑制,细胞周期停滞于G1期,与对照组相比,细胞周期G1期比例明显增加.同时p21表达阳性的Hela细胞对顺铂敏感性增强.结论 p21基因转染能使Hela细胞出现生长抑制并对顺铂化疗作用敏感性明显增强.
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p21基因转染人肝癌SMMC-7721 细胞对化疗药物敏感性的研究
目的 探讨p21基因转染人肝癌SMMC-7721 细胞(7721细胞)对化疗药物的敏感性,深入研究p21基因对肝癌细胞的治疗作用.方法 应用磷酸钙介导p21基因转染人肝癌7721细胞;通过 G418筛选稳定表达细胞株并扩大培养;采用MTT法检测肿瘤细胞增殖速度;流式细胞术检测细胞周期变化.结果 经过3～4 w G418筛选得到稳定表达的细胞株,p21基因稳定转染并联合化疗药物应用可明显抑制7721细胞的体外增殖,细胞周期明显改变,细胞从G1期到G2期发生阻滞.结论 提示转染外源p21基因联合化疗药物可使7721细胞周期阻滞于G1期,并可抑制肿瘤细胞增殖.
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亚砷酸钠致小鼠乳腺癌作用机制研究
目的 研究亚砷酸钠(NaAsO2)对小鼠乳腺上皮细胞(NMuMG)的影响,为砷致乳腺癌机制提供理论依据.方法 以小鼠乳腺上皮细胞为模型,研究亚砷酸钠对乳腺上皮细胞形态的影响;经流式细胞仪检测亚砷酸钠对小鼠乳腺上皮细胞凋亡的影响;实时定量RT-PCR检测细胞周期基因P21 mRNAs表达水平.结果 NaAsO2对NMuMG具有毒性效应,在一定浓度范围内,随NaAsO2浓度升高,细胞形态明显改变,凋亡明显增多,且呈剂量-效应关系;细胞增殖的抑制基因P21 mRNA水平增高了18.12倍.结论 亚砷酸钠可能通过上调P21基因的表达来抑制NMuMG增殖,可能是砷中毒引起乳腺癌的发生机制之一.
