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人酪氨酸羟化酶催化核心DNA片段的克隆与表达
目的获得编码人酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)催化核心cDNA片段,并观察其表达.方法采用人的全长THcDNA为模板,设计特定的引物进行PCR扩增反应并构建真核表达载体--质粒pCMVTHC.在对目的片段测序后,将重组质粒转染到大鼠原代培养骨骼肌细胞内,用免疫组织化学方法检测其表达. 结果获得了编码N-端缺失145个氨基酸的酪氨酸羟化酶催化结构域的cDNA片段,其表达载体构建正确.插入片段的DNA序列与人THmRNA相应序列完全一致,将其转入肌细胞内测得有酪氨酸羟化酶表达. 结论本研究结果为帕金森病的基因治疗提供了有价值的新工具.
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PI3K/Akt/mTOR信号转导通路与宫颈癌关系研究进展
1 PI3K/Akt/mTOR信号转导通路及其功能PI3K/Akt/mTOR信号通路(以下简称mTOR通路)可被多种细胞外生长因子配体与跨膜受体结合所产生的细胞增殖信号激活.磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)在生长因子刺激下可磷酸化磷脂酰肌醇(PI)产生3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3),PIP3作为第二信使,随后与Akt结合并将Akt易位于细胞膜.在PI3K依赖性激酶-1(PDK-1)的催化下,Akt催化结构域308位上的苏氨酸(Thr)位点发生磷酸化而被部分激活.
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鼠源性α-1,3-半乳糖基转移酶催化结构域的表达及纯化
目的:表达和纯化鼠源性的α-1,3-半乳糖基转移酶的催化结构域(α1,3 GTcd)以及为在肿瘤细胞表面生成α-gal表位提供了可行性手段.方法:利用pET-15b载体以可溶性形式表达鼠源性α1,3 GTcd.利用高效液相色谱阴离子交换柱检测酶的活性.结果:①成功地构建了带有His-tag的α1,3GTcd重组质粒.②可溶性高效表达与纯化了带有His-tag的α1,3GTcd.③利用HPLC阴离子交换柱检测α1,3GTcd的活性.结论:可溶性地表达了α1,3 GTcd.
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在人消化道肿瘤细胞表面构建α-gal表位的研究
目的 在大肠杆菌中以可溶性形式表达鼠源性α-1,3-半乳糖基转移酶的催化结构域(α1,3 GTcd;catalytic do-main of α1,3GT),利用其在人消化道肿瘤细胞表面构建α-gal表位(Galαl-3Gal-β1-4GlcNAc-R),拟用来制备一种新的自体肿瘤疫苗.方法 利用pET-15 b载体以可溶性形式表达鼠源性α1,3 GTcd,利用高效液相色谱阴离子交换柱检测酶的活性.通过其在人不同消化道肿瘤细胞表面构建α-gal表位,先与人血清孵育,FITC标记的羊抗人的IgG为第二抗体,用流式细胞仪检测荧光强度,以分析α-gal表位的表达结果.结果 可溶性高效表达与纯化了带有His-tag的α1,3GTcd并利用HPLC阴离子交换柱检测α1,3 GTcd的活性.流式细胞仪检测结果证明了在人消化道肿瘤细胞表面成功构建了α-gal表位.结论 本研究可溶性的表达了α1,3 GTcd,并利用其在人消化道肿瘤细胞表面成功地构建了α-gal表位.为该方法的临床治疗的应用打下坚实的基础.
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κ-卡拉胶酶CgkX催化区的重组表达菌株筛选和发酵优化
目的:CgkX是来自Pseudoalteromonas sp.QY203的一种高活性、高稳定性的κ-卡拉胶酶,本文旨在构建CgkX催化结构域(CgkX-CM)重组表达菌株,并对发酵条件进行优化,提高CgkX-CM的产量.方法:在分析κ-卡拉胶酶CgkX-CM基因序列的基础上,构建多种CgkX-CM表达载体,在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行重组表达,通过酶活测定筛选其中产量高的表达菌株,并优化发酵起始pH、诱导温度、IPTG浓度、装液量以及甘氨酸浓度等因素.结果:构建了5种重组表达菌株,其中E.coli BL21(DE3)/pET22b-CgkX-CM酶产量是其他重组菌株的7.4-11.6倍.确定了该菌株佳发酵条件为:培养基含1 g·L-1甘氨酸(起始pH 7.5),装液量为75 mL,0.1 mmol· L-1 IPTG 20℃诱导28 h,酶产量是优化前的7.3倍.结论:经过重组表达载体筛选和发酵优化,CgkX-CM产量大幅度提高,为今后比较CgkX全长及其催化区域的酶学性质,确定C端Big_2结构域对CgkX的作用奠定了基础.
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兔PKCε催化功能域在大肠杆菌中表达与部分纯化
目的通过构建蛋白激酶 Cε原核表达载体以获得纯化的 PKCε蛋白. 方法将 PKCε催化功能域(野生型和突变型)构建至原核表达载体 pUC18上形成重组质粒 pUC-CK和 pUC-CR, 将其转化至大肠杆菌 DH5α细胞中诱导其高效表达. 结果表达产物的 SDS-PAGE电泳及 Western blot检测表明,催化功能域在大肠杆菌中成功表达,并对其进行了部分纯化.结论获得纯化的 PKCε蛋白,为今后大量表达、纯化该酶蛋白作了前期铺垫.
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尖吻蝮蛇AaHⅣ催化结构域和非催化结构域免疫保护性比较
目的 表达尖吻蝮蛇出血性P-Ⅲb型金属蛋白酶AaHⅣ催化结构域和非催化结构域,并鉴定其免疫小鼠后抗体的中和保护性.方法 采用基因合成的方法合成尖吻蝮蛇P-Ⅲ6型金属蛋白酶AaHⅣ的催化结构域和非催化结构域cDNA,分别重组在质粒pET28a(+)上,转入BL21(DE3)中表达,产物经亲和层析纯化.昆明小鼠随机分为催化结构域蛋白免疫组、非催化结构域蛋白免疫组、AaHⅣ免疫组、PBS免疫组,每组6只[4周龄,体质量(20 ±2)g,雌雄各半],3次免疫后分离血清,与AaHⅣ体外孵育后行出血中和实验.结果 ELISA显示重组表达的AaHⅣ催化结构域和非催化结构域均具有免疫原性.出血中和实验显示:催化结构域免疫组和非催化结构域免疫组均较PBS免疫组显著减少出血面积(P ＜0.05);AaHⅣ免疫组与催化结构域免疫组之间无统计学差异(P＞0.05),而与非催化结构域免疫组之间存在统计学差异(P＜0.05).结论 AaHⅣ催化结构域免疫小鼠产生的抗体在中和AaHⅣ出血毒性方面效果更为显著.
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人酪氨酸羟化酶全长及催化结构域序列表达产物酶活性比较
采用人的全长酪氨酸羟化酶cDNA为模板,设计特定的引物进行PCR扩增反应,获得编码N-端缺失141个氨基酸的催化结构域cDNA片段,将其插入谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体pGEX-4T-1中,构建表达质粒pGEXTHc,同时构建其全长片段的表达质粒.pGEXTHa.两者分别转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导可高效表达,产物以可溶形式存在,经亲和层析纯化后以蛋白酶裂解,再经亲和层析分离得到较纯的酶蛋白,采用高效液相色谱法(HPLC-ECD)检测酶活性,结果证明催化结构域活性高于全酶,是全酶活性的2.96倍.
