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小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因转染胃癌GC9811细胞的功能研究
通过RT-PCR从BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞扩增出编码小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的全长cDNA并构建其真核表达载体pCDNA3.1/V5-HisAα1,3GT,pCDNA3.1/V5-HisAα1,3GT通过脂质体转染胃癌GC9811细胞,使胃癌细胞表达Galα(1,3)Gal糖表位,G418筛选2个月内的阳性克隆,RT-PCR鉴定转染细胞,间接免疫荧光染色检测转染真核表达载体的癌细胞Galα(1,3)Gal的表达,利用人体血清内针对Galα(1,3)Gal糖表位的天然抗体对癌细胞进行杀伤.结果表明,成功构建了α1,3-半乳糖基转移酶基因真核表达载体,转染α1,3-半乳糖基转移酶基因的癌细胞高表达Galα(1,3)Gal糖表位,人血清对表达该表位的癌细胞具有杀伤作用.
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六味地黄汤对IgA肾病大鼠外周血C1 GALT1及Cosmc mRNA表达影响研究?
目的：观察六味地黄汤对IgA肾病大鼠外周血C1GALT1及Cosmc mRNA表达,探讨其对IgA糖基化的影响。方法：SD大鼠40只随机分为正常对照组,模型组,雷公藤多苷片组,六味地黄汤组。除正常对照组外均采用运用牛血清白蛋白+脂多糖+四氯化碳方法建立实验性IgA肾病模型。造模成功后连续灌胃4周。将各组大鼠外周血分离的PBMC悬液,采用实时荧光定量PCR检测C1GALT1及Cosmc mRNA的表达,ELISA法测定外周血中IgA含量,凝集素亲和 ELISA 法检测IgA1异常糖基化程度,并进行定量分析。结果：各组C1GALT1mRNA表达量并差异无统计学意义(P>0.05)；在各组Cosmc mRNA表达中,六味地黄汤组及雷公藤多苷片组表达均较模型组升高(P<0.05),但六味地黄汤组表达较雷公藤多苷片组低(P<0.05)；在各组大鼠IgA含量及异常糖基化程度比较中,六味地黄汤组较模型组下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：六味地黄汤可以上调Cosmc mRNA表达,增加C1GALT1活性,改善IgA1糖基化异常,从而下调体内IgA1含量,避免进一步沉积肾脏,延缓IgA肾病的进展。
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小鼠α1,3-半乳糖基转移酶RNA干扰重组慢病毒的构建与鉴定
背景:研究表明,通过抑制α1,3-半乳糖基转移酶的生成而减少甚至避免供体Gala(1,3)Gal的生成,是渡过器官移植后超急性排斥反应的一条切实可行的方法.目的:构建小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的RNA干扰慢病毒载体,有效沉默小鼠血管内皮细胞的α1,3-半乳糖基转移酶基因表达,以期为有效控制异种移植超急性排斥反应提供稳定的转染细胞载体.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-07/2007-05在天津医科大学总医院普外研究所完成.材料:慢病毒载体系统(四质粒)购自Tronolab公司,包装细胞293T细胞株购自中科院上海细胞所.方法:在线软件设计小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因发卡小分子干扰RNA片段.合成的双链DNA片段并将其连接到Tele-sh003/U6.2载体的黏性末端,产生重组质粒Tele-sh003/U6.2-shRNN/α1,3-半乳糖基转移酶.对干扰质粒做测序分析.用磷酸钙法将得到的阳性重组子与慢病毒包装质粒共转化293T细胞,72 h后收集含病毒上清液,超速离心后得到重组慢病毒.用实时定量聚合酶链反应测定病毒滴度.主要观察指标:干扰质粒的测序分析,慢病毒颗粒的包装和滴度测定.结果:小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因小发卡RNA片段被成功克隆进Tele-sh003质粒中,测序结果显示干扰质粒小干扰RNA编码序列与设计片段的序列完全一致.所得慢病毒亦为阳性克隆,经定量聚合酶链反应测定病毒滴度为2×108 Tu/mL.结论:成功构建出小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的小发卡RNA慢病毒RNA干扰表达载体,为进一步控制异种移植超急性排斥反应提供了稳定的转染细胞的载体.
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鼠源性α-1,3-半乳糖基转移酶催化结构域的表达及纯化
目的:表达和纯化鼠源性的α-1,3-半乳糖基转移酶的催化结构域(α1,3 GTcd)以及为在肿瘤细胞表面生成α-gal表位提供了可行性手段.方法:利用pET-15b载体以可溶性形式表达鼠源性α1,3 GTcd.利用高效液相色谱阴离子交换柱检测酶的活性.结果:①成功地构建了带有His-tag的α1,3GTcd重组质粒.②可溶性高效表达与纯化了带有His-tag的α1,3GTcd.③利用HPLC阴离子交换柱检测α1,3GTcd的活性.结论:可溶性地表达了α1,3 GTcd.
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在人消化道肿瘤细胞表面构建α-gal表位的研究
目的 在大肠杆菌中以可溶性形式表达鼠源性α-1,3-半乳糖基转移酶的催化结构域(α1,3 GTcd;catalytic do-main of α1,3GT),利用其在人消化道肿瘤细胞表面构建α-gal表位(Galαl-3Gal-β1-4GlcNAc-R),拟用来制备一种新的自体肿瘤疫苗.方法 利用pET-15 b载体以可溶性形式表达鼠源性α1,3 GTcd,利用高效液相色谱阴离子交换柱检测酶的活性.通过其在人不同消化道肿瘤细胞表面构建α-gal表位,先与人血清孵育,FITC标记的羊抗人的IgG为第二抗体,用流式细胞仪检测荧光强度,以分析α-gal表位的表达结果.结果 可溶性高效表达与纯化了带有His-tag的α1,3GTcd并利用HPLC阴离子交换柱检测α1,3 GTcd的活性.流式细胞仪检测结果证明了在人消化道肿瘤细胞表面成功构建了α-gal表位.结论 本研究可溶性的表达了α1,3 GTcd,并利用其在人消化道肿瘤细胞表面成功地构建了α-gal表位.为该方法的临床治疗的应用打下坚实的基础.
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敲除α-1,3-半乳糖基转移酶基因五指山小型猪的繁育和鉴定
目的 总结 α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除(GTKO)五指山小型猪的繁育和鉴定.方法 统计GTKO五指山小型猪的繁育结果及窝产仔数;采用聚合酶链反应(PCR)技术对GTKO五指山小型猪GG TA1基因敲除类型进行鉴定;采用荧光显微镜和流式细胞术对人、野生型五指山小型猪、GTKO五指山小型猪外周血单核细胞(PBMC)的α-1,3-半乳糖(αGal)表型进行检测;比较GTKO五指山小型猪与野生型五指山小型猪血常规指标的差异.结果 GGTA 1基因型的遗传符合孟德尔定律;GGTA1-/-猪的PBMC流式检测无荧光表达,与基因型鉴定结果一致;GTKO五指山小型猪雌性猪初产窝产仔数为(6.8±1.8)只,经产窝产仔数为(8.3±2.2)只;血常规检测的各项指标与野生型五指山小型猪差异均无统计学意义(均为P＞ 0.05).结论 连续2代GTKO五指山小型猪遗传稳定,繁殖力正常.GTKO五指山小型猪可作为异种器官移植研究的可靠供体.
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人血清中非Gal异种抗体检测方法的探讨
目的 探讨人血清中抗非半乳糖(Gal)异种抗原抗体的佳检测条件.方法 选用α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)五指山小型猪的外周血单核细胞(PBMC)作为靶细胞,与健康人血清混合,在不同血清浓度(4.8％、16.7％、100％)和孵育时间(0.5、1.0、2.0、3.0、6.0h)条件下,利用流式细胞仪检测GTKO猪的PBMC上结合IgM和IgG的水平.结果 在16.7％血清浓度下,孵育时间从0.5 h延长至3.0 h,能显著提高非Gal IgM结合PBMC的水平(P＜0.01),而IgG水平的提高则差异无统计学意义(P＞0.05).提高血清浓度也可提高非Gal IgM的结合水平,采用100％的血清浓度孵育3h,IgM结合PBMC水平高且有统计学意义(P＜0.01).采用100％的血清孵育6h,IgG结合水平升高有统计学意义(P＜0.05).延长孵育时间和提高血清浓度不会影响PBMC的活力.结论 检测人血清中抗非Gal异种抗原抗体的佳条件为每1×105个猪PBMC,采用100％人血清浓度孵育3h检测IgM水平,或加100％人血清浓度孵育6h检测IgG水平.这一条件的优化有助于筛选非Gal表达抗原低表达的供体猪.
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异种肝移植的历史与发展
异种移植是解决同种供体器官短缺的重要途径.以α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除(GTKO)小型猪为供体、非人灵长类动物为受体的心脏和肾移植,长存活达945 d和136d,但肝移植尚无长期存活报道.国内外研究表明,免疫排斥和凝血调节障碍仍是阻碍移植肝和受体长期存活的主要原因.本文总结异种肝移植的发展历程,分析目前存在的问题,为未来的临床异种移植研究提供参考.
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中国近交系版纳微型猪α1,3-半乳糖基转移酶基因的克隆及其真核表达载体的构建
克隆中国近交系版纳微型猪(Banna minipig inbred-line, BMI)α1,3-半乳糖基转移酶基因(α1,3-galactosyltransferase α1,3-GT)并构建其真核表达载体.从版纳微型猪肝脏中提取总RNA,RT-PCR扩增出α1,3-GT cDNA全长序列,克隆到pMD18-T载体,测序后再克隆到质粒pEGFP-N1中,构建α1,3-GT真核表达载体pEGFP-N1-GT.用脂质体法瞬时转染人肺腺癌细胞A549,RT-PCR检测转染细胞中α1,3-GT mRNA的表达;利用荧光素标记的植物凝集素(FITC-BS-IB4 lectin),直接免疫荧光法检测转染细胞中α1,3-GT合成α-Gal表位的能力.结果显示版纳微型猪α1,3-GT cDNA全长1 116 bp,其序列与GenBank中小鼠和牛α1,3-GT cDNA具有高度同源性,与猪α1,3-GTcDNA全长序列完全一致.酶切和PCR证实重组真核表达载体pEGFP-N1-GT构建成功.转染pEGFP-N1-GT的A549细胞有α1,3-GTmRNA表达,在其细胞膜检测到α-Gal表位的表达.中国近交系版纳微型猪α1,3-GT cDNA的克隆及其真核表达载体的构建为该基因在异种器官移植和肿瘤免疫治疗中的进一步研究和应用奠定了基础.
关键词： 中国近交系版纳微型猪 α1 3-半乳糖基转移酶 异种移植 -
小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的克隆及测序
目的克隆α1,3-半乳糖基转移酶的序列,为进一步利用其构建真核表达载体,对肿瘤进行基因治疗奠定基础.方法从BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞中提取总RNA,行RT-PCR扩增出编码α1,3-半乳糖基转移酶的全长cDNA,并克隆入pUCm-T测序载体.经DNA测序证实序列.结果经RT-PCR扩增出大小约为1.2kb的基因片段,成功克隆入pUCm-T载体.结论成功地克隆α 1,3-半乳糖基转移酶基因序列,为进一步肿瘤基因治疗奠定了基础.
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小鼠α1,3-半乳糖糖基化修饰对人肝癌HuH7细胞生物学特性的影响
目的:探讨利用小鼠α1,3半乳糖基转移酶基因进行肝癌基因治疗的可行性.方法:将pcDNA3.1-α1,3GT真核表达载体以脂质体介导法转染人肝癌细胞HuH7,经G418压力筛选出稳定表达的阳性克隆,经生长曲线法,平板克隆形成试验,流式细胞仪等试验分析稳定表达株相关生物学特性变化.结果:转染有α1,3GT的HuH7经RT-PCR法检测到有α1,3GT的表达,免疫荧光镜检测其细胞表面有明显的Galα(1,3)Gal糖表位表达,转染细胞的增殖能力明显降低,同时促进细胞凋亡.结论:转染α1,3-半乳糖基转移酶基因可明显抑制人肝癌细胞HuH7的恶性生物学行为,具有潜在的临床应用价值.
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小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的克隆及其重组真核表达载体的构建
目的: 构建α1,3-半乳糖基转移酶的重组真核表达质粒pcDNA3.1/V5-HisAα1,3GT,为进一步利用其进行胃癌的基因治疗奠定基础. 方法: 从BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞中提取总RNA,行RT-PCR扩增出编码α1,3-半乳糖基转移酶的全长cDNA,并克隆入pUCm-T测序载体. 经DNA测序证实序列无误后,将α1,3-半乳糖基转移酶基因片段亚克隆入pcDNA3.1/V5-HisA真核表达载体. 结果: 经RT-PCR扩增出大小约为1.2 kb的基因片段,成功克隆入pUCm-T载体. 经DNA测序证实为α1,3-半乳糖基转移酶(α1, 3-galactosyltransferase, 3GT),大小为1221 bp,编码序列及读框均正确. 经亚克隆酶切鉴定,获得携有α1,3GT基因的重组质粒pcDNA3.1/V5-HisAα1,3GT. 结论: 成功地构建α1,3GT真核表达载体,为进行肿瘤基因治疗奠定了基础.
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流式细胞术检测供体猪α-1,3-Gal和人源CD46的表达
目的 检测基因修饰猪细胞表面α-1,3-半乳糖(α-Gal)抗原敲除情况和人源蛋白CD46 (hCD46)的表达情况,为异种器官移植提供可靠的供体.方法 采集500 μl野生型(wild type,WT)、α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除 (GTKO)、hCD46和GTKO/hCD46巴马小型猪血液,分离外周血单核细胞 (peripheral blood mononuclear cell,PBMC).异硫氰酸荧光素标记的植物凝集素(FITC-GSIB4)与PBMC共孵育后采用流式细胞术检测α-Gal抗原敲除情况,异硫氰酸荧光素标记的hCD46膜辅蛋白抗体(anti-CD46-FITC)与PBMC共孵育后采用流式细胞术检测hCD46蛋白表达情况.结果 GTKO和GTKO/hCD46巴马猪PBMC表面α-Gal检测呈阴性,WT和hCD46巴马猪检测呈阳性,与测序结果一致;hCD46和GTKO/hCD46巴马猪PBMC表面hCD46蛋白检测呈阳性,WT和GTKO巴马猪检测呈阴性,与PCR鉴定结果一致.结论 建立了微量血液流式细胞术直观检测供体猪α-Gal抗原和人源CD46蛋白表达的方法.
