首页 > 文献资料
-
软叶针葵花粉肌动蛋白抑制蛋白基因的克隆表达与纯化及免疫学鉴定
花粉是主要的吸人性过敏原之一.软叶针葵是一种热带、亚热带常见植物,在授粉季节所产花粉量较大,具很大的过敏潜能.但目前国内外尚鲜见软叶针葵花粉过敏原研究的报道.本研究用简并性引物从软叶针葵花粉中获得1个肌动蛋白抑制蛋白(profilin)基因,并在大肠杆菌中进行表达,获得有活性的重组profilin,同时研究其免疫学特性,并为软叶针葵花粉过敏诊断及免疫学治疗奠定基础.
-
乙型肝炎病毒多表位嵌合蛋白的表达、纯化和鉴定
目的:构建含乙肝病毒表面抗原前S1,S2(HBV preS1,preS2)优势B细胞表位与乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的嵌合蛋白,探索其作为兼具预防和治疗HBV感染作用的新型疫苗的可能性.方法: 利用分子克隆技术先后将HBV preS1(21～47AA.),preS2(133～145AA.) 表位基因插入HBcAg基因中,得到HBV C144,CS1,CS1S2融合基因,分别克隆到原核表达载体pQE-30中,在大肠杆菌(E.coli)M15中进行表达,用Ni2+固相化的螯合Sepharose Fast Flow亲和层析纯化重组蛋白,后进行抗原性的鉴定.结果:构建了HBV嵌合型颗粒蛋白表达载体,并在E.coli中高效表达出可溶性病毒样颗粒蛋白C144,CS1,CS1S2,经Ni-NTA亲和层析纯化后,蛋白纯度达80%,Western印迹及ELISA证明蛋白各表位都具有抗原性.结论:本研究为进一步深入研究新型HBV治疗性疫苗的功能和应用奠定了基础.
-
人心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)在大肠杆菌中的表达和纯化
目的获得重组人心肌型脂肪酸结合蛋白,为进一步开发应用奠定基础.方法根据已报道的心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因序列,采用RT-PCR的方法获得心肌型脂肪酸结合蛋白基因.将所得的PCR产物插入原核表达载体pQE30中,得重组质粒(pQE-H-FABP)并转化大肠杆菌(E.coli)M15,通过IPTG诱导表达出带有六个组氨酸的融合蛋白.经镍固定金属亲和层析纯化.结果序列分析表明:H-FABP基因成熟肽编码区含有396bp,编码132个氨基酸;与GenBank(NM004012)中已报道的H-FABP分离物的核苷酸序列有99.9%同源性.经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的27%,分子质量约为15kDa并与商品化的H-FABP单抗(Clone 6B6)呈特异性反应.经Ni+2-NTA agarose纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带.结论在大肠杆菌中获得了人心肌型脂肪酸结合蛋白的高效表达,为研究其生物学功能和制备单克隆抗体奠定了基础.
关键词： 心肌型脂肪酸结合蛋白 表达与纯化 大肠杆菌 -
人睫状神经营养因子基因的克隆、表达、纯化和生物活性鉴定
目的表达和纯化人睫状神经营养因子(CNTF)并观察其生物学活性.方法用PCR方法构建人CNTF的结构基因,并克隆于pLy4原核表达载体中.将重组表达质粒pLy4-CNTF转化大肠埃希菌JF1125,30℃培养至A600(nm)达到0.6时,迅速升温至42℃诱导目的蛋白的表达.细菌经超声破胞,包涵体经变性、复性、透析和阴离子交换层析,获得纯化的CNTE重组蛋白.然后,用鸡胚背根神经节神经元细胞存活实验观察其生物活性.结果42℃诱导后可以获得Mr≈22.9×103的目的蛋白,Westem印迹结果进一步表明,其具有人CNTF的抗原性.表达蛋白主要以不溶形式存在,占菌体蛋白的35%以上,表达产物经变性、复性,纯化后可获得纯度90%以上的目的蛋白.该重组蛋白能够促进鸡胚背根神经节神经元细胞的存活.结论在大肠埃希菌JF1125中成功表达了人CNTF分子,经变性、复性,纯化后得到具有生物活性的蛋白.
-
HA20-lys10在大肠埃希菌中的融合表达纯化和凝胶阻滞试验
目的表达和纯化流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合蛋白HA20-lys10,并观察其与质粒结合的能力.方法用PCR方法构建流感病毒血凝素HA2氨基末端20个氨基酸与10个赖氨酸的融合基因HA20-lys10,并克隆于pET32a(+)原核表达载体.将重组表达质粒pET-HA-K转化大肠埃希菌BL21(DE3),当A(Abs)600nm达到0.6时,加入终浓度为1 mmol/L IPIG诱导目的蛋白的表达.表达产物用亲和层析一步法进行纯化,然后用凝胶阻滞试验观察重组蛋白结合质粒的能力.结果IPTG诱导后可获得相对分子质量约为27 000的目的蛋白,表达蛋白以可溶形式存在,占菌体蛋白20%以上.表达菌超声后,表达产物经亲和层析一步纯化后可获得纯度达85%以上目的蛋白.凝胶阻滞试验发现,纯化的重组蛋白在一定条件下可以与质粒结合,使质粒的迁移率明显改变.结论融合蛋白HA20-lys10有望用于受体介导基因转移,以提高基因转移的效率.
-
人脂联素球状结构域的表达、纯化和功能鉴定
目的表达和纯化人脂联素(adiponectin,APN)球状结构域并观察其生物学活性.方法用PCR方法复制人脂联素球状结构域(globular domain of adiponectin,gAPN)的cDNA,并克隆于pET28a(+)原核表达载体中.将重组表达质粒pET28a(+)-gAPN转化大肠埃希菌BL21(DE3),37℃培养至A600达到0.6时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白的表达.细菌经超声破菌,得到粗提的包涵体洗涤变性后经镍柱亲和层析柱一步纯化,获得纯化的gAPN重组蛋白,复性后冻干保存.然后,用链佐星(streptozocin,STZ)诱导的小鼠高血糖模型检测其生物活性.结果IPTG诱导后有Mr约为17 000大小的目的蛋白表达,免疫印迹结果进一步表明,其具有人gAPN的抗原性.表达蛋白主要以包涵体形式存在,占菌体蛋白的30%以上,表达产物经变性、纯化、复性,可获得纯度90%以上的目的蛋白.该重组蛋白能够降低STZ诱导的小鼠高血糖模型的血糖水平.结论在大肠埃希菌BL21(DE3)中成功表达了人gAPN蛋白,经变性、纯化、复性后得到具有生物学活性的蛋白.
-
重组人源胰岛素原C肽在大肠杆菌中的克隆、表达与纯化
目的:构建一种新型表达载体(pEDCC),表达并纯化得到人源胰岛素原C肽.方法:将编码截短的门冬酰胺酶突变体(ansB-C),天然C肽,人IgG1铰链区(hinge),额外的酸敏感二肽(DP)以及富含碱性氨基酸的8肽(KRKRKKSR)的核苷酸序列依次分别插入pET28a载体中,构建表达载体pEDCC.在乳糖的诱导下,融合蛋白ansB-C-hinge-DPKRKRKKSRNGSGR-C-peptide以包涵体形式高效表达.融合蛋白经洗涤和乙醇分级沉淀纯化后,通过酸水解将PKRKRKKSRNGSGR-C-peptide释放出来.C肽N端14肽用胰蛋白酶切割,通过DE52柱与C-peptide分离.结果:构建的表达载体pEDCC序列正确,融合蛋白经分离纯化得到了高纯度的重组人源胰岛素原C肽.结论:以截短的门冬酰胺酶作为融合伙伴,并以富含碱性氨基酸的8肽调节等电点是一种生产重组人源胰岛素原C肽的有效方法.
关键词： 重组人源胰岛素原C肽 基因融合 表达与纯化 门冬酰胺酶 胰蛋白酶 -
新的锌指蛋白Mip1的DNA结合序列的筛选
目的 筛选一个新的锌指蛋白Mip1的DNA结合位点.方法 将Mip1 cDNA全长克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1构建了Mip1的原核表达质粒pGEX-Mip1.用谷胱甘肽亲和层析纯化GST-Mip1融合蛋白.通过固定化的GST-Mip1,从寡核苷酸文库中俘获Mip1的结合的寡核苷酸片段;将所得寡核苷酸片段插入T-载体,通过测序、序列比对得到DNA结合位点.结果 锌指蛋白Mip1的融合蛋白能在大肠杆菌中高效表达,能与固定化还原性谷胱甘肽很好地亲和而得到纯化;用固定化的Mip1融合蛋白俘获到了其结合的寡核苷酸序列,通过测序、序列比对,得到了Mip1的DNA结合位点.结论 Mip1的DNA结合位点的核心序列为G/TCCTA,Mip1的DNA结合位点的成功确定为Mip1功能的深入研究打下了基础.
-
人MMP-11原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11的构建及其融合蛋白的表达和纯化
目的构建表达人基质金属蛋白酶-11(MMP-11)N-端肽段的重组原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11,获得人源性MMP-11融合蛋白.方法应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从正常人子宫内膜组织扩增目的基因片段,利用体外基因重组技术将目的基因片段连接到原核表达载体pGEX-5X-3上构成重组的原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11,并通过酶切和测序进行鉴定.将重组质粒转化人大肠杆菌DH5a后挑选阳性克隆,用异丙基硫代半乳糖苷诱导其融合蛋白的表达并进行纯化.结果RT-PCR获得预期大小的特异性DNA片段,经双酶切鉴定及测序证实已将人基质金属蛋白酶-11N-端肽段的cDNA片段正确插入原核表达载体中.融合表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,证实相对分子量大小为4 550.结论成功构建了表达人MMP-11N-端肽段的重组原核表达载体pGEX-5X-3/MMP-11,获得相对分子量为4 550的GST-MMP-11融合蛋白,为进一步制备抗人MMP-11抗体及其在临床中进一步推广应用于恶性肿瘤的快速诊断及临床疗效的评价奠定了基础.
关键词： 基因重组 基质金属蛋白酶-11 表达与纯化 原核表达载体 -
兔PKCε催化功能域在大肠杆菌中表达与部分纯化
目的通过构建蛋白激酶 Cε原核表达载体以获得纯化的 PKCε蛋白. 方法将 PKCε催化功能域(野生型和突变型)构建至原核表达载体 pUC18上形成重组质粒 pUC-CK和 pUC-CR, 将其转化至大肠杆菌 DH5α细胞中诱导其高效表达. 结果表达产物的 SDS-PAGE电泳及 Western blot检测表明,催化功能域在大肠杆菌中成功表达,并对其进行了部分纯化.结论获得纯化的 PKCε蛋白,为今后大量表达、纯化该酶蛋白作了前期铺垫.
-
His-细胞外调节蛋白激酶8融合蛋白的表达与纯化
目的:对细胞外调节蛋白激酶(ERK)8进行表达、纯化及活性鉴定.方法:PCR扩增目的基因ERK8,进行BamH Ⅰ和HinⅢ双酶切,与经BamH Ⅰ和HindⅢ表达载体pET-28a进行连接,转化大肠杆菌BL21,以不同浓度(0.2、0.4、0.8、1.0mmol/L)异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和不同温度(15、20、25、37℃)对重组质粒进行诱导表达,并用Westemblot技术鉴定表达的融合蛋白;用Nf+金属螯合亲和层析柱法对融合蛋白进行纯化.结果:成功构建pET-28a-ERK8重组质粒,并获得纯化的有活性的His-ERK8融合蛋白,且IPTG终浓度为0.2 mmol/L,温度37℃,时间5h下,该融合蛋白的表达量大.结论:通过对pET-28a-ERK8的构建和ERK8蛋白表达与纯化,为进一步研究ERK8蛋白的结构和功能奠定实验基础.
关键词： 细胞外调节蛋白激酶8 构建 表达与纯化 -
应用SoftLinkTM Soft Release Avidin树脂亲和层析纯化融合IL-16蛋白
目的分离、纯化大肠杆菌中表达的融合IL-16蛋白.方法采用SoftLinkTM Soft Release Avidin Resin亲合树酯分离、纯化由大肠杆菌产生的生物素化融合IL-16蛋白.结果融合IL-16蛋白成功地在该系统中被分离、纯化,每升细菌培养物可获得1.4 mg重组融合蛋白.纯化蛋白经SDS-PAGE和毛细管电泳检测均为1条蛋白质带.结论此系统纯化IL-16融合蛋白操作方便、快捷,所得蛋白纯度和产率高.
-
解脲支原体血清3型MB抗原N端的表达纯化及免疫学检测
目的对解脲支原体(UU)血清3型MB抗原N端作蛋白的表达、纯化.方法采用pGEX2T载体构建的重组质粒,用化学诱导剂IPTG诱导表达,应用Westem斑点印迹法检测纯化融合蛋白的免疫学活性.结果得到的UU3型MB抗原基因5＇端重组克隆菌株,成功地诱导表达并纯化了N端43KD的融合蛋白,通过斑点印迹法证实该蛋白具有很好的免疫活性.结论本实验成功地对解脲支原体血清3型MB抗原N端作了蛋白的表达与纯化,并证明具有很好的免疫活性.
-
细菌鞭毛蛋白质fliH的表达及热稳定性分析
目的:通过对鞭毛蛋白质fliH的克隆表达及热稳定性分析,为深入分析细菌感染的分子机制以及新的特异性抗菌药物和快速诊断方法的研发提供基础.方法:利用PCR技术扩增fliH基因,构建重组质粒pET-28a-fliH-His6,并在大肠杆菌(Escherichia coli,Ecoli)B834中表达.运用亲和层析柱纯化fliH蛋白质,再用凝胶层析柱分析其在溶液中的聚集状态,TSA法分析其热稳定性.结果:(1)重组质粒pET-28a-fliH-His在E.coliB834中可溶性表达.(2)获得高纯度的fliH蛋白质(85％),以二聚体形式存在于溶液中.(3) fliH蛋白质在溶液中稳定存在的适条件为pH6.0和NaC1200mM.结论:fliH蛋白质能够在溶液中以二聚体形式稳定存在,为深入认识鞭毛蛋白质在细菌致病过程中的相关分子机制及确切的生化功能奠定基础,从而为新的特异性抗菌药物及快速诊断方法的研发提供理论支撑.
