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MTT法检测卵蛋白刺激哮喘小鼠脾淋巴细胞增殖佳实验条件的研究
目的 探讨MTT法检测卵蛋白(OVA)刺激哮喘小鼠脾淋巴细胞增殖的佳实验条件.方法 制备OVA诱导哮喘小鼠模型,分离脾淋巴细胞.接种不同浓度的脾淋巴细胞,在不同培养时间点测定吸光度(A)值,确定佳细胞浓度和检测时间.观察不同浓度OVA对脾淋巴细胞增殖的影响.结果 佳脾淋巴细胞接种浓度为2×106 ～4×106 cells/ml,佳检测时间为48 h.培养24和48 h时,细胞浓度为1×106 ～4×106 cells/ml,A值与细胞浓度呈线性关系(r＞0.99).10μg/ml OVA可诱导脾淋巴细胞显著增殖,100μg/ml OVA反而抑制脾淋巴细胞增殖.结论 MTT法可用于检测哮喘小鼠的脾淋巴细胞增殖,细胞浓度与A值呈线性关系.OVA浓度是影响脾淋巴细胞增殖的重要因素.
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不同剂量卵蛋白诱发幼年大鼠支气管哮喘模型的比较
目的:利用不同剂量的卵清蛋白(OVA)诱导大鼠,探索建立一个稳定、理想的大鼠支气管哮喘模型.方法:用低、中、高剂量卵清蛋白致敏大鼠后再雾化吸入同一致敏原从而诱发大鼠哮喘发作,分别观察各组大鼠肺组织病理切片、支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞计数和分类以及双抗体夹心酶联免疫吸附试验法检测BALF中OVA特异性IgE(OVA-IgE)以及外周血和BALF白细胞介素(IL-4)和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)水平.结果:3个模型组大鼠较正常对照组均出现哮喘异常症状,但高剂量组有明显的腹式呼吸和呼吸短促,且高剂量组肺组织病理显示气道炎症较低、中剂量组明显严重,3个模型组的BALF中细胞总数较对照组均有不同程度增高,且高剂量组增高有显著性(P＜0.05)；中、高剂量组的嗜酸粒细胞较对照组增高,且3个剂量组之间差异均有显著性(分别为P＜0.05和P＜0.01).中、高剂量组的淋巴细胞较对照组增高均有显著性(分别为P＜0.05和P＜0.01).中、高剂量组较低剂量组显著升高(P均＜0.05).高剂量组大鼠血清中IL-4和BALF中OVA-IgE较对照组和低、中剂量组增高有显著性(P＜0.05),中剂量组BALF中OVA IgE较对照组增高有显著性(P＜0.05).高、中剂量组较低剂量组和对照组IFN-γ下降,差异均有显著性(P分别＜0.01和＜0.05).结论:幼年大鼠哮喘模型中的致敏原剂量的大小与哮喘气道变应性炎症的程度有关,大剂量腹腔注射OVA是一种操作简便的诱发大鼠哮喘模型的方法,成功率高,重复性好,值得动物实验推广使用.
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不同剂量卵蛋白对豚鼠血清中IgE的影响
目的:用豚鼠全身过敏性试验模型探讨不同剂量卵蛋白(OVA)的过敏性.方法:用不同剂量的卵蛋白致敏激发豚鼠,复制全身过敏性试验模型,观察过敏反应症状,ELISA检测不同剂量OVA组和空白对照组的豚鼠血清中OVA特异性抗体IgE的含量变化.结果:全身过敏实验阳性对照组(OVA)致敏率为100%,大部分过敏反应级别较高;阴性对照组的致敏率为0%;14 d时过敏反应无明显差异,21 d时过敏反应有统计学意义(P＜0.05);14 d时OVA组与对照组比,血清IgE值水平无明显差异,21 d OVA组与对照组比,血清IgE值水平显著差异(P＜0.05).结论:OVA致敏原的剂量在一定浓度范围内与过敏反应指标IgE值呈现相关性.
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负载卵蛋白壳聚糖纳米粒的研究:影响包封率的因素及其缓释效果
目的 探讨影响壳聚糖(CS)纳米粒包封卵蛋白(OVA)的因素以优化包封条件,初步研究OVA体外释放规律,观察CS缓释OVA的作用.方法 采用离子凝胶法,以三聚磷酸钠(TPP)为交联剂,制备CS纳米粒并包封OVA,检测其表征参数.观察CS浓度、CS/OVA质量比、CS/TPP质量比和CS溶液pH值对CS纳米粒包封OVA的影响,以及载OVA的CS纳米粒的OVA体外释放.结果 载OVA的CS纳米粒平均粒径为496.7nm,Zeta电位为+29.41mV.增加CS浓度、CS溶液pH值和CS/OVA质量比,降低CS/TPP质量比可以增加CS对OVA的包封率.载OVA的CS纳米粒呈缓释模式,体外释放可持续6天以上.结论 CS浓度、CS溶液pH值、CS/OVA质量比和CS/TPP质量比是影响CS纳米粒对OVA的包封率的重要因素.CS纳米粒具有缓释OVA作用.
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BCG-PSN通过抑制哮喘小鼠NF-κB影响BALF中细胞因子的水平
核因子NF-κB (Nuclear factor kappa B)是一个具有广泛生物学活性的核转录因子,可参与许多炎症的表达调控,是与支气管哮喘及气道炎症密切相关的因子之一.将28只6周龄BALB/c小鼠(山东大学医学院实验动物室)随机分为4组,每组7只.对照组:隔日腹腔内注射生理盐水(NS)0.03 ml, 第14天、28天、35天腹腔内注射1.5 mg Al(OH)3;BCG-PSN (卡介苗多糖核酸注射液,BCG-Polysaccharide nucleic acid)6周龄组:隔日腹部皮下注射BCG-PSN(商品名斯奇康1 ml/安瓿,长沙九芝堂公司产品)0.03 ml,在第14、28和35天腹腔内注射1.5 mg Al(OH)3;OVA(卵蛋白,aerosolization)组:隔日腹腔内注射NS 0.03 ml,建立哮喘模型;BCG-PSN 6周龄+OVA组:6周龄鼠,隔日腹部皮下注射BCG-PSN 0.03 ml,建立哮喘模型.
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致敏大鼠肺内细胞增殖与凋亡的研究
为探讨支气管哮喘时气道重塑的特点及细胞增殖与凋亡机制对气道重塑的调节，我们检测了卵蛋白(OVA)致敏不同时间大鼠气道粘膜下细胞增殖及凋亡指数的变化、增殖细胞核抗原（PCNA）表达的变化以及气道基底膜Ⅲ型胶原表达的变化，并对与细胞增殖、凋亡密切相关的Fas/Fas L抗原表达进行研究。 材料与方法雄性SD大鼠24只，随机分为4组，每组各6只。对照1周组和对照3周组：以生理盐水代替抗原进行注射和雾化吸入；致敏1周组和致敏3周组：参照文献［1］方法给予OVA致敏和激发。雾化后分别于第7、21d经0.3%戊巴比妥钠麻醉，取肺组织。
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地塞米松对哮喘豚鼠肺组织G蛋白α亚族的调控研究
抗哮喘药物种类繁多并不断增加,但糖皮质激素(GC)作为临床一线用药其地位至今无法替代.GC的抗哮喘机制是复杂的,要想准确解释其平喘机制仍待时日.近来发现,许多药物通过与G蛋白藕联的受体相互作用发挥药效,我们发现哮喘豚鼠肺组织Gα亚族表达增高与其发病有关[1],GC的抗哮喘作用是否与调控G蛋白的表达有关尚少见报道.我们的实验用卵蛋白致敏复制豚鼠哮喘模型,用地塞米松(DEX)进行干预,通过测定G蛋白α亚族的表达变化,以期从信号转导的角度阐述GC的抗哮喘机制.
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卵蛋白致敏激发豚鼠肺组织基质金属蛋白酶9的表达
基质金属蛋白酶(MMPs)是一类结构高度同源的内肽酶的总称,它因含有金属离子(锌离子、钙离子)而得名.MMPs通过分解细胞外基质(包括胶原纤维、弹力纤维、各种糖蛋白及蛋白多糖),在组织重塑、细胞迁移、血管生成、伤口愈合、炎症等各种生理病理过程中发挥关键作用.近年来研究表明,MMPs在支气管哮喘患者气道炎症及组织重塑中发挥重要作用.许多研究者对支气管哮喘患者的诱导痰液、支气管肺泡灌洗液(BALF)、肺活检标本以及体外培养的巨噬细胞进行了MMPs检测分析,其MMP-9产生明显增高(MMP-9主要来源于嗜酸细胞、巨噬细胞和中性粒细胞),同时金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-1亦明显增高;且MMP-9/TIMP-1比例出现失衡.在哮喘患者中MMP-9的过量表达与Ⅲ、V型胶原以及tenascin在基底膜的沉积显著相关,并与气流受限的程度、气道高反应性相关[1].我们的实验试图通过支气管哮喘豚鼠模型的建立,研究其肺组织MMP-9的表达及其动态变化,探讨其特异抑制剂对支气管哮喘的治疗价值.
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吸入布地奈德气雾剂对致敏大鼠气道细胞增殖影响的研究
支气管哮喘是一种气道慢性炎症,在炎症发病过程中修复与重塑的调控机制已被引起高度重视.我们采用免疫组化ABC法,检测卵蛋白致敏不同时间(1、3周)大鼠气道粘膜下细胞增殖指数的变化及气道基底膜Ⅲ型、Ⅴ型胶原表达的变化,同时观察分别吸入布地奈德(商品名:普米克)1、3周的影响,以阐明吸入糖皮质激素对肺内气道重塑的影响.
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Arkadia上调转化生长因子-B信号促进卵蛋白致敏大鼠气道重塑形成
支气管哮喘(简称哮喘)所致气道重塑的发生与转化生长因子(TGF)-β信号通路的活化密切关联.TGF-β生物学效应的发挥在很大程度上依赖于泛素蛋白酶体通路对TGF -β/Smad通路中基本信号分子的降解而得以实现.在上述过程中,E3泛素连接酶Arkadia和Smurf2能够诱导Smad7、SnoN和Ski的泛素化降解.本研究为明确卵蛋白致敏大鼠气道重塑发生过程中Arkadia和Smurf2对TGF-β信号通路的调控作用,采用卵蛋白致敏、激发方法建立慢性气道重塑大鼠模型;体外培养正常人支气管上皮细胞( NHBEC),用TGF-β1对NHBEC进行刺激,在此过程中分别用Arkadia-siRNA、Smurf2 -siRNA及蛋白酶抑制剂(lactacystin)对NHBEC进行预处理.
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雷公藤抑制致敏小鼠T淋巴细胞活化及其白细胞介素-5mRNA表达
通过对致敏小鼠活化T淋巴细胞（CD25）与白细胞介素(IL)-5mRNA表达相关性的观察，探讨雷公藤内酯醇对T淋巴细胞活化和IL-5mRNA表达的影响，同时就雷公藤内酯醇的作用机制与氟美松进行比较。 一、材料与方法 1．动物模型建立及分组：4～6周健康BALB/c小鼠（第三军医大学动物所提供）24只，雌雄不限，体重16～20 g。随机分为4组，每组6只。（1）A组：致敏组，以卵蛋白（OVA）致敏和激发［1］建立致敏模型；（2）B组：雷公藤内酯醇组，每次激发前1 h腹腔注射雷公藤内酯醇 40 μg/kg体重；（3）C组：氟美松组，每次激发前1 h腹腔注射氟美松 10 mg/kg体重。B组与C组在后一次激发后24 h再给药一次。（4）D组：正常对照组，以生理盐水代替OVA致敏和激发。
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不同激发方式对小鼠过敏性支气管哮喘模型的影响
目的 探讨不同激发方式对小鼠过敏性支气管哮喘(简称哮喘)模型的影响.方法 模型组用卵清蛋白致敏和激发BalB/c小鼠,第0天、第7天、第14天腹腔注射致敏,从第28天开始分别给予不同次数和方式的激发.根据激发方式的不同,随机分为5组,包括三次滴鼻激发组、二次雾化20 min激发组、三次雾化20 min激发组、三次雾化30 min激发组、四次雾化20 min激发组,每组12只.激发后48 h采用整体体积描记法检测小鼠气道反应性,结果以增强的呼气间歇(enhanced pause,Penh)表示,测定肺功能后再用磷酸盐缓冲液对全肺进行支气管肺泡灌洗,支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞学分析.结果 哮喘组气道反应性(Penh%)和BALF中嗜酸粒细胞比例(EOS%)与正常组相比差异均有统计学意义(P<0.05).三次滴鼻激发组EOS%和Penh%显著高于其他雾化激发组(P<0.05),其中BALF中EOS%三次滴鼻激发组(46.30±4.55)%,与二次雾化20 min激发组(31.19±12.84)%、三次雾化20 min激发组(29.00±12.33)%、四次雾化20 min激发组(37.08±8.44)%相比有显著差异,与三次雾化30 min激发组(41.17±8.78)%无显著差异.三次滴鼻激发组PC100[(3.75±1.79) g/L]和三次雾化30 min激发组[(5.94±3.27) g/L]、四次雾化20 min激发组[(5.19±1.88) g/L]有显著差异(P<0.05).三次滴鼻激发组激发过程中动物死亡2只,其余各组均无死亡.结论 滴鼻和雾化激发均能成功建立哮喘模型,其中滴鼻激发建立的哮喘模型气道炎症及气道反应性升高更为显著.
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早期接触过敏原对大鼠哮喘模型的影响
目的:了解早期接触卵蛋白(ovalbumin,OVA)对大鼠哮喘模型的影响.方法:将新生SD大鼠随机分为阴性对照组、哮喘模型组、小剂量组和大剂量组,每组8只,其中小剂量组和大剂量组大鼠于生后当天分别一次性注射2g/L OVA 0.1 mL和10g/L OVA 0.1 mL.6周后,哮喘模型组、小剂量组和大剂量组经OVA致敏并制作哮喘模型.分别观察各组大鼠肺组织病理、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中细胞计数和分类、外周血白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、OVA-IgE和OVA-IgG水平.结果:小剂量组和大剂量组肺组织病理显示气道炎症较哮喘组明显减轻,BALF中细胞总数、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞比例较哮喘组显著下降,两组大鼠血IL-4和OVA-IgE较哮喘模型组显著下降,IFN-γ水平则较哮喘模型组显著增加.大剂量组与对照组比较,IL-4和IFN-γ及OVA-IgE差异无统计学意义.哮喘模型组、小剂量组和大剂量组大鼠血OVA-IgG较对照组显著增加,且大剂量组较哮喘组显著增加.结论:出生后早期接触OVA可抑制大鼠成年后OVA所诱发的气道炎症改变和特异性IgE增加,其机制可能与诱导免疫耐受形成有关.
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芩夏止哮颗粒对豚鼠支气管平滑肌的影响及平喘作用
通过离体和整体实验,观察芩夏止哮颗粒对以组胺和乙酰胆碱引起正常豚鼠支气管收缩和以卵蛋白诱发的致敏豚鼠支气管收缩的影响.离体实验,芩夏止哮颗粒2～8 g/L对组胺致正常豚鼠气管条收缩有明显解痉作用,并具明显的量效关系.芩夏止哮颗粒对正常豚鼠气管条则也有松弛作用.离体实验结果还表明芩夏止哮颗粒能松弛致敏豚鼠回肠平滑肌.整体实验,芩夏止哮颗粒,可显著延长药物引喘和卵蛋白气雾吸入引喘所致豚鼠抽搐的潜伏期.芩夏止哮颗粒能拮抗组胺刺激引起的正常豚鼠和卵蛋白引起的致敏豚鼠离体气管片的收缩,抑制致敏豚鼠哮喘的发生.
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白果注射液注射足三里对卵蛋白(OVA)诱导哮喘小鼠的作用
[目的]检验白果注射液注射足三里对哮喘的治疗作用.[方法]用白果注射液对哮喘小鼠模型在足三里注射,检测肺质量白细胞.嗜红细胞以及IgE、白细胞介素(IL-4、IL-5、IL-13)等指标.[结果]白果注射液注射足三里显著降低哮喘小鼠模型肺质量,同时有效降低肺组织嗜红细胞和白细胞总数.降低血清BALF中IgE、IL-4、IL-5及IL-1 3的水平.[结论]实验结果提示白果注射液注射足三里时哮喘有治疗作用,可考虑临床应用.
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卵蛋白加氢氧化铝致敏建立哮喘大鼠模型研究
目的 探讨建立大鼠哮喘模型的高效方法.方法 将40只雌性SD大鼠随机均分为正常组和哮喘组,哮喘组每只腹腔注射1 mL卵蛋白与氢氧化铝生理盐水混合液(4%卵蛋白40 μg+10%氢氧化铝100 μg加1 mL双蒸水)致敏并以1%卵蛋白激发建立哮喘模型,正常组以等量生理盐水替代.后一次雾化激发24 h后,分别取2组大鼠血清检测嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)和白细胞介素-17(IL-17)水平,取支气管肺组织制作病理切片进行镜下观察.结果 哮喘组大鼠哮喘症状明显,气道病理改变明显,有大量的炎性细胞浸润,血清Eotaxin、IL-17水平均明显高于正常组(P均<0.05).结论 以4%卵蛋白40 μg+10%氢氧化铝100 μg能建立较为稳定的哮喘模型.
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早期气道接触细菌抗原对大鼠哮喘模型影响
目的 了解早期气道接触细菌抗原对辅助性T淋巴细胞1/2(Th1/Th2)平衡以及大鼠成年后哮喘气道炎症的影响,研究哮喘的发病机制.方法 将新生SD大鼠随机分为3个细菌抗原组、哮喘组及对照组,细菌抗原组大鼠分别于出生后第1、3、5、7 d鼻咽部给予107、106、105灭活肺炎链球菌10μL,哮喘组及对照组大鼠则给予磷酸盐缓冲液(PBS)10μL;大鼠饲养至成年后造模,观察各组大鼠肺组织病理、支气管肺泡灌洗液(BALF)白细胞分类、血清中白细胞介素-4(IL-4)、γ-干扰素(IFN-γ)、卵蛋白-IgE含量.结果 肺组织病理显示,早期接触灭活细菌的大鼠气道炎症较重;107、106抗原组大鼠BALF中淋巴细胞百分比为(32.94±13.62)%、(29.50±8.92)%,与哮喘组比较明显增多(P＜0.05);107抗原组大鼠血清中卵蛋白-IgE水平(0.33±0.07)较哮喘组明显升高(P＜0.01),IFN-γ水平为(11.93±2.74)pg/mL,较哮喘组明显下降(P＜0.05).结论 早期气道接触细菌抗原可加重Th1/Th2失衡以及大鼠成年后哮喘气道炎症.
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喘宁颗粒对哮喘大鼠肥大细胞以及ET-1含量的影响
[目的]研究喘宁颗粒对哮喘大鼠肥大细胞以及内皮素(ET-1)含量的影响.[方法]用放免法测定卵蛋白诱发的哮喘大鼠肺组织和血清中ET-1的含量;观察哮喘大鼠肺泡灌洗液中肥大细胞脱颗粒和凋亡细胞的变化.[结果]喘宁颗粒能降低哮喘大鼠肺组织和血清中ET-1的含量;减少肺泡灌洗液中肥大细胞脱颗粒和凋亡的数量.[结论]喘宁颗粒可能通过降低哮喘大鼠肺组织和血清中ET-1的含量;减少肺泡灌洗液中肥大细胞脱颗粒和凋亡的数量来发挥其平喘作用.
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氯胺酮预处理对卵蛋白激活的致敏大鼠肺泡巨噬细胞丙二醛及超氧化物歧化酶的影响
目的 研究不同剂量氯胺酮对卵蛋白(OVA)刺激致敏的大鼠肺泡巨噬细胞丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的影响.方法 致敏的大鼠肺泡巨噬细胞分离培养,氯胺酮(10、100、1 000 μmol/L)预处理后给予OVA刺激,培养72 h后检测细胞培养上清液中MDA及SOD水平.结果 与对照组比较,OVA组培养上清液中MDA水平明显增加,伴有SOD水平下降,而较高浓度氯胺酮预处理(100、1 000 μmol/L)后可起到一定的抑制作用.结论 氯胺酮预处理对OVA引起的肺泡巨噬细胞氧化应激损伤具有一定的保护作用.
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滨蒿内酯对哮喘豚鼠气管平滑肌的作用
目的:观察滨蒿内酯(scoparone, Sco)对哮喘豚鼠离体气管平滑肌(tracheal smooth muscle, TSM)张力的影响,以进一步探寻Sco对哮喘的治疗作用和机理.方法:采用卵蛋白引喘方法制备豚鼠哮喘模型.制备豚鼠离体气管环,测定用药后TSM张力的变化.结果:与其对正常豚鼠TSM的作用相比,Sco舒张哮喘豚鼠TSM的作用明显增强,PD2值分别为5.13±0.16,5.95±0.23(n=10, P<0.01),Sco拮抗组织胺(histamine,His)收缩哮喘豚鼠TSM的作用明显增强,PD2'值分别为4.27±0.33,5.07±0.31(n=5,P<0.01).结论:与其对正常豚鼠TSM的作用相比,Sco对哮喘豚鼠TSM的舒张作用明显增强,Sco剂量依赖性地抑制His收缩哮喘豚鼠TSM的作用明显增强,提示Sco对哮喘豚鼠TSM细胞H1受体的非竞争性抑制作用明显增强.
