日本脑炎病毒基因片段-GM-CSF双顺反子表达载体的构建

目的利用分子生物学技术,构建pCAG-JG双顺反子真核表达质粒,为研制新型的日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)核酸疫苗奠定基础.方法 RT-PCR扩增JEV的prM-E-NS1和小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor,GM-CSF)后,分别克隆人中间载体pIRES,经酶切获得prM-E-NS1-IRES-GM-CSF片段,并将其插入pCAGGSP7质粒,鉴定阳性重组子.结果成功的将prM-E-NS1-IRES-GM-CSF片段插入到pCAGGSP7质粒,测序鉴定结果正确,该质粒命名为pCAG-JG.结论成功的构建了pCAG-JG双顺反子真核表达质粒.

成年大鼠肌源性干细胞的培养和鉴定

目的探讨成年大鼠肌源性干细胞分离及纯化方法.方法采用消化法分离肌源性干细胞,然后用密度梯度离心法和差速贴壁法纯化干细胞;结蛋白(desmin)、CD34、CD45、Sca-1免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定.结果成功培养出高纯度的肌源性干细胞,免疫细胞化学染色结果为desmin(+),CD34(+),CD45(-),Sca-1(+).结论可通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞,为组织工程的临床应用提供种子细胞.

人源脂多糖结合蛋白单克隆抗体的筛选及初步鉴定

目的制备人源抗脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体,并对该抗体的效价进行初步鉴定.方法以人脂多糖结合蛋白(human lipopolysaccharide binding protein,hLBP)为抗原,以人源噬菌体抗体库进行筛选,经5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集反应后,筛选出3株抗人LBP阳性克隆株,抽提其质粒、切除geneⅢ、自身环化并电转入XL1-blue后,以IPTG诱导分泌表达可溶性抗体,通过ELISA法测定抗体效价.结果抗体库被浓缩8.16×104倍,获得3个与LBP结合能力较强的单克隆菌株,其中结合力强者产生抗体活性为106.结论成功获得针对人LBP的Fab抗体,经初步鉴定具有较高效价,为下一步研究该抗体功能奠定基础.

人卵巢癌微血管内皮细胞的分离培养与鉴定

目的建立稳定可靠的卵巢癌微血管内皮细胞分离培养方法.方法取上皮性卵巢癌组织,酶消化,经Percoll分离介质梯度离心得到单个核细胞进行培养,Ⅷ因子相关抗原免疫组化和透射电镜观察鉴定.结果接种后24 h,细胞开始贴壁,呈多边形或短梭形,8～10 d细胞融合成单层片状,呈现出"铺路石样"外观.Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色阳性,透射电镜下可见W-P小体.结论本研究方法能够获取体外培养的卵巢癌源性微血管内皮细胞.

糖尿病大鼠血浆和皮肤中P物质检测及意义

目的研究神经肽P物质(substance P,SP)在糖尿病大鼠动物模型血浆及皮肤组织中含量及意义.方法用放射免疫法分别检测糖尿病大鼠(20只)和正常大鼠(20只)血浆和皮肤组织中SP的含量,用免疫组化法观测动物模型建立后SP神经纤维数量变化.结果糖尿病大鼠血浆和皮肤组织中SP含量明显低于正常对照组(P<.01).结论皮肤组织中SP含量变化与糖尿病伤口难愈相关.

猪肝细胞在聚砜膜生物界面生长的初步研究

目的初步了解中国实验乳猪肝细胞在聚砜膜生物界面生长的情况,探索聚砜膜作为生物人工肝中空纤维反应器膜材料的可行性.方法将分离的新生实验小型猪肝细胞接种到聚砜膜和聚苯乙烯界面,进行形态学观察及生物学功能测定,观察培养猪肝细胞的酶漏出量.结果乳猪肝细胞在聚砜膜界面培养呈球型黏附、铺展,形成多细胞聚集体.与聚苯乙烯组相比较,聚砜膜组的尿素合成和蛋白分泌能力更强,氨转化率也明显提高,LDH和AST的漏出量无显著差异.结论聚砜膜是良好的乳猪肝细胞生长的生物界面,可以作为生物人工肝中空纤维反应器的膜材料.

RCS大鼠视网膜色素变性过程中视网膜形态学研究

目的研究遗传性视网膜色素变性大鼠(Royal College of Surgeons rat,RCS rat)在视网膜变性发展过程中视网膜形态学变化.方法 RCS-p+(视网膜含色素的变性大鼠)按出生后视网膜变性的发展状况分为变性早期(RCS15 d)、中期(RCS 30 d)、晚期(RCS90 d)3个时相点,分别采用相应时期的RCS-rdy+p+(视网膜含色素的正常大鼠)作为对照组(control groups,C 15 d,C 30 d,C 90 d),每组5眼,取各组大鼠眼球进行视网膜切片,行HE染色,采用MIAS-1000图像分析系统在400倍光镜下测视网膜外节(OS)、外核层(ONL)以及内核层(INL)厚度.结果①视网膜感光细胞随着病变的发展逐渐变性死亡,晚期视网膜色素上皮层和感光细胞层结构紊乱,但光镜下观察内核层、神经节细胞层仍保持较正常的形态.②与对照组比较,RCS大鼠视网膜色素变性过程中感光细胞外节膜盘堆积,外核层变薄,内核层在变性中期增厚,早期及晚期变薄.结论①RCS大鼠病变发展过程中视网膜各层神经元形态改变的不一致性.②变性中期视网膜内核层较对照组增厚,可能与该时期内核层神经元缺乏前级神经元的信号输入致细胞突起反应性增生,产生视网膜形态重构(remodeling)有关.

VEGF诱导人脐静脉内皮细胞体外三维成型和对EphrinB2/EphB4表达的影响

目的观察不同浓度血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对原代培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)体外"小管样结构"(tubule-like structures,TLS)形成能力、表达EphrinB及其受体EphB4的影响.方法采用酶消化法分离、纯化人脐静脉内皮细胞并经形态学和免疫细胞化学鉴定.以不同浓度(0.1～50 ng/m1)的VEGF体外处理传代HUVECs,观测时相点设为刺激后24、48、72、96 h;采用Matrigel三维培养系统和免疫细胞化学染色方法分别观测VEGF处理后HUVECs体外血管形成能力以及EphrinB2/EphB4表达的变化,并对后者进行定量分析.结果 HUVECs有EphB4表达,但未检测到EphnnB2表达;不同浓度的VEGF刺激HUVECs在各观测时间点未见EphB4表达的显著性差异,亦未诱导出EphrinB2表达.VEGF能够诱导HUVECs在Matrigel形成小管样结构,并呈剂量依赖性.结论 VEGF能以剂量依赖方式诱导HUVECs在Matrigel形成TLS,但不能诱导HUVECs表达EphrinB2或EphB4.

细胞周期素D1反义脱氧寡核苷酸对A549细胞增殖及凋亡的调控作用

目的探讨脂质体转染细胞周期素D1(cyclin D1)反义脱氧寡核苷酸链(antisense oligodeoxynucleotide,ASON)对A549细胞增殖及细胞周期的影响.方法采用脂质体转染技术将cyclin D1 ASON转入A549细胞培养,用MTT法检测细胞生长状况,应用流式细胞术(FACS)、检测细胞DNA梯形带等方法观察细胞凋亡及RT-PCR法检测cyclin D1蛋白的表达.结果脂质体转染cyclin D1 ASON组和单纯cyclin D1 ASON组的A549细胞存活率较对照组显著降低(P<0.01).脂质体转染cyclin D1 ASON组cyclin D1表达水平(32%)较对照组(83%)明显减低(P<.01),并能检测出DNA断裂.结论脂质体转染cyclin D1 ASON能在体外明显抑制肺腺癌细胞的生长,且有诱导细胞凋亡、抑制细胞内cyclinD1合成的作用,可能会成为基因治疗的一个新靶点.

真皮多能干细胞移植后向全身照射大鼠骨髓优势分布的机制研究

目的探讨静脉输注的真皮多能干细胞(dermal multipotent stem cells,dMSCs)向全身照射(total body irradiation,TBI)大鼠骨髓优势分布的机制.方法 RT-PCR和荧光免疫化学检测骨髓中基质细胞源性细胞因子(stromal-derived factor-1,SDF-1)的表达水平,以及dMSCs中SDF-1的受体CXCR4的表达水平.Transwell培养体系中,观察SDF-1对dMSCs的趋化作用.结果 TBI大鼠骨髓SDF-1的表达水平明显高于正常大鼠,同时dMSCs表达CXCR4.体外趋化实验发现,SDF-1对dMSCs有很强的趋化作用,而使用SDF-1的中和性抗体后,TBI大鼠骨髓提取液对dMSCs的趋化作用明显下降(P<.05).结论 TBI大鼠骨髓局部上调表达的SDF-1在移植dMSCs向骨髓的优势分布中有重要作用.

原代培养的小鼠星形胶质细胞CD46、CD55、CD59的表达及炎症刺激因子对其的影响

目的通过体外培养小鼠大脑皮层星形胶质细胞,明确补体调节蛋白CD46、CD55、CD59在原代小鼠大脑皮层星形胶质细胞上的表达情况,及炎症因子对CD46、CD55、CD59表达的影响,为研究补体系统在AD中的作用打下基础.方法原代纯化培养小鼠星形胶质细胞,用RT-PCR,免疫荧光的方法,分别在mRNA水平、蛋白质水平,检测炎症因子刺激前以及LPS、IFN-γ单独或协同刺激后,CD46、CD55、CD59的表达情况.结果 RT-PCR检测到CD59 mRNA的表达,CD46、CD55的表达不明确,未刺激组和刺激组无明显差别;免疫荧光结果示CD59阳性,CD46、CD55弱阳性.结论保护素CD59在原代小鼠星形胶质细胞上显著表达,可能可以保护星形胶质细胞免受补体的溶破效应的杀伤.

氯化血红素对大鼠局灶性脑缺血组织的作用探讨

目的探讨氯化血红素(Hemin)在局灶性脑缺血脑组织中作用及其诱导脑红蛋白(Ngb)表达的可能机制.方法将SD大鼠随机分为3组(n=20),分别为假手术对照组、手术组、Hemin处理组,3组大鼠于术后24 h检测脑含水量、脑梗死体积、观察组织病理学改变,免疫组织化学技术了解脑红蛋白表达情况.结果 Hemin处理组脑含水量、脑梗死体积较手术组有显著性差异(P<.05).病理切片观察,Hemin处理组水肿程度较手术组减轻,变性神经元数量较手术组减少.免疫组化分析,Hemin处理组脑红蛋白阳性神经元数量较手术组增多.结论 Hemin能减轻局灶性脑缺血时脑组织的损伤,其可能通过诱导脑红蛋白表达达到脑保护作用.

长时连续作业对大鼠下丘脑及背缝核orexin-A和受体的影响

目的研究长时连续作业对大鼠促觉醒肽orexin-A及受体表达的影响.方法使用长时连续作业动物模型,采用免疫组织化学方法结合图像分析技术测定orexin-A及受体OX1R在下丘脑外侧区,背缝核的变化.结果经过长时连续作业训练后,跑台组与对照组相比,orexin-A阳性细胞在下丘脑外侧区、orexin-A阳性纤维在背缝核及OX1R在背缝核均显著减少.结论长时连续作业可造成促觉醒肽orexin-A和OX1R的表达降低.

线粒体膜通透性转换作用对再灌注损伤后肝细胞凋亡的影响

目的观察大鼠肝脏常温缺血再灌注后肝细胞线粒体通透性转换(mitochondrial permeability transition,MPT)作用及其与肝细胞凋亡的关系;同时观察线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,PTP)开放抑制剂环孢素A(CsA)对MPT的抑制作用,以及对肝细胞凋亡的影响和可能的机制.方法将SD大鼠随机分为3组:假手术组、缺血再灌注组(I/R)、CsA组(I/R+CsA).CsA组术前连续给予CsA 10 mg·kg-1·d-1灌胃4 d,其余组给予等量生理盐水.大鼠热缺血再灌注模型参考Nauta的方法,热缺血时间60 min,分别于再灌注0、1、6、24、72 h等不同时相收取肝组织标本,免疫组化法检测细胞质活性caspase-3;Western blot检测胞浆细胞色素C,TUNEL法检测肝细胞凋亡.结果缺血再灌注引起肝细胞线粒体发生MPT作用,细胞色素C由线粒体释放入细胞质,再灌注后0、1、6、24 h,I/R组及CsA组与假手术组相比,细胞质caspase-3的阳性程度明显增强,肝细胞凋亡明显增多(P<.01);CsA组与L/R组相比,再灌注1、6 h细胞色素C释放显著减少,再灌注1、6、24 h,caspase-3阳性程度明显下降(P<.01);再灌注后6、24、72 h,细胞凋亡明显减少(P<.05).结论缺血再灌注后肝细胞线粒体发生MPT作用可能是引起肝细胞凋亡的关键环节;CsA可能通过抑制PT孔的开放而抑制MPT作用、减少再灌注后细胞色素C释放、抑制caspase-3活化、缓解再灌注后大鼠肝细胞的凋亡.

小鼠STAT3基因干扰质粒的构建及其效果鉴定

目的构建小鼠STAT3基因的特异性RNA干扰质粒,并鉴定其在细胞水平的抑制效果.方法采用DNA载体介导的RNA干扰技术构建小鼠STAT3基因的特异性RNAi质粒(pBS/U6/STAT3-siRNA),并通过RT-PCR、免疫印迹、免疫细胞化学染色等技术对pBS/U6/STAT3-siRNA的抑制效率进行鉴定.结果经双酶切鉴定筛选出4个阳性干扰质粒,分别转入293T细胞后均可明显降低STAT3的表达,尤以靶向(+2 334～+2 351)位点的质粒干扰效率高,达70%.结论小鼠STAT3基因的特异性干扰质粒(pBS/U6/STAT3-siRNA)能从蛋白及mRNA水平上特异和高效地抑制STAT3基因的表达.这种DNA载体介导的双链RNA干扰质粒为进一步探究STAT3与胚胎发育的相关功能提供一种有效的研究工具.

人cubilin蛋白功能片段原核表达系统的建立

目的构建编码白蛋白吞饮受体人cubilin(hcubilin)蛋白配体结合域CUB7-8基因片段的原核表达载体,诱导表达并鉴定表达产物.方法重组DNA技术构建原核表达载体pGEX-hCUB7-8,IPTG诱导表达,SDS-PAGE与免疫印迹法鉴定表达产物,Pull down实验验证融合蛋白是否与白蛋白结合.结果双酶切和测序鉴定表明CUB7-8片段插入正确,诱导表达后获得分子量为52×103的融合蛋白,该融合蛋白可以被抗GST抗体识别,并且可以和白蛋白结合.结论CUB7-8基因片段编码的蛋白质能在原核细胞中正确表达,并且可以和白蛋白结合,这为进一步研究该功能域的结构与功能奠定了基础.

人肺来源的间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的影响

目的探讨来源于人肺的间充质干细胞(MSCs)是否具有免疫调控能力.方法采用流式细胞术鉴定其免疫表型,用淋巴母细胞转化实验观察其是否具有免疫调控能力.结果①MSCs不表达引起免疫反应的细胞表面分子HLA-DR、CD86、CD80等;②随MSCs细胞量增多,抑制T细胞增殖能力越强.结论人肺来源的间充质干细胞具有免疫调控能力.

大鼠无肝状态肾脏罗库溴铵相关转运蛋白OATP-3及其基因的表达变化的研究

目的研究无肝状态前后大鼠肾脏罗库溴铵相关转运蛋白阴离子转运多肽-3(organ anion-transporting polypeptides 3,oatp-3)及其基因表达的变化,以期初步阐释罗库溴铵无肝期肝外代谢特点形成的原因.方法 12只大鼠随机分为2组(6只/组),对照组与阻断肝门60 min组,取各组大鼠肾脏组织,采用Western blot检测各组OATP-3蛋白的表达.采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测各组oatp-3 mRNA的表达.结果大鼠肾脏组织OATP-3蛋白表达水平阻断肝门60min组表达水平高于对照组(P<.01);大鼠肾脏组织oatp-3 mRNA表达水平阻断肝门60min组明显高于对照组(P<0.05).结论大鼠肾脏组织oatp-3在无肝期比无肝期前增多,oatp-3基因表达在无肝期比无肝期前增多,这可能是罗库溴铵无肝期肝外代谢增强的机制.

大剂量地塞米松对大鼠无肝期芬太尼血药浓度的影响

目的揭示大剂量地塞米松处理后大鼠无肝期血药浓度变化规律,探讨芬太尼的肝外代谢及地塞米松对其肝外代谢的影响.方法将大鼠30只随机分为对照组(A组)、无肝期组(B组)、地塞米松处理无肝期组(C组),每组10只,其中,B组直接分离并夹闭大鼠肝门,C组于夹闭肝门前1 h,注入地塞米松20 mg/kg.单次20μg/kg芬太尼静脉注射后,采取血样,用高效液相色谱紫外法检测芬太尼血药浓度.结果无肝期组芬太尼浓度下降比对照组明显减慢(P<0.01),地塞米松处理组较对照组无明显差异(P＞0.05).结论肝脏是芬太尼代谢的主要器官,芬太尼存在肝外代谢,地塞米松可以增强芬太尼的肝外代谢.

CpG-ODN预防膀胱肿瘤复发的可行性研究

目的探讨新型免疫佐剂CpG-ODN预防膀胱肿瘤复发中的应用前景.方法采用骨髓分离法分离小鼠树突状细胞(DCs)并培养鉴定,应用BCG、CpG-ODN刺激DCs,采用ELISA法检测培养上清中细胞因子IL-12、IL-10含量的变化.结果经骨髓分离法培养的DCs经BCG及CpG-ODN刺激后具有典型DCs的形态及表型,IL-12含量均明显增高(P<.01),两组之间无显著性差异(P＞0.05);而IL-10含量BCG组明显高于其他各组(P<.01),而CpG-ODN组刺激DCs后IL-10无明显变化(P＞0.05),non-CpG-ODN刺激DCs后与对照组比较IL-12、IL-10含量无明显变化(P＞0.05),表明CpG-ODN刺激DCs引起的IL-12升高具有序列特异性.结论 CpG-ODN可诱导DCs产生Th1型细胞因子IL-12,对Th2型细胞因子IL-10影响很小,比BCG更能调节免疫应答向Th1型转换,可能在预防膀胱肿瘤复发的应用中具有良好前景.

晚期氧化蛋白产物的分离纯化和鉴定

目的分离纯化以人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)为原料生成的晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products,AOPP),即AOPP-HSA,并对其进行鉴定,以寻求一种制备高纯度且具生物活性的AOPP-HSA的方法.方法采用HSA-HOCl孵育法体外制备AOPP-HSA粗纯品,经凝胶层析和离子交换高压液相层析(high performance liquid chromatography,HPLC)两步层析分离纯化其中的AOPP-HSA,并经紫外和荧光光谱、SDS-PAGE、单核细胞TNF-α分泌实验鉴定其结构特征和生物学活性.结果分离的蛋白质纯度达99.4%,分子质量为700×103,是含有双酪氨酸的蛋白交联聚合物,能够显著刺激单核细胞TNF-α的分泌.结论采用上述两步层析方法能够由粗纯品中成功分离出高纯度并具生物活性的AOPP-HSA,为AOPP的进一步研究奠定了基础.

含rPB-DR启动子和TK基因的重组腺病毒的构建和鉴定

目的构建含rPB-DR启动子和TK自杀基因的重组复制缺陷型腺病毒并进行鉴定,为前列腺癌基因治疗的研究奠定基础.方法应用分子克隆技术,将rPB-DR启动子连接至pBluescript SK-TK上构建出pBluescript SK-rPB-DR-TK,再酶切出rPB-DR-TK目的片断,并将其连接至穿梭质粒pShuttle上.将构建好的pShuttle-rPB-DR-TK经Pme Ⅰ单切线性化后再以电穿孔法转化至E.coli.BJ 5183-AdEasy-1内进行同源重组,抽提质粒经卡那抗性筛选及酶切鉴定正确的即为pAd-rPB-DR-TK,再经Pac Ⅰ酶切回收后以脂质体法转染人胚肾293细胞,包装出完整腺病毒,然后大量扩增测定滴度,并行PCR鉴定.结果经酶切、PCR及测序鉴定证实成功构建了包含rPB-DR启动子和TK自杀基因的重组复制缺陷型腺病毒pAd-rPB-DR-TK,包装、扩增后测病毒滴度为1.1×108 TCID50/ml.结论成功构建出包含rPB-DR启动子和TK自杀基因的重组复制缺陷型腺病毒并鉴定正确,可用于下一步前列腺癌基因治疗的研究中.

动脉粥样硬化鼠骨髓内皮祖细胞数量和功能的变化及其意义

目的观察动脉粥样硬化大鼠骨髓内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)数量和功能的改变,探讨EPCs在动脉粥样硬化发生发展中的可能作用.方法选择动脉粥样硬化大鼠和非动脉粥样硬化大鼠各10例,用密度梯度离心法从骨髓获取单个核细胞,将其接种在培养板,培养7 d后对贴壁细胞进行细胞化学分析.激光共聚焦显微镜鉴定FITC标记荆豆凝血素Ⅰ(FITC-UEA-I)和DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)双染色阳性细胞为正在分化的EPCs.采用改良的Boyden小室和黏附能力测定观察EPCs的迁移和黏附能力.结果动脉粥样硬化大鼠骨髓EPCs数量明显减少[EPCs/(视野×400):(27.2±3.3)与(43.0±12.2),P<.01],且动脉粥样硬化大鼠骨髓EPCs的黏附和迁移能力明显受损.结论动脉粥样硬化的发生、发展可能与骨髓EPCs数量减少、迁移、黏附功能减退有关.

大鼠鞘内促肾上腺素皮质激素释放激素抗伤害性效应的实验研究

目的探讨鞘内预注促肾上腺素皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)是否对甲醛疼痛模型具有抗伤害性效应.方法采用疼痛行为学观察和辐射热测痛评价CRH对甲醛疼痛模型的镇痛作用,采用免疫组化技术结合计算机图像处理系统观察对脊髓后角c-fos基因表达的影响.结果与NS对照组比较,鞘内预注CRH 0.5μg可明显降低甲醛致痛大鼠的Ⅱ相疼痛反应时间,同时可以抑制脊髓后角浅层c-fos基因表达增强的效应,提前1 h腹腔内注射CP-154526可抵消这种抑制效应.结论鞘内预注CRH能明显抑制甲醛致痛大鼠的痛反应和脊髓后角的c-fos基因的表达,具有抗伤害性效应.

SREBP-1c在大鼠非酒精性脂肪性肝病中的表达及意义

目的观察高脂饮食诱导大鼠非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliver disease,NAFLD)过程中肝组织固醇调节元件结合蛋白-1C(sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)的表达,探讨SREBP-1c与NAFLD形成的关系.方法建立大鼠高脂饮食NAFLD模型,用免疫组织化学染色与半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)动态观察NAFLD肝组织中SREBP-1c表达变化,并测定受其调控的脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)酶活性变化.结果与正常对照组相比,NAFLD组大鼠血清FFA、TG水平,肝组织SREBP-1c蛋白表达,FAS酶活性在第2周时变化无显著差异(P＞0.05),而从第4周开始显著增加(P<.05),第12周时达高峰(P<.01);而SREBP-1c mRNA于2周时开始增加(P<.05),12周达高峰(P<.01).结论高脂饮食引起SREBP-1c表达增强,初是一种适应性反应,随着SREBP-1c表达进一步增强,导致脂肪酸代谢失衡,甘油三酯(triglyceride,TG)合成增多,与NAFLD的发生关系密切.

人肾小管上皮细胞在转化生长因子β1诱导下桩蛋白表达研究

目的探讨不同浓度重组人转化生长因子β1(human recombinant transforming growth factor β1,rhTGFβ1)对人近端肾小管上皮细胞株(human kidney proximaltubular epithelial cellline,HKC)表达桩蛋白(paxillin,Pax)的影响.方法将体外培养的HKC随机分为3组:对照组(C组):无血清培养基(free serum mudium,FSM)培养;TGFβ1培养组(T1、T2组):分别用含不同浓度的TGFβ1(T1组:5 ng/ml,T2组:10 ng/ml)的FSM培养,48 h后分别用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)、免疫组化方法和Western blot检测HKC的Pax mRNA及蛋白表达情况.结果①C组:Paxillin mRNA及蛋白有基础的表达;②T1和T2组:Pax mRNA及蛋白表达均明显增加,T2组和T1组相比,Pax的mRNA及蛋白表达量增加更显著(P<.01).结论 TGFβ1能呈剂量依赖性地诱导HKC合成Pax.

Id2在SVZa神经干细胞向神经元分化中的作用

目的研究DNA结合抑制物2(inhibitor 0fDNA binding 2,Id2)在室管膜前下区(anterior subventricular zone,SVZa)神经干细胞向神经元分化中的作用.方法体外分离培养P0昆明小鼠SVZa神经干细胞,正义Id2、反义Id2真核表达质粒转染SVZa神经干细胞,采用流式细胞仪检测在Id2作用下SVZa神经干细胞分化为神经元的比例.采用Westernblot检测不同浓度的骨形成蛋白2(bone morphogenentic protein 2,BMP2)诱导下Id2蛋白的表达变化.结果正义Id2真核表达质粒转染组,SVZa神经干细胞分化为神经元的比例小于空白对照组,反义Id2真核表达质粒转染组,SVZa神经干细胞分化为神经元的比例明显高于空白对照组;随着BMP2浓度的增加,Id2的表达增加.结论 Id2抑制体外培养的P0SVZa神经于细胞向神经元方向分化,BMP2可以促进SVZa神经干细胞Id2的表达,它们共同参与调控SVZa神经干细胞向神经元分化的过程.

EOLA1基因5'侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1)基因5'侧翼区的调控序列.方法通过基因组步移克隆EOLA1基因5'侧翼区不同长度的片段,插入β-半乳糖苷酶(β-gal)报告基因载体,分析各片段在ECV304细胞中的β-gal调节活性.结果含EOLA1基因5'侧翼区-1～-2 659 bp和-1～-1 951 bp序列的重组质粒在ECV304细胞中能明显表现β-gal上调活性,而-1～-361 bp序列的重组质粒活性无明显变化.结论 EOLA1基因5'侧翼区-361～-1 951 bp内存在基因转录启动子元件.

人CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体的构建及测序

目的利用RNA干扰技术,以人CCL20基因为靶基因,设计CCL20基因特异性的小干扰RNA(siRNA),构建其短发夹RNA(shRNA)重组慢病毒表达载体,并进行测序鉴定.方法设计并合成人CCL20基因特异性的DNA寡核苷酸,连接到经Spe Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切线性化的pHSER-dsRNA-GFP-SIN质粒上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性菌落、扩增后提取质粒,进行DNA测序鉴定.结果将合成的两对人CCL20基因特异性DNA寡核苷酸序列退火后,分别克隆到线性化的pHSER-dsRNA-GFP-SIN载体质粒上.在氨苄青霉素培养基条件下,筛选出相应的阳性菌落,经DNA测序鉴定确实为所需序列.结论构建成功了2对人CCL20基因特异性shRNA重组慢病毒表达载体,可进一步用于干扰CCL20基因的mRNA转录,从而为制备CCL20基因表达抑制型的人角朊干细胞奠定基础.

钙信号在周期性牵张诱导逼尿肌细胞高表达Cx43中作用的实验研究

目的探讨钙信号在周期性牵张诱导膀胱逼尿肌细胞高表达连接蛋白43(Connexin43,Cx43)中的作用.方法运用牵张膀胱逼尿肌细胞体外模型,给逼尿肌细胞周期性20%牵张持续6 h,采用RT-PCR测定受EGTA孵浴的逼尿肌细胞Cx43 mRNA表达改变;采用激光共聚焦法,测定不同钙通道拮抗剂作用条件下,细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的改变.结果牵张前30 min培养基中加入5 mmol/L EGTA,可以显著抑制牵张诱导的Cx43 mRNA高表达;机械牵张可以显著增加[Ca2+]i;5 mmol/L EGTA可以完全抑制牵张诱导的[Ca2+]i增加;GdCl3、硝苯地平、兰尼碱与毒胡萝卜素可分别抑制61.95%、29.98%、87.98%由牵张诱导的[Ca2+]i增加.结论牵张诱导Ca2+内流及通过Ca2+内流诱导的钙触发钙释放(calcium-induced Ca2+ release,CICR),在牵张诱导的逼尿肌细胞Cx43高表达反应中可能起着重要的作用.

肝移植术后并发脊柱结核1例

1临床资料患者,男性,37岁,因"肝移植术后5年,胸背痛3月,双下肢麻木,乏力40 d"于2006年3月13日入骨科.2001年7月13日在西南医院行了"肝移植术",术后予强的松冲击治疗5 d,长期服用环孢素A至今.

重庆某高校妇女疾病普查结果分析

本研究就1996、2003年重庆市某高校在职及离退休女职工妇女疾病普查结果进行比较分析如下.

硬膜外导管拔出困难1例

1临床资料患者,男性,19岁,ASA Ⅰ级.因腹股沟可复性包块1年入院,拟在持续硬膜外麻醉下行疝修补术,术前各项实验检查结果正常.术前30 min阿托品0.5 mg、鲁米那钠0.1 g肌注,患者入室后测BP:115/80 mmHg,HR:90次/min,SPO2:98%.

膀胱移行细胞癌VEGFR-2表达与血管生成的研究

目的探讨血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth receptor 2,VEGFR-2)表达与血管新生在膀胱移行细胞癌(bladdertransitional cell carcinoma,BTCC)中的意义.方法应用免疫组化技术检测72例BTCC标本VEGFR-2的表达,并标记CD31阳性细胞计算微血管密度(microvessel density,MVD).结果 72例BTCC中VEGFR-2表达阳性率为56.94%,不同分级、分期、体积的肿瘤之间表达无明显差异.G3级肿瘤MVD高于G1、G2级(P=0.002 91、0.007 37),浸润型肿瘤高于浅表型(P=0.010 13),直径3 cm以上肿瘤高于较小肿瘤(d≤1 cm:P=0.030 76;1 cm<<3 cm,P=0.047 69).多发与单发、初发与复发肿瘤之间VEGFR-2表达和MVD均未见显著差异;VEGFR-2表达阴性和阳性患者MVD无明显差异.结论不同生物学特征BTCC中VEGFR-2表达差异不明显,而血管新生存在差异,可能与肿瘤细胞异质性及血管新生途径的多样化有关.VEGF-VEGFR-2相互作用在刺激膀胱肿瘤细胞增殖中作用可能有限,而MVD对判断膀胱肿瘤恶性程度和预后有一定价值.

突发公共卫生事件下医护人员认知、应对和情绪特点的调查

目的研究突发公共卫生事件下,医护人员对事件的认知、应对及其情绪变化的特点.方法采用自编的心理问题调查表对某综合医院内医护人员进行调查.结果突发公共卫生事件下:①非典型肺炎(severe acute respiratory syndrome,SARS)病房组与本院医护对照组、进修组的医护人员对突发公共卫生事件正性认知、正性应对、负性应对、正性情绪均值差异有统计学意义(P<.05,P<.01);②SARS病房组、本院医护对照组与进修组的医护人员负性认知均值差异有统计学意义(P=0.028、P=0.013,P<.05).结论在突发公共卫生事件下:①经过战前培训的医护人员,正性认知、正性应对、正性情绪明显多于对照组,负性应对明显少于对照组,有较强的心理储备和情绪调节能力;②身份游离,远离亲人,应对资源和心理储备不足的进修组医护人员群体,容易产生较多的负性认知.

心率变异性与急性高原反应评分关系初探

目的应用心率变异性(HRV)探讨自主神经功能与急性高原反应(AMS)症状学评分的相关性.方法 86例健康汉族男性新兵在平原560 m和空运至海拔3 675 m西藏高原2～4 d内,分别接受了短程HRV检测,进藏后当日接受了AMS症状学评分调查.根据该评分将受试者分为基本无AMS组(49例)和AMS组(37例).结果 AMS组平原HRV中平均正常RR间期的标准差(SDNN)、相邻RR间期差的均方根(rMSSD)、低频(LF)以及急进高原rMSSD、SDNN、LF、总功率(TP)、相邻RR间期相差＞50 ms百分数(PNN50)的下降幅度均显著高于基本无AMS组(P<.05,P<.01),但其平原标准化高频(HFnu)则显著低于后者(P<.05).AMS症状学评分与平原rMSSD、SDNN、LF/HF以及急进高原rMSSD、SDNN变化幅度均呈正相关(P<.05),但与平原HFnu呈负相关(P<.01).结论自主神经功能与AMS相关,平原自主神经活性较高、交感神经占优势且对应激反应过强者AMS症状较重,检测心率变异性可在一定程度上预测AMS.

早期开角型青光眼OCT佳诊断参数的研究

目的探讨光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)在早期开角型青光眼(primary open angleglaucoma,POAG)神经纤维层(retinal nerve fiberlayer,RNFL)检查中的佳诊断参数.方法纳入2004-09-2005-07大坪医院野战外科研究所眼科被临床诊断为早期POAG患者119眼和易与OCT结果混淆的对照组148眼.采用StratusOCT 3000成像仪,RNFLT3.4程序检测.采用SPSS11.0的统计分析及建立受试者工作曲线(ROC)曲线.结果 ROC曲线下面积大并与机会对角线有显著性差异(α<.05)的9个参数,分别是钟点位的7、6、11及上、下象限和自定义的Imax、Savg、Iavg和Avg.thick;误诊率大于10%的参数是钟点位1、2、3、4,和象限的鼻侧及自定义的Smax/Imax、Smax/Tavg、Imax/Tavg.结论本研究提示OCT佳诊断参数是钟点位6、7、11,上、下象限和自定义参数Imax、Savg、Iavg和Avg.thick.

经内镜鼻胆管引流术治疗腹腔镜胆囊切除术后胆漏

目的总结经内镜鼻胆管引流术(endoscopic nasobiliary drainage,ENBD)治疗腹腔镜胆囊切除术(1aparoscopic cholecystectomy,LC)后胆漏的疗效.方法对8例经ENBD治疗的LC术后胆漏患者进行回顾性分析,进行经验总结.结果 8例LC术后胆漏患者经ENBD后全部痊愈出院,胆漏愈合时间为6～12 d,平均8.5 d.结论 ENBD是治疗术后胆漏的安全有效的非手术疗法.

术前巨细胞病毒感染对肾移植的影响

目的探讨术前巨细胞病毒(cytomegalovirus infection,CMV)感染对肾移植术后急性排斥反应(acute rejection,AR)的影响及术前预防性抗病毒治疗的意义.方法回顾性分析了116例肾移植受体的术前CMV感染和预防性抗病毒治疗情况,根据术前有无CMV感染分为感染组和非感染组,将CMV感染组肾移植受体根据有无预防性抗病毒治疗分为治疗组和非治疗组.同时检测35例正常健康者CMV结果.采用检测CMV-PP65抗原诊断CMV感染.结果术前CMV感染率肾移植受体为63.8%(74/116)高于正常健康者14.3%(5/35).术后发生CMV感染或CMV病非治疗组为5例(15.6%)高于治疗组1例(2.4%).发生急性排斥反应的术前CMV感染组为14例(18.9%)高于非感染组2例(4.8%).术后发生AR治疗组为4例(9.5%)低于非治疗组10例(31.3%).结论肾移植受体术前CMV感染发生率高于正常健康人群.预防性抗病毒治疗可以降低术后CMV感染或CMV病的发生率.术前CMV感染的肾移植受体术后AR发生率高于非感染者.对术前CMV感染患者采取预防性抗病毒治疗可以降低术后AR的发生率.

自发性脊髓硬膜外血肿的病因探讨

目的探讨自发性脊髓硬膜外血肿(spontaneous spinal epidural hematomas,SSEH)的病因.方法对15例SSEH患者行MRI检查,其中9例患者行脊髓血管造影,8例行血肿清除术并取标本做病理检查.结果 1例患者经脊髓血管造影发现硬膜上的血管畸形,另1例伴有急性淋巴细胞白血病,其余13例未发现明确病因.结论脊髓动脉血管造影有助于部分SSEN患者出血原因的判定,并决定其治疗方案.推测静脉出血可能为多数自发性脊髓硬膜外血肿的主要原因,采用脊髓静脉造影可能有助于SSEH病因的发现.

原发性支气管黏液表皮样癌的外科治疗与预后

目的分析黏液表皮样肺癌的外科治疗及效果.方法回顾总结本科17年间19例手术切除的原发性肺黏液表皮样癌,分析其临床病理特征和外科治疗效果.结果全组均行手术治疗,占同期手术切除肺癌的0.68%.肺叶切除术13例,全肺切除5例,开胸探查1例.15例为低恶性,4例高恶性.术后平均随访68.26个月,无失访,1、3、5年生存率分别为94.44%(17/18)、80.00%(12/15)和70.00%(7/10).其中低恶性占78.95%(15/19),均无淋巴结转移,1、3、5年生存率均为100%;高恶性4例,淋巴结转移率75%(3/4),1年生存率为33.33%,无3年生存率.结论原发性支气管黏液表皮样癌发病率低.病理以低恶性为主.低恶性黏液表皮样癌经彻底手术切除可获治愈,高恶性病人术后易早期发生远处转移,预后差.

2005年重庆市城乡高血压流行病学调查及相关因素分析

目的研究重庆市城乡人群高血压患病情况、危险因素、临床特点.方法 15岁以上人群抽取5 246人进行调查,对城乡人群各年龄段的资料进行对比研究.结果重庆市15岁以上自然人群高血压患病率为18.49%(标化率16.65%),男性为18.79%,女性为18.23%,男女无显著性差异(P＞0.05),其中城市女性高血压患病率为21.65%,男性为19.91%均明显高于农村女性(14.68%)(P<.01).男女均在35岁以后患病率上升幅度明显.15～45岁男性高血压患病率为8.49%高于女性(4.90%)(P<.01),45岁以后男女相近.女性高血压知晓率44.68%、治疗率41.29%分别高于男性(38.13%、32.03%)(P<.05),控制率无差异.城市男女性知晓率、治疗率、控制率分别高于农村,有显著性差异(P<.01).BMI(≥25)、腹型肥胖、年龄、盐、家族史均为城乡高血压的危险因素.结论重庆市城乡人群高血压各有其特点,防治措施必须针对改变膳食结构、加强锻炼、减重等为重点.

定量分析人脑星形细胞肿瘤组织芯片中血管生成与肿瘤微血管结构

目的定量检测人脑星形细胞肿瘤组织芯片中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达及微血管结构参数及其意义.方法采用组织微阵列技术构建包含正常人脑组织、弥漫型星形细胞瘤(WHOⅡ级)、间变型星形细胞瘤(WHOⅢ级)、胶质母细胞瘤(WHOⅣ级)及阳性对照的168点阵的石蜡组织芯片.用免疫组织化学双重染色法标记组织芯片中的VEGF及CD34的表达.采用图像分析软件对组织芯片上VEGF的表达强度以及微血管结构参数(包括血管数、血管平均周长)进行定量测试.结果星形细胞肿瘤各级别之间除VEGF阳性单位(positive unit,PU)值、血管平均周长在Ⅲ级与Ⅳ级之间没有差异外,其他级别之间的差异都有显著性差异(P<.05).结论星形细胞肿瘤中VEGF PU值与微血管结构参数可作为星形细胞肿瘤分级和血管生成程度的重要指标.

奥拉西坦治疗轻中型脑伤的临床研究

目的研究促智药奥拉西坦(oxiracetam)对脑外伤患者的治疗作用.方法将60例轻中型脑伤患者随机分入奥拉西坦治疗组(30例)与吡拉西坦对照组(30例)进行治疗,通过MMSE量表、WMS量表对两组疗效进行评价.结果治疗组与对照组的MMSE、WMS的t值分别为15.85、5.97和6.17、3.77,均有显著性差异(P<.01);治疗组显效12例(40%)、有效16例(53%),总有效率93%,而对照组显效8例(27%)、有效12例(40%),总有效率63%,两组疗效经x2检验有显著性差异(x2=7.20,P<.01).结论奥拉西坦与吡拉西坦治疗轻中型脑伤均有效,但前者疗效优于后者.

术中胆道镜在238例规则性肝段切除治疗肝胆管结石患者中的应用

目的探讨术中胆道镜在规则性肝段切除治疗肝胆管结石患者中的应用价值.方法回顾性分析2000年1月至2004年12月采用规则性肝段切除术联合术中胆道镜治疗238例肝胆管结石患者的临床资料及远期疗效.结果术后并发症发生率为16.0%(38/238),死亡率为2.1%(5/238),单纯肝段切除肝内胆管结石清除率为36.1%(86/238),应用术中胆道镜取石治疗后肝内胆管结石清除率提高至87.4%(208/238),结合术后胆道镜取石治疗后胆管结石清除率达98.3%(234/238).220例患者平均随访39个月,95.9%(211/220)获得优良疗效,其中84.5%(186/220)完全无症状,11.4%(25/220)偶有轻度胆管炎发作;4.1%(9/220)患者因反复发作严重胆道感染而需进一步手术处理.结论在规则性肝段切除治疗肝胆管结石患者术中,应用胆道镜不仅有助于术者选择正确的肝切除,而且作为辅助的治疗手段,能明显减少结石的残留率,从而有助于提高肝胆管结石患者的手术疗效.

绝经前后女性压力性尿失禁尿动力学比较分析

目的比较绝经前后成年女性压力性尿失禁(SUI)的尿动力学特点,探讨绝经前后压力性尿失禁发生机制的差异.方法对116例经临床确诊的成年女性压力性尿失禁患者行腹压漏尿点压测定(ALPP)以及尿道压力图测定,按是否绝经分为未绝经组66例和绝经组50例,比较两组尿动力学特点.结果未绝经组的ALPP值、大尿道关闭压(MUCP)较绝经组高,控制面积(CA)较绝经组大(P<.05);而两组功能尿道长度(FUL)的差异无显著性(P＞0.05).结论绝经前后女性压力性尿失禁有不同的尿动力学特点,提示女性压力性尿失禁的发生机制在绝经前后存在一定差异.

89SrCl2治疗83例多发性骨转移瘤的回顾分析

目的评价89SrCl2对多发性骨转移瘤的疗效和副作用.方法对83例用89SrCl2治疗后的多发性骨转移瘤伴骨痛病例进行回顾性分析,分别从缓解骨痛、骨显像疗效、毒副反应等进行分析.结果 83例伴有骨痛的患者经治疗后,31.3%完全缓解,37.3%中度缓解,18.1%轻度缓解,总有效率为86.7%.毒副反应主要为白细胞和血小板一过性降低,且降幅仅达20%左右.结论放射性同位素89Sr内照射治疗多发性骨转移瘤毒副作用低、疗效肯定,值得临床推广应用.

非生物人工肝治疗慢性重型肝炎的临床应用

目的评价非生物人工肝治疗慢性重型肝炎的安全性及早、中、晚期的临床应用效果.方法对132例早、中、晚期慢性重型肝炎患者在综合治疗基础上给予非生物人工肝支持治疗,观察非生物人工肝治疗前后肝功能、肾功能、凝血酶原活动度(PTa)、血常规、临床症状、血氨及不同时期存活率的变化.结果 132例慢性重型肝炎患者进行非生物人工肝治疗后,肝功能检测血清总胆红素(TB)及谷丙转氨酶(ALT)下降,PTa上升(P<.01);临床症状明显改善,不良反应轻,治疗慢性重型肝炎早、中、晚期的存活率分别为90.0%、53.3%、14.9%.结论非生物人工肝治疗慢性重型肝炎患者副作用小,对慢性重型肝炎早、中期有较好的支持作用.

老年人无张力疝修补术后复发原因及治疗

我院1999-2002年采用无张力疝修补术治疗108例腹股沟疝,术后复发2例(1.9%),同期收治院外无张力疝术后复发13例.现就复发原因及治疗对策作临床探讨.

重症胰腺炎治疗体会

本研究总结了本科自1991年6月至2004年10月86例重症急性胰腺炎治疗的经验并加以分析、探讨.以寻求重症急性胰腺炎早期治疗上更为合理的治疗方案[1].

逼尿肌过度活动的研究进展

正常膀胱在储尿期处于一种舒张状态,这有利于维持较低的膀胱内压,如果由于某种病因在储尿期出现了非自主性的膀胱收缩就称之为逼尿肌过度活动(detrusor overactivity,DO),常见于良性前列腺增生、后尿道狭窄等疾病.

关于计量单位的使用