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急性坏死性胰腺炎大鼠心肌核因子-κB激活及重组葡激酶的干预作用
目的 研究重症急性胰腺炎(SAP)心肌功能损害时心肌核因子-κB (NF-κB)的活化及葡激酶的干预作用.方法 63只SD大鼠随机分为假手术组(n = 9)、ANP组(n = 27)、葡激酶干预组(n = 27),ANP模型采用5%的牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射方法建立.干预自造模前2 d腹腔注射葡激酶1.5 mg/kg体重,一天2次,共4次.ELISA法测定制模后6 h、12 h、24 h各时点血TNF-α、IL-6含量;RT-PCR检测心肌NF-κB mRNA的表达;免疫组化法检测心肌NF-κB蛋白的表达,常规观察胰腺及心肌组织的病理变化.结果 ANP组术后6 h大鼠心肌NF-κB mRNA及NF-κB蛋白表达异常增高,TNF-α、IL-6呈进行性升高,干预组胰腺及心肌组织的病理变化减轻.心肌NF-κB mRNA及蛋白表达下调,血TNF-α、IL-6明显下降,与ANP组比较,差异均显著(P＜0.05).结论 ANP大鼠的心肌损伤可能与循环中TNF-α、IL-6水平升高导致的心肌NF-κB活化有关.葡激酶对SAP并发的心肌损伤具有防治作用.
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重组葡激酶对急性坏死性胰腺炎大鼠心肌细胞凋亡调节基因表达的影响
目的 观察SAP心肌功能损害时心肌细胞凋亡基因的表达及重组葡激酶对其的干预作用.方法 63只SD大鼠随机分为假手术组、ANP 6h、12h、18h组和葡激酶干预6h、12h、18h 组(干预组),每组9只.采用5%的牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射法建立ANP模型.观察心肌的病理变化,免疫组化法检测心肌Bcl-2、Bax及NF-kB的表达.结果 ANP 组心肌片状坏死,NB-kB表达增加,为35.0～59.5;干预组心肌的病理变化减轻,NF-kB表达为10.5～17.0,较ANP组明显减少(P＜0.05).ANP12h、18h组Bcl-2表达较假手术组显著减少(0.12～0.08vs0.31,P＜0.05),而Bax表达显著增加(1.48～2.83vs0.68);干预12h、18h组Bcl-2表达较ANP组明显增加,达0.34～0.36(P＜0.05),而Bax表达明显减少,为1.06～1.10(P＜0.05).结论 ANP 大鼠心肌NF-kB和Bax表达增加,Bcl-2表达减少;葡激酶干预后NF-kB及Bax的表达被抑制,Bcl-2的表达上调.
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急诊溶栓治疗过程与评估
急诊溶栓是早期治疗急性心肌梗死(AMI)、肺栓塞、急性缺血性脑卒中(ACIS)的有效措施.过去20多年里,急诊溶栓的开展使急性血栓性疾病的病死率大幅度下降.随着溶栓药物的发展,急诊溶栓治疗的效果进一步提高.临床常用的溶栓药物有:尿激酶(UK)、链激酶(SK)及重组组织型纤溶激活剂(rt-PA).天然提取的溶栓剂如吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂、葡激酶(SAK)显示出良好的应用前景.植物中发现的抗纤溶酶原激活物的抑制剂化合物PUW-1,可能避免出血副作用,它是惟一可口服的溶栓药.
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重组葡萄球菌激酶和尿激酶对兔大脑中动脉栓塞溶栓作用的实验研究
目的 比较动脉内注射r-Sak和UK的溶栓特点.方法 用兔大脑中动脉栓塞模型,以血管造影血管再通率、脑梗塞范围、行为障碍评分、血浆纤溶及凝血指标来确定溶栓治疗的效果及对全身纤溶系统的影响.结果 给药后90分钟内,r-sak和UK血管溶通率分别为100%和40%(P＜0.05);UK使血浆纤维蛋白原明显降解,给药30分钟TT及KPTT即有明显延长,r-sak对血浆纤维蛋原及凝血指标无影响;r-sak组和UK组血浆纤溶酶原、评分和脑梗塞范围相比均P＜0.01.结论 同等剂量的r-sak的溶栓作用明显强于UK.r-sak的溶栓作用具有纤维蛋白特异性,UK则激活了全身的纤溶系统.
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新型低抗原性葡激酶的构建、表达及功能分析
目的:降低野生型葡激酶(wild-type staphylokinase,wt-SAK)的抗原性,获得新型溶栓剂.方法:利用生物信息学分析野生型SAK抗原表位,将其分子内主要的抗原决定簇编码序列定点突变为丙氨酸密码子,将其N端抗原性较强的前10位氨基酸缺失.经过筛选从系列突变体中得到突变体NSAKV.结果:生物信息学分析突变后分子抗原性,结果表明其主要抗原表位消失.该突变体(NSAKV)与原核表达载体pET17b重组后,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导获得高效表达,NSAKV占全菌总蛋白的40%～50%,以可溶性形式存在.经进一步纯化,纯度达98%以上,分子量与理论值相符.比活性2.616×104 AU/mg.经ELISA法和溶圈法测定,NSAKV与wt-SAK制备的免抗wt-SAK抗血清的免疫反应性显著降低,经抗血清温育后wt-SAK活性下降程度远高于NSAKV.结论:突变体(NSAKV)保持了野生型SAK的活性,同时抗原性下降.
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新型葡激酶的研究进展
本文详细阐述了新型葡激酶的结构、作用机理和改构现状.葡激酶是一种溶栓剂,具有纤维蛋白选择性好、溶栓效率高、价格经济等优点,但作为细菌源蛋白质,葡激酶用于患者会产生中和性抗体,严重影响它的治疗效果和反复应用.目前对葡激酶的研究主要致力于结构改造,减小其免疫原性,提高疗效.
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葡激酶突变体(K35R)PLGA微球的制备和表征
目的制备葡激酶突变体(K35R,DGR)的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微球,使其在包封和释放过程中都能保持活性.方法使用复乳溶剂挥发法制备DGR的PLGA微球,研究了搅拌速度、PLGA浓度、内水相和外水相中的添加剂对蛋白包封率以及微球性质的影响,并进行了DGR微球的体外和体内释放试验.结果 2%聚乙烯醇可以有效抑制超声乳化时DGR在水/二氯甲烷界面上的变性,将DGR的活性回收率从16%提高到几乎100%.在外水相中加入NaCl可以显著提高蛋白包封率,同时对微球的粒径分布和表面形态也产生了重要影响.DGR微球的体外释放呈现两个时相,15 d释放大约DGR总活性的50%.DGR微球在体内持续释放5 d.结论制备的PLGA微球,DGR包封率高,稳定性较好,是DGR的良好载药系统.
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重组SAK及其突变体多克隆抗体制备及应用研究
目的 通过制备SAK及其突变体(SAK2)的多克隆抗体,检测并比较两者的免疫原性.方法 将4只新西兰大耳白兔随机分为SAK组2只,SAK2组2只,皮下多点注射抗原SAK及SAK2.第3次免疫1周后,收集血清.使用饱和硫酸氨沉淀及DEAE离子交换法纯化多克隆抗体,ELISA检测抗血清效价.ELISA检测抗原抗体反应性,比较SAK和SAK2的免疫原性.结果 兔抗SAK多克隆抗体与SAK2的反应性显著低于与SAK的反应性,兔抗SAK2多克隆抗体与SAK和SAK2的反应性无明显差异.结论 使用多克隆抗体检测抗原抗体反应性的结果显示,SAK突变体SAK2缺失了部分抗原表位,同时未产生新的抗原表位.与SAK相比SAK2可能具有较低的免疫原性.利用多克隆抗体检测抗原抗体反应性对判断抗原性变化具有重要价值.
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葡激酶在变铅青链霉菌中的克隆和分泌表达
目的构建可分泌表达葡激酶的基因工程链霉菌.方法通过PCR方法扩增得到包括葡激酶结构基因和分泌信号肽基因在内的730 bp的DNA片段,将该片段插入变铅青链霉菌质粒pIJ459的erm强启动子下游,构建重组质粒pIJ459SAK,转化变铅青链霉菌TK54.结果获得含有该重组质粒的基因工程菌株,经发酵培养基培养72 h后,发酵液离心取上清用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,可见相对分子量约为16 000的特异性蛋白条带;用溶纤平皿法可测得溶纤活性.结论葡激酶已在所构建的基因工程菌中分泌表达且具有溶纤活性.
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金黄色葡萄球菌肠毒素的研究进展
葡萄球菌是革兰阳性球菌中的一种,广泛分布于自然界,如:空气、水、土壤等,同时存在于人体、动物体的皮肤及其与外界相通的腔道中.绝大部分不致病,少数可引起人类感染,其中的金黄色葡萄球菌致病力强,主要是因为其产生大量的侵袭性物质,如:各种酶类,多种毒素和菌体的一些成分等等.金黄色葡萄球菌产生的主要酶类有:凝固酶、耐热核酸酶、葡激酶等;产生的主要毒素有:肠毒素、葡萄球菌溶素、杀白细胞素、表皮剥脱毒素、毒性休克综合征毒素-1等.目前国内外对金黄色葡萄球菌肠毒素的研究主要集中在检测方法和作为超抗原的致病性两个方面.
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蚓激酶研究与应用进展
血栓性疾病的发病率和死亡率均较高,并呈逐年上升趋势.人们从多种生物组织、体液中分离提取到多种溶栓酶如:尿激酶、葡激酶、蛇毒纤溶酶原激活剂等,并已经开发成抗血栓类药物应用于临床,但这些药物有的生产成本高,价格昂贵;有的副作用较大,可能引起出血;有的需静脉给药,使用不便.大量研究表明蚯蚓蛋白提取物(蚓激酶/蚯蚓纤溶酶,EFE)无论静脉注射或口服给药,均有溶栓作用,且蚯蚓中含量丰富,活力较高,生产成本低廉,因而受到广泛关注.
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利用目的基因随机表位库筛选葡激酶抗原决定簇
目的:用目的基因随机表位库方法寻找葡激酶(straphylokinase SAK)的显性表位.方法:①SAK免疫BALB/C小鼠,免疫亲和层析纯化抗血清后,抗SAK抗体用生物素标记;②构建SAK随机表位肽库,随机挑取12个独立克隆测序,分析库DNA片段的分布和碱基含量情况;③以多抗为靶蛋白用克隆原位杂交法筛选肽库;④构建SAK的缺失突变体mSAK,Westernblot分析mSAK的免疫反应性.结果:①筛选肽库得到一个由19个氨基酸组成的免疫显性表位区,命名为A1区;②mSAK不能与抗SAK多抗反应.结论:用简便、有效的方法筛选得到了SAK的一个表位A1区,初步确定A1区是SAK引起免疫反应的重要区域.
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葡激酶纳米脂质体的制备及靶向溶栓的实验研究
目的 探讨葡激酶(PK)纳米脂质体的溶栓效果.方法 采用逆相蒸发法制备PK纳米脂质体,并用反相液相色谱(HPLC)法制备归巢装置,观察PK纳米脂质体包封率、分散性、形态、大小,制备血栓动物模型,应用不同剂量的PK纳米脂质体导向装置,观察溶栓效果.结果 PK纳米脂质体平均粒径为(78.6±5.7)nm,多分散性指数为0.298.PK纳米脂质体包封率71.5%,回收率93.2%.分析10、20、30、40 min各个时间段,PK大剂量组与精-甘-天冬-丝氨酸(RGDS)-PK纳米脂质体在血压变化方面与对照组均有显著差异(P＜0.05),各实验组的血栓湿重与对照组比较均有显著差别(P＜0.001).其中PK纳米脂质体、RGDS-PK纳米脂质体与小剂量PK组比较有统计学意义(P＜0.05).结论 制备PK纳米脂质体是可行的,RGDS有导向性,该归巢装置具有较好的溶栓效果.
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重组葡激酶治疗实验性幼猪急性脑栓塞的量效研究
目的:应用数字减影脑血管造影(DSA),研究重组葡激酶(rSaK)治疗幼猪急性脑栓塞的疗效.方法:幼猪48头,随机分为对照组,7个rSaK治疗组(4 000～64000IU Kg-1);经颈内动脉注入体外血栓建立幼猪急性脑栓塞动物模型;4 h后静脉应用rSaK,对照组用安慰剂.治疗结束后30min,60min,90min复查DSA.结果:随着rSaK剂量增大和观察时间延长,DSA血管再通率升高.rSaK8000IU@kg-1或8 000IU@kg-1以上剂量组的血管再通率均大于对照组(P＜0.05).结论:静脉应用rSaK溶化脑血栓有明显量效关系,低有效溶栓剂量为8 000 IU@kg-1.
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新型聚乙二醇化葡激酶的表达、纯化及功能鉴定研究
目的 通过对葡激酶(SAK)基因序列进行定点突变、表达、纯化与进行聚乙二醇修饰以获得较高纯度的聚乙二醇化葡激酶(peg-SAK-cys),并对其溶栓活性与免疫原性初步进行验证.方法 根据SAK蛋白晶体结构及抗原位点选择突变位点,设计引物将所选的氨基酸突变为半胱氨酸.将突变质粒通过化学转化进入BL21 (DE3)感受态,并利用经典原核表达技术,在大肠杆菌中表达突变葡激酶(SAK-cys).利用镍离子交换柱、分子筛等方法分离纯化目的蛋白.用纤维蛋白平板溶圈法和血栓弹力图初步对其生物活性进行验证.以酶联免疫吸附(ELISA)法评价peg-SAK-cys的免疫原性.结果 成功获得了SAK-cys质粒,表达、纯化了突变蛋白,并进行聚乙二醇修饰获得了peg-SAK-cys,分离纯化后纯度在总蛋白质量的90％以上.计算其溶圈实验结果,活性为8.2×104 IU·mg-1;血栓弹力图实验结果提示其具有较高的溶栓活性;免疫原性测定结果提示peg-SAK-cys免疫原性低于野生型SAK (P=0.000 2).结论 通过位点特异性特变与聚乙二醇修饰技术的联合运用可以成功改造出有较低免疫原性的活性SAK.
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重组葡激酶N端缺失突变体对纤溶酶原的激活作用
目的比较重组葡激酶(SAK)及其N端缺失突变体(ΔNSAK)对纤溶酶原(PLG)激活作用的酶动力学常数,探讨SAK N端结构与功能的关系,以进一步改造SAK分子.方法采用酶反应动力学方法结合生物传感器测定SAK、ΔNSAK与PLG、纤溶酶(PLM)作用的动力学常数.结果两者与PLM形成的复合物催化PLG的Km值分别为6.29、4.6 μmol/L,Kcat值分别为0.725 s-1、0.312 s-1;两者与PLG的亲和系数分别为2.64×108、1.07×109;与PLM的亲和系数分别为1.32×109、3.67×108.结论 SAK N端18个氨基酸对SAK.PLG复合物及SAK.PLM酶催化活性中心的形成无明显影响.
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抗葡激酶单克隆抗体的制备与鉴定
目的制备抗葡激酶单克隆抗体用于重组葡激酶生物活性的免疫检测。方法用重组葡激酶免疫BALB/c小鼠，将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经酶联免疫吸附试验筛选获得3株分泌抗葡激酶单克隆抗体细胞株。结果经检测上述单克隆抗体与葡激酶有很强的亲和性，与宿主菌蛋白和人血清无交叉反应。结论上述方法检测葡激酶生物活性具有亲和性、特异性高及快速、简便的特点，可用作动物和人类临床试验中检测葡激酶生物活性的一种手段。
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重组葡激酶的研究进展
葡激酶(Staphylokinase,Sak)是从金黄色葡萄球菌中提取的一种能够激活纤溶酶原的物质,与尿激酶(Urokinase,UK)和链激酶(Strcptokinase,SK)相比,葡激酶是一种纤维蛋白专一性极强、纤维蛋白原降解少的极具潜力的溶栓剂.本文就葡激酶的结构、溶栓机制、溶栓特性和免疫活性及临床应用作一综述.
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新型溶栓药-葡激酶对实验性脑微血栓溶栓效果的观察
目的：探讨国产葡激酶对脑微血管富血小板血栓的溶栓效果。方法：在成功建立了金黄地鼠软脑膜微动脉富血小板血栓模型的基础上，通过显微—录像图像监视系统动态观察了双龙葡激酶三个剂量组的溶栓效果，并与生理盐水及尿激酶作对比，记录分析溶栓、再栓及出血等情况。结果：四个用药组均比生理盐水对照组有显著溶栓效果；双龙葡激酶三个剂量组均比尿激酶对照组有显著溶栓效果。结论：对于富血小板血栓，双龙葡激酶具有较好的溶解效果，该效果优于尿激酶。
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重组葡激酶加中药对重症急性胰腺炎大鼠心肌核转录因子кВ的激活作用
[目的]研究重症急性胰腺炎(SAP)心肌功能损害时心肌核转录因子кВ(NF-кВ)的活化及葡激酶的干预作用.[方法]63只SD大鼠随机分为假手术组(n=9)、对照组(n=27)、葡激酶合用益活清胰汤治疗组(n=27),SAP模型采用5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射方法建立.ELISA法测定6、12、24 h各时点血肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平,RT-PCR检测心肌NF-кВ mRNA的表达,免疫组化法检测心肌NF-кВ蛋白的表达,苏木精-伊红染色光镜下观察胰腺及心肌组织的病理变化.[结果]术后6 h大鼠心肌NF-кΒmRNA及其蛋白表达异常增高,TNF-α、IL-6呈进行性升高,治疗组用药后心肌NF-кВmRNA及蛋白表达下调,血TNF-α、IL-6明显下降,与对照组相比P＜0.05,治疗组胰腺及心肌组织的病理变化减轻.[结论]SAP大鼠心肌损伤可能与循环中TNF-α、IL-6水平升高导致的心肌NF-кВ活化有关,益活清胰汤合用葡激酶对SAP并发的心肌损伤具有防治作用.
