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肝纤维化大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为类肝细胞
目的 观察正常、肝纤维化模型组大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外诱导分化为类肝细胞的差异.方法 Wistar大鼠随机分为对照组和肝纤维化模型组.用皮下注射CC14乳剂建立肝纤维化模型.用密度梯度离心法和贴壁法分离大鼠的MSCs,经培养传代获得纯化的MSCs.用肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子4(FGF-4)诱导培养纯化的MSCs.留取15、21和27 d细胞培养液进行白蛋白(Alb)、甲胎蛋白(AFP)检测;于27 d收集细胞爬片,进行糖原染色和免疫细胞化学染色检测MSCs中CK-18、CK-19.结果 于诱导15、21和27 d,2组经诱导培养的MSCs AFP水平均高于未诱导的MSCs(P<0.01),其中21 d AFP水平高;而白蛋白水平21和27 d 2组经诱导培养的MSCs均高于未诱导的MSCs(P<0.01),15 d无差异,27 d高.27 d 2组经诱导培养的MSCs糖原染色和CK-18、CK-19免疫细胞化学染色均阳性,未诱导的MSCs糖原染色、CK-18、CK-19均阴性.从AFP、白蛋白水平综合比较,正常和肝纤维化模型组大鼠MSCs诱导效果无明显差别.结论 HGF、FGF-4可在体外诱导肝纤维化大鼠的MSCs分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞.
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胎肝间充质干细胞和皮肤成纤维细胞有限细胞系的建立及肝向分化研究
通过体外长期培养胎肝间充值干细胞和皮肤成纤维细胞,建立两种细胞长期培养体系并比较此两种细胞的表型特征及向肝细胞分化的潜能。方法 从人胎肝中分离贴壁生长的间充质干细胞,同时取同一个体的皮肤组织,分离培养成纤维细胞。采用免疫细胞化学法及流式细胞术检测上述两种细胞的CD34,CD90,CD105等细胞表型;染色体分析及软琼脂克隆形成实验鉴定细胞的生物学特性。利用肝细胞生长因子(HGF),成纤维细胞生长因子4(FGF4)、抑瘤素M(OsM)等组成的肝细胞培养基对P3-30细胞进行肝细胞诱导分化。采用免疫细胞化学方法对诱导和未诱导的细胞进行白蛋白(ALB)、CK18、CK19等免疫学检测。PAS法糖原染色,RT-PCR法检测甲胎蛋白(AFP)和ALBmRNA表达。结果 胎肝间充质干细胞高表达CD90,而皮肤成纤维细胞几乎不表达。在肝细胞条件培养基中培养,成纤维细胞转化为类肝细胞的比例为(5.1±0.2％,而胎肝间充质干细胞转化为类肝细胞的比例为(10.3±0.3)％,两组差异有统计学意义(P＜0.01)。此两种细胞均可在体外长期稳定培养,传50余代,保持正常核型,无致瘤性,但难以无限传代。结论 成体组织中体外能够长期培养的间充质干细胞可能是有一定寿命的。特定成体组织内的间充质干细胞可能具有更高的分化为所在组织实质细胞的潜力。
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不同诱导条件对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导类肝细胞的影响
目的:探讨实验性大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、诱导的优条件,为MSCs治疗临床重症肝病患者提供参考依据.方法:采用密度梯度离心法和贴壁法分离大鼠MSCs.经培养传代获得纯化的MSCs.采用析因实验,设不同诱导时间、不同浓度的FBS、不同浓度的细胞因子为3个因素,每个因素设不同水平,对纯化的MSCs进行分组诱导培养.留取15、2l、27 d细胞培养液进行白蛋白(A1b)、甲胎蛋白(AFP)检测;于27 d时收集细胞爬片,采用过碘酸希夫(PAs)实验进行糖原染色和免疫细胞化学染色检测MSCs中CK-18和CK-19.结果:诱导15、21、27 d,各MSCs诱导组AFP水平均高于MSCs非诱导组(P＜0.01),21 d诱导组AFP水平高:15 d各MSCs诱导组与MSCs非诱导组白蛋白水平无统计学意义,21、27d各MSCs诱导组白蛋白水平均高于MSCs非诱导组(P＜0.01),27 d诱导组白蛋白水平高.27d各MSCs诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18、CK-19均阳性,而MSCs非诱导组糖原染色、CK-18、CK-19均阴性.多因素方差分析表明,Mscs体外佳诱导条件为含200mL/LFBS的DMEM+肝细胞生长因子(HGF)20Ug/L+成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)20UG/L.结论:HGF和FGF-4可在体外诱导实验性大鼠Mscs分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞:不同浓度的FBS、HGF和FGF-4影响MSCs的体外分化;MSCs可作为治疗临床重症肝病的一种细胞来源.
关键词： 骨髓 间充质干细胞 类肝细胞 肝细胞生长因子 成纤维细胞生长因子-4 -
大鼠骨髓间充质干细胞向类肝细胞体外诱导分化
目的:观察不同条件下骨髓间充质干细胞(MSCs)体外诱导分化为类肝细胞的差异.方法:Wistar大鼠24只随机均分为3组,分别为正常对照组、肝纤维化模型组、自拟中药干预组.采用CCl4乳剂皮下注射建立肝纤维化模型.造模成功后中药干预组采用丹金舒肝胶囊药液灌胃治疗.治疗结束后剖杀大鼠,留取大鼠肝脏标本,HE染色观察各组病理改变.采用密度梯度离心法和贴壁法分离各组大鼠的MSCs,经培养传代获得纯化的MSCs.各组纯化的MSCs采用HGF、FGF-4进行诱导培养.留取15、21、27 d细胞培养液进行白蛋白(Alb)、甲胎蛋白(AFP)检测;于27 d收集细胞爬片,进行糖原染色和CK-18免疫细胞化学染色.结果:3组15、21和27 d各MSCs诱导组AFP水平均高于MSCs非诱导组(P<0.01),其中21 d AFP水平高(肝纤维化模型组:48.94±0.08 vs 9.90±0.09;中药干预组:49.86±0.29vs 8.69±0.62;正常对照组:38.65±0.33 vs9.04±0.11,均P<0.01);3组15 d各MSCs诱导组与MSCs非诱导组白蛋白水平无统计学意义:21 d、27 d各MSCs诱导组白蛋白水平均高于MSCs非诱导组(1.11±0.08 vs 0.32±0.00,1.25±0.04 vs 0.32±0.00,1.06±0.03 vs 0.33±0.00;1.52±0.02 vs 0.33±0.00,1.79±0.01vs 0.31±0.03,1.63±0.04 vs 0.32±0.01,均P<0.01),27 d高.27 d各MSCs诱导组糖原染色阳性,免疫细胞化学染色CK-18均阳性,而MSCs非诱导组糖原染色、CK-18均阴性.从AFP、Alb水平综合比较,3组诱导效果发现自拟中药干预组优于其他2组.结论:HGF、FGF-4可在体外诱导实验性大鼠的MsCs分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞:自体MSCs可以作为治疗临床重症肝病的一种细胞来源,而临床联合中药复方治疗可能会使MSCs体外诱导的效果更为理想.
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人胎儿骨髓间充质干细胞来源的类肝细胞的分子生物学鉴定
目的:对MMSCs来源类肝细胞进行分子生物学鉴定.方法:从人胎儿骨髓中分离MMSCs,在10 g/L Matrigel作基质,2.5 mmoL/L AZA预处理10-12 h,HGF 10 μg/L+FGF4 10μg/L+HGM培养基中培养和诱导.收集诱导培养4,7,14,21,28 d时的细胞爬片,SABC免疫组化法DAB显色检测肝细胞早期标志AFP,CK19及早期转录因子GATA4,成熟肝细胞标志ALB,CK18,GST-π,肝细胞转录因子HNF1α;提取诱导分化10 d和第28 d细胞RNA及蛋白质,设计AFP,CK19,ALB,CK18,CYP1B1,CYP2B6引物,进行RT-PCR,观察在mRNA水平肝细胞标志的表达,采用Western blot检测CK18,AFP,ALB的表达量.结果:未诱导培养的MMSCs中,有较少的细胞表达AFP,未见其他肝脏特有的转录因子或者胞质蛋白标志.免疫组化显示在诱导早期可见较多细胞呈GATA4,AFP和CK19阳性表达,至诱导后期表达下降,而ALB,CK18,GST-π和肝细胞转录因子HNF1α阳性细胞比例逐渐上升.RT-PCR显示,未诱导的MMSCs仅可表达微弱的AFP mRNA,诱导早期可见AFPmRNA和CK19mRNA表达,诱导后期未见扩增,而ALB,CK18,CYP1B1 mRNA早期和后期均可见表达,在诱导后期可见CYP2B6 mRNA表达,但很弱.Western blot检测显示诱导细胞中AFP,ALB和CK18蛋白的表达趋势同基因表达类似.在65 ku和68ku处诱导细胞组可见AFP和ALB目的条带,在45 ku处诱导细胞组可见CK18目的条带.未诱导的细胞和诱导早期细胞中AFP有表达,后期未见.诱导早期和后期CK18和ALB均有表达,且后期增强.结论:MMSCs向类肝细胞的横向分化是先分化为肝前体细胞,再分化为成熟肝细胞,在本实验诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞.
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人脐血间充质干细胞体外诱导分化为类肝细胞
目的:建立人脐血间充质干细胞(umbilical cord bloodmesenchymal stem cells,UCBMSC)的体外分离、培养方法,体外诱导UCBMSC分化为类肝细胞,观察UCBMSC细胞生物学特性,并对类肝细胞进行分子生物学及功能鉴定.方法:采用体外细胞培养技术,分离培养人脐血UCBMSC,在10 g/L Matrigel作基质,2.5mmol/L AZA预处理10-12 h,HGF 10μg/L+FGF4 10μg/L+HGM培养基中诱导.用显微摄像和MTT研究细胞增殖及生长特征,用流式细胞仪、免疫组织化学、RT-PCR鉴定细胞表型.采用ELISA法检测培养上清中人白蛋白水平.结果:每份脐血可获得150±20个贴壁细胞;细胞种植后6 d达到对数生长期,连续传10代后,每份脐带血UCBMSC可扩增达109-1010个细胞UCBMSC表型为CD44及CD166阳性,CD34及CD45阴性.在添加FGF4和HGF的Matrigel上诱导培养的UCBMSC在21-28 d时,形态由长梭形变为三角形,多角形或类圆形.细胞转圆率为40-50%,双核细胞比率5-7%.免疫组化,RT-PCR检测显示未诱导培养的UCBMSC中,有较少的细胞表达AFP及其mRNA,未见其他肝脏特有的转录因子或者胞质蛋白标志.诱导早期可见较多细胞表达GATA4,AFP和CK19及其mRNA,至诱导后期表达下降,而ALB,CK18,GST-π和肝细胞转录因子HNF1α表达逐渐上升.ALB,CK18阳性细胞比例达61-65%.未诱导分化的UCBMSC没有分泌ALB和产生尿素,诱导分化的UCBMSC以时间依赖方式产生白蛋白.结论:人脐血UCBMSC先分化为肝前体细胞,再分化为成熟肝细胞,获得了在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞,已具备肝细胞特有的分泌白蛋白功能.
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一种获取人类肝细胞的新方法
近年来新发展起来的肝细胞移植、生物人工肝等新型治疗手段也依然面临着肝细胞缺乏的问题。因此发展新的方法生产人肝细胞已经迫在眉睫。据《Cell Stem Cell》2014年2月28日报道，中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所等合作研究组新研究发现，通过表达三个肝脏转录因子，可成功将人体皮肤细胞转变为肝细胞。
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皮肤成纤维细胞体外长期培养及肝向分化研究
目的 本研究通过体外长期培养皮肤成纤维细胞,试图建立此种细胞的长期培养体系,探讨其向肝细胞分化的潜能.方法 从人胎上臂取皮肤组织,分离培养成纤维细胞.采用免疫细胞化学法及流式细胞术检测细胞的CD34、CD90、CD105等细胞表型；染色体分析及软琼脂克隆形成实验鉴定细胞的生物学特性.利用肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子4(FGF4)、抑瘤素(OSM)等细胞因子对第3～30代细胞进行肝细胞诱导分化,采用免疫细胞化学方法对诱导和未诱导的细胞进行白蛋白ALB、细胞角蛋白CK18、CK19等免疫学检测,PAS法糖原染色,RT-PCR法检测甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)mRNA表达.结果 皮肤成纤维细胞表达CD29、CD49f、HLA-Ⅰ、CD105等间充质细胞标志,几乎不表达CD90.在肝细胞诱导条件培养基中培养,成纤维细胞转化为类肝细胞的比例约为5％.此种细胞可在体外长期稳定培养,传50余代,保持正常核型,无致瘤性.结论皮肤成纤维细胞具有间充质干细胞的特性,体外能够诱导分化为类肝细胞.
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LO-2细胞上清诱导人脐血干细胞向类肝细胞分化
目的:探讨体外培养人脐血单个核细胞向类肝细胞的分化.方法:收集LO-2细胞培养上清液加入培养基培养分离出的脐血单个核细胞,连续10 d检测甲胎蛋白(AFP)的表达情况,细胞传代后无诱导剂(LO-2细胞培养上清液)情况下检测白蛋白(ALB)表达情况.结果:培养6d后AFP出现阳性结果,细胞传代后在无诱导剂的情况下ALB检测阳性.结论:在LO-2细胞上清的诱导下,脐血单个核细胞能够分化为类肝细胞.
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大鼠骨髓间充质干细胞诱导为类肝细胞移植修复急性肝损伤
背景:对于肝衰竭或肝功能支持替代方法来讲,原位肝移植供体来源有限,肝细胞移植受供体缺乏和免疫排斥反应的困扰,肝脏干细胞存在数量少且体外增殖困难等限制.目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子联合诱导为类肝细胞后移植对损伤肝脏的形态学修复效果.设计、时间及地点:细胞观察,于2006-10/2007-09在解放军总医院第一附属医院创伤实验室完成.材枓:清洁级Wistar大鼠48只,随机分为诱导组、对照组,24只/组.另取Wistar大鼠3只用于分离制备骨髓间充质干细胞.肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子由Sigma公司生产.方法:贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,胰酶消化传代,传至第3代向细胞中加入含20μg/L肝细胞生长因子、10g/L表皮细胞生长因子的D/F12培养液悬浮诱导,调整细胞密度为108L-1.两组大鼠均腹腔注射D-氨基半乳糖建立肝脏损伤模型,造模后24h,诱导组门静脉移植诱导后的骨髓间充质干细胞悬液1mL,对照组移植等量未经诱导的骨髓间充质干细胞.主要观察指标:移植后第1,7,14天,免疫组化检测CKl8、CD34阳性细胞的分布迁移情况.透射电镜观察汇管区新增生细胞的超微结构.结果:[1]与对照组比较,诱导组汇管区CKl8、 CD34阳性细胞明显增多,并从汇管区向肝小叶内迁移,不断分化为成熟的肝细胞;同时汇管区新生的小胆管数量亦明显增多,且有部分向坏死区迁移,参与肝脏的修复.[2]透射电镜下对照组卵圆形细胞数量较少,而诱导组汇管区有新生内源性细胞,可发现数个细胞排列成的小胆管,并逐渐演变为体积较大的肝细胞.结论:从形态学角度看,骨髓间充质干细胞向类肝细胞诱导分化后移植于受损伤的肝脏,可一定程度上修复肝脏损伤.
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体外诱导脂肪源性干细胞向类肝细胞的定向分化
背景:用脂肪源性干细胞治疗肝脏疾病之前,如何建立有效稳定的肝细胞分化诱导方案,纯化并快速扩增性能稳定的类肝细胞等问题亟待解决.目的:建立大鼠脂肪源性干细胞转化为类肝细胞的程序化诱导体系.方法:分离纯化Lewis大鼠脂肪源性干细胞,流式细胞仪鉴定其表面标志,分3个阶段加入含有肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4、酸性成纤维细胞生长因子、制瘤素M细胞因子的诱导培养体系,使脂肪源性干细胞向肝细胞转化.结果与结论:大鼠脂肪源性干细胞诱导7,14,21 d后,细胞阳性表达 ALB、AFP、CK18mRNA,表达量随诱导时间延长而增强,类肝细胞具有白蛋白合成功能.氨代谢和尿素的合成功能在9~12 d出现并持续存在.结果表明脂肪源性干细胞体外分段诱导可成功转化为类肝细胞.
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人脐血间充质干细胞向类肝细胞分化:人肝细胞共培养诱导法的可行性?
背景:研究表明共培养条件下,骨髓间充质干细胞可向心肌细胞、肝样细胞等方向分化.目的:探讨人脐血间充质干细胞与人肝细胞在体外共培养条件下,诱导人脐血间充质干细胞分化为类肝细胞的可行性.方法:无菌条件下采集新生儿脐带血,采用密度梯度离心法与贴壁法分离纯化脐血间充质干细胞,待细胞融合至80%时胰蛋白酶消化传代.应用具有微孔滤膜的插入式细胞培养皿和培养板构建人脐血间充质干细胞-肝细胞共培养模型,脐血间充质干细胞按1×10~7 L~(-1)密度接种于下层6孔板内,LO2人肝细胞按1×10~5 L~(-1)密度接种到上层插入式培养皿中.以上、下两层均接种人脐血间充质干细胞作为对照组.采用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志,倒置相差显微镜观察共培养后细胞形态变化,RT-PCR法检测肝细胞表面抗原mRNA的表达.结果与结论:贴壁细胞呈长梭形,强表达CD44和CD29,不表达造血细胞表型CD34和CD45.共培养组5 d时长梭形细胞数量减少,随共培养时间的延长,不规则圆形或多角形的细胞逐渐增多,与肝细胞形态相似;对照组培养4周时,人脐血间充质干细胞仍呈形态均一的长梭形.共培养组5 d时甲胎蛋白mRNA呈阳性表达,其余均为阴性;14 d时细胞角蛋白19 mRNA、白蛋白mRNA开始表达,随着时间延长有增强趋势,甲胎蛋白mRNA表达则较前减弱;对照组各抗原的表达均呈阴性.提示与LO2人肝细胞共培养后,人脐血间充质干细胞可诱导分化为类肝细胞.
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肝细胞移植及临床应用进展
国外已报道多例肝细胞体内移植成功治疗肝脏遗传代谢性疾病.1998年美国批准人类肝细胞体内移植,可作为终末期肝病的一项有效的治疗技术.肝细胞体内移植又称为肝细胞种植移植,就是将获得的正常肝脏或手术切下的部分肝组织,进行体外分离纯化,将分离纯化的肝细胞植入体内,恢复或重建肝功能,以暂时支持病人等待肝脏移植,或自行恢复患者的疾病不需进行原位肝移植.
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骨髓间充质干细胞来源类肝细胞的功能和超微结构评估
目的对骨髓间充质干细胞(MMSCs)来源的类肝细胞进行功能和超微结构评估.方法从人胎儿骨髓中分离MMSCs,在1%基质胶(Matrigel)作基质,2.5 μmol/ml氮胞苷(AZA)预处理10～12 h,肝细胞生长因子(HGF)10 ng/ml+成纤维细胞生长因子4(FGF4)10 ng/ml+肝细胞生长培养基(HGM)中培养和诱导.以未诱导的MMSCs作对照,对诱导4 d、7 d、14 d、21 d、28 d MMSCs采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液中人白蛋白(ALB)水平,脲酶法检测合成尿素的能力,过碘酸希夫试验进行糖原染色,电镜观察细胞超微结构.结果在分化过程的不同时相点检测ALB和尿素生成,未诱导分化的MMSCs没有分泌ALB和产生尿素,而给予FGF4和HGF处理后,MMSCs以时间依赖方式产生ALB和尿素.用过碘酸希夫(PAS)染色法分析发现MMSCs诱导14d时首先见到部分细胞出现红紫色染色的糖原积聚物,28 d后阳性染色细胞数量增多,提示诱导后MMSCs已具备肝细胞的糖原合成能力.电镜显示未诱导MMSCs具有幼稚细胞的结构特点.诱导28 d的MM-SCs已分化,并具有上皮样细胞的极性结构特点.结论诱导后MMSCs已具备肝细胞特有的结构和功能性特征.
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脐血间充质干细胞的体外扩增及向类肝细胞分化的实验研究
目的 探讨人脐带血间充质干细胞(UBC-MSCs)向类肝细胞定向分化的可能性.方法 无菌条件下采集新生儿脐带血75份,采用密度梯度离心法与直接贴壁法相结合分离UBC-MSCs,体外培养传代 ,获得第4代集落生长细胞作流式细胞仪表面抗原测定,并应用a-FGF、b-FGF、HGF、OSM等多种成分,分阶段向肝细胞定向诱导分化.倒置相差显微镜观察细胞形态变化,取诱导后4 周和6周的细胞分别采用RT-PCR法检测ALB、AFP和CK-19基因mRNA水平,分析类肝细胞诱导表达情况.结果 按108/ml接种,用含15%FBS的DMEM/F12培养基培养可成功获取UBC-MSCs.细胞呈长梭形,细胞表面抗原测定显示强烈表达CD29、CD44,而不表达造血细胞的标志物CD34、CD45.分阶段诱导6周后,细胞形态呈多角形,并检测到肝细胞表面标志物白蛋白、AFP和CK-19.结论 新生儿脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增,分阶段诱导可分化为类肝细胞.
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通过hiPS细胞诱导生成类肝细胞建立肝毒性检测模型及其初步评价
目的探讨通过人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPS cells)诱导生成类肝细胞,建立肝毒性检测模型并用于中药毒性体外评价的可行性.方法采用细胞因子4步诱导分化方法,通过加入激活素A(Activin A)、骨形态发生蛋白-4(BMP-4)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素M(Oncostatin M)等细胞因子,连续培养23 d,将hiPS细胞诱导分化成类肝细胞.采用细胞免疫荧光法检测hiPS细胞向类肝细胞分化过程不同阶段的特异性标记:叉头框转录因子A2(FOXA2)、 性别决定区Y框蛋白17(SOX17)、 甲胎蛋白(AFP)、 白蛋白(ALB)、 肝细胞色素P4503A4酶(CYP3A4)和α1-抗胰蛋白酶(AAT)等蛋白的表达;采用qPCR法检测类肝细胞特异性基因:甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、细胞角蛋白8(CK8)、 细胞角蛋白18(CK18)和细胞角蛋白19(CK19)的基因表达;采用吲哚青绿(ICG)摄取实验检测类肝细胞排泌功能.采用雷公藤冻干粉(1,2,4,8 mg·mL-1)对类肝细胞进行肝毒性实验,作用24 h后检测谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、 丙二醛(MDA)、 谷胱甘肽(GSH)、 超氧化物歧化酶(SOD)的含量或活性.结果检测到FOXA2、SOX17蛋白在内胚层诱导阶段有表达,AFP、ALB在肝细胞分化与扩增阶段有表达,CYP3A4、AAT在肝细胞成熟阶段有表达;肝细胞特异性基因AFP、CK19、ALB、CK8、CK18在类肝细胞中均有表达,诱导前后比较差异有统计学意义(P<0.05);ICG摄取实验显示类肝细胞具有肝细胞的特异性ICG摄取功能.与对照组比较,雷公藤各剂量组的ALT及AST活性显著升高、MDA浓度显著升高、GSH及SOD活性显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01).结论通过hiPS细胞诱导生成类肝细胞的方法具有可行性,诱导得到的类肝细胞具有人正常肝细胞的功能,可以作为中药肝毒性筛选的模型细胞.
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人胎肝非实质间充质干细胞体外诱导分化为类肝细胞
目的 体外诱导人胎肝非实质间充质干细胞(NPMSCs)分化为类肝细胞,对类肝细胞进行分子生物学及功能鉴定.方法 采用体外细胞培养技术,分离培养人胎肝NPMSCs,在1%基质胶作基质,2.5 mmol/L氮胞苷预处理10～12 h,肝细胞生长因子10 μ g/L加成纤维细胞生长因子4 10μg/L加肝细胞生长培养基中诱导.用显微摄像和四甲基偶氮唑盐研究细胞增殖及生长特征,用流式细胞仪、免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应鉴定细胞表型.采用酶联免疫吸附法检测培养上清液中人Alb水平,过碘酸希夫试验进行糖原染色.结果 从人胎肝获得贴壁细胞种植后生长分裂良好,连续传10代后,每份人胎肝NPMSCs可扩增达109个细胞.NPMSCs表型为CD166阳性,CD34阴性.在添加成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子的基质胶上诱导培养的NPMSCs在21～28 d时,形态由长梭形变为三角形、多角形或类圆形.细胞转圆率为40%,双核细胞比率5%.免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应检测显示未诱导培养的NPMSCs中,有较少的细胞表达甲胎蛋白及其mRNA,未见其他肝脏特有的转录因子或者细胞质蛋白标志.诱导早期可见较多细胞表达GATA4、甲胎蛋白和CK18及其mRNA,至诱导后期表达下降,而Alb、CK18、谷胱甘肽S转移酶π和肝细胞核因子1 α表达逐渐上升.Alb、CK1 8阳性细胞比例达60%.未诱导分化的NPMSCs不分泌Alb,诱导分化的NPMSCs以时间依赖方式产生Alb.NPMSCs诱导14 d时首先见到部分细胞出现红紫色染色的糖原积聚物,28 d后阳性染色细胞数量增多.结论 在本实验诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞.诱导后NPMSCs已具备肝细胞特有的功能性特征.
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CYP2C9基因多态性与合理用药研究
细胞色素P4502C9(Cytochrome P4502C9,CYP2C9)基因编码蛋白在人类肝细胞微粒体中含量丰富,约占CYP总量的20%,仅次于CYP3A.CYP2C9能代谢许多不同性质的药物,并在前致癌物、前毒物和致突变剂的活化中也起到一定作用.1993年,国外从一个S-美芬妥英强代谢个体中分离出CYP2C9基因并发现CYP2C9基因含有9个外显子和8个内含子,全长约为55kb[1].其中,CYP2C9有多于50种单核苷酸多态性,主要的有3种,即野生型CYP2C9*1、突变体CYP2C9*2和突变体CYP2C9*3.
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人胎儿骨髓间充质干细胞体外分离培养及诱导分化为类肝细胞
目的 建立人胎儿骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MMSCs)的体外分离、培养方法,体外诱导分化MMSCs为类肝细胞,观察MMSCs细胞生物学特性,并对类肝细胞进行分子生物学及功能鉴定.方法 采用体外细胞培养技术,分离培养人胎儿MMSCs,在1%Matrigel做基质,2.5μmol/ml AZA预处理10～12h,HGF 10ng/ml+FGF4 10ng/ml+HGM培养基中诱导.用显微摄像和MTT研究细胞增殖及生长特征,用流式细胞仪、免疫组织化学和RT-PCR鉴定细胞表型.采用ELISA法检测培养上清中人清蛋白水平.结果 24h换液后可获得约(300±80)个贴壁细胞;培养细胞在种植后1～3d为生长滞留期,第4天达到对数生长期,以后进入到平台期,细胞分裂指数曲线的趋势与生长曲线类似.连续传10代后,每个胎儿来源的MMSCs可扩增达1011～1012个细胞.MMSCs表型为CD166阳性,CD34阴性.在添加FGF4和HGF的Matrigel上诱导培养的MMSCs在21～28d时,细胞形态由长梭形变为三角形、多角形或类圆形.细胞转圆率为40%～50%,双核细胞比率5%～7%.免疫组化和RT-PCR检测显示未诱导培养的MMSCs中,有较少的细胞表达AFP及其mRNA,未见其他肝脏特有的转录因子或者胞浆蛋白标志.诱导早期可见较多细胞表达GATA4、AFP和CK19及其mRNA,至诱导后期表达下降,而ALB、CK18、GST-π和肝细胞转录因子HNF-1α表达逐渐上升.ALB、CK18阳性细胞比例达61%～65%.未诱导分化的MMSCs没有分泌ALB,诱导分化的MMSCs以时间依赖方式产生清蛋白.结论 人胎儿MMSCs分离成分单纯,增生旺盛.诱导培养可获得高比例的类肝细胞.MMSCs向类肝细胞的横向分化是先分化为肝前体细胞,再分化为成熟肝细胞,在本实验诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞.诱导后MMSCs已具备肝细胞特有的功能性特征.
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脐带血单个核细胞体外培养分化为肝细胞的实验观察
目的 探讨脐带血单个核细胞在体外定向分化为肝细胞的条件及能力,为建立脐血干细胞移植治疗慢性肝衰竭提供实验依据.方法 采集脐带血分离单个核细胞后,在实验组加入成纤维细胞生长因子(FGF)及促肝细胞生长因子(HGF)、或FGF加胎肝上清液培养,对照组只加FGF培养,观察细胞生长分化状况,免疫组化检测两组人甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(Alb).结果 实验组可见类圆形及多边形细胞,呈类肝细胞形态,对照组大多为梭形细胞,未见多边形细胞;实验组细胞AFP、Alb免疫组化染色为阳性,对照组未见AFP,Alb阳性细胞.HGF的诱导分化效果优于胎肝上清液.结论 脐带血单个细胞在HGF或胎肝上清液的诱导下可以定向分化为能分泌Alb及AFP的类肝细胞.
