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人诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理鉴定
本文旨在研究人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs)的电生理特性.采用时序性短暂激活/短暂抑制Wnt信号通路的方法将未分化的IMR90-4细胞系定向诱导分化为心肌细胞.用免疫荧光染色法和流式细胞术检测心肌肌钙蛋白T (cardiac troponin T,cTnT)蛋白表达,计算hiPSC-CMs的分化率.用膜片钳技术记录hiPSC-CMs的动作电位,根据动作电位的表现对心肌细胞进行分类,并进一步分析电生理特征.结果显示,hiPSC-CMs的纯度大于95％.根据动作电位的表现,hiPSC-CMs可分为心房肌样细胞、心室肌样细胞和窦房结样细胞.其中,心室肌样细胞的动作电位时程(action potential duration,APD)、动作电位幅度(action potential amplitude,APA)和大去极化速率(dV/dtmx)均大于心房肌样细胞和窦房结样细胞,窦房结样细胞的dV/dtmax低于心室肌样细胞和心房肌样细胞.以上结果表明hiPSC-CMs纯度高,并且分化出的三种不同类型的心肌细胞具有和成熟心肌细胞相似的动作电位特征.
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人诱导多能干细胞自然分化过程中EMT变化研究
目的：研究人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)自然分化过程中上皮-间质转化(epithelial-mes-enchymal transition，EMT)的变化过程。方法按常规方法iPS细胞接种于单层饲养层细胞上培养并传代，通过EB的方式令iPS细胞自然分化，收集未分化的iPS细胞以及分化7d、14d、21d和28d的细胞，采用RT-PCR和Western Blot方法检测EMT相关基因及蛋白的表达水平。结果 RT-PCR和Western Blot结果表明，未分化人iPS细胞可见E-cadherin基因和蛋白的表达，分化后E-cadherin的表达明显减少，而N-cadherin基因和蛋白在细胞未分化时均未见表达，发生分化后表达明显上调；在人iPS细胞分化过程中，Snail和Slug转录因子以及蛋白都明显发生上调。结论人iPS细胞自然分化与EMT，即E-cadherin和N-cadherin转化有关。
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特异性诱导人诱导多能干细胞向滋养层细胞分化
目的:通过反转录病毒转染技术成功建立了人诱导分化多能干细胞系(induced pluripotency stem cell, iPSC),并诱导它们向滋养层细胞定向分化,为研究人早期滋养层细胞的发育建立一种新的模型.方法:采用反转录病毒将八聚体结合转录因子-4(octamer-binding transcription factor-4, OCT4)、性别决定Y区域转录因子2 [sex determining region Y (SRY)-box 2, SOX2]、原癌基因c-Myc和Kruppel 样因子4(Kruppel-like factor 4, KLF4) 转染到人肺部成纤维细胞中,经过筛选得到重编程后的人iPSC,然后用骨成型蛋白4(bone morphogenetic protein 4, BMP4)将其诱导成为滋养层细胞.结果:通过该病毒转染体系成功获得iPSC,具有与人胚干细胞(human embryonic stem cell, hESC)相似的形态学及多向分化潜能,并成功将其诱导分化成为滋养层细胞.结论:通过重编程技术成功建立人iPSC细胞系,并具备与hESC相似的干细胞特性,为进一步研究胚胎早期滋养层细胞发育以及滋养层细胞恶性肿瘤的发生机制提供了一个新的平台.
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特异性诱导人诱导多能干细胞向神经上皮细胞分化
目的:通过慢病毒转染技术成功建立了人诱导分化多能干细胞系(induced pluripotent stem cell, iPSC)并诱导它们向神经上皮细胞 (neuroepithelial cells, NECs)定向分化,为研究人胚胎早期神经发育建立一种新的模型,并有望为临床神经系统病变的治疗提供一种新的移植选择.方法:采用慢病毒将转录因子八聚体结合转录因子-4(octamer-binding transcription factor-4, OCT4)、性别决定Y区域转录因子2 [sex determining region Y (SRY)-box 2, SOX2]、Nanog 同源盒(Nanog homebox, NANOG)、Lin-28 同源因子(Lin-28 homolog, LIN28)、原癌基因c-Myc和Kruppel 样因子4(Kruppel-like factor 4,KLF4)导入到人胎肺成纤维细胞中,经过筛选得到重编程后的人iPSC,并在体外通过加入数种生长因子将其诱导成为NECs.结果:成功获得与成纤维细胞相同遗传背景的iPSC,具有与人胚干细胞(human embryonic stem cell, hESC)相似的形态学及多向分化潜能,且能在体外被诱导分化成为NECs,分化效率与hESC相似.结论:通过重编程技术成功建立人iPSC并将其定向诱导分化为NECs,为iPSC在神经系统疾病特别是遗传性或退行性神经病变的治疗和机制研究中的应用推广奠定了实验基础.
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单层分化法结合Smad信号双抑制剂诱导hiPSCs分化为运动神经元
目的 探讨单层细胞分化法结合Smad信号双抑制剂,诱导人诱导多能干细胞(hiPSCs)分化为神经干细胞,并进一步分化为运动神经元的可行性.方法 无血清E8培养基培养hiPSCs,当其接近70％融合度时改用神经诱导培养基,并加入SB431542和DMH1.9d后将贴壁细胞消化,在含bFGF和EGF的培养基中悬浮培养,免疫荧光检测神经干细胞标记物的表达.在神经干细胞培养液中添加视黄酸(RA)和音猬因子(SHH),免疫荧光检测各分化阶段运动神经元相关标记物的表达.结果 经9d神经诱导,hiPSCs分化为表达Nestin、Sox1和Sox2的神经干细胞.神经干细胞在RA和SHH等的作用下进一步分化为运动神经元,免疫荧光检出各不同阶段标志物的表达.结论 单层分化法结合Smad信号双抑制剂,可将hiPSCs诱导为神经干细胞,并在RA和SHH等作用下进一步分化为运动神经元.
关键词： 人诱导多能干细胞 单层分化法 神经干细胞 运动神经元 Smad信号双抑制剂 -
通过hiPS细胞诱导生成类肝细胞建立肝毒性检测模型及其初步评价
目的探讨通过人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPS cells)诱导生成类肝细胞,建立肝毒性检测模型并用于中药毒性体外评价的可行性.方法采用细胞因子4步诱导分化方法,通过加入激活素A(Activin A)、骨形态发生蛋白-4(BMP-4)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素M(Oncostatin M)等细胞因子,连续培养23 d,将hiPS细胞诱导分化成类肝细胞.采用细胞免疫荧光法检测hiPS细胞向类肝细胞分化过程不同阶段的特异性标记:叉头框转录因子A2(FOXA2)、 性别决定区Y框蛋白17(SOX17)、 甲胎蛋白(AFP)、 白蛋白(ALB)、 肝细胞色素P4503A4酶(CYP3A4)和α1-抗胰蛋白酶(AAT)等蛋白的表达;采用qPCR法检测类肝细胞特异性基因:甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、细胞角蛋白8(CK8)、 细胞角蛋白18(CK18)和细胞角蛋白19(CK19)的基因表达;采用吲哚青绿(ICG)摄取实验检测类肝细胞排泌功能.采用雷公藤冻干粉(1,2,4,8 mg·mL-1)对类肝细胞进行肝毒性实验,作用24 h后检测谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、 丙二醛(MDA)、 谷胱甘肽(GSH)、 超氧化物歧化酶(SOD)的含量或活性.结果检测到FOXA2、SOX17蛋白在内胚层诱导阶段有表达,AFP、ALB在肝细胞分化与扩增阶段有表达,CYP3A4、AAT在肝细胞成熟阶段有表达;肝细胞特异性基因AFP、CK19、ALB、CK8、CK18在类肝细胞中均有表达,诱导前后比较差异有统计学意义(P<0.05);ICG摄取实验显示类肝细胞具有肝细胞的特异性ICG摄取功能.与对照组比较,雷公藤各剂量组的ALT及AST活性显著升高、MDA浓度显著升高、GSH及SOD活性显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01).结论通过hiPS细胞诱导生成类肝细胞的方法具有可行性,诱导得到的类肝细胞具有人正常肝细胞的功能,可以作为中药肝毒性筛选的模型细胞.
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人诱导多能干细胞向外周神经元分化的实验研究
[目的]探讨人诱导多能干细胞(hiPS细胞)在体外向外周神经元分化的能力.[方法]人诱导多能干细胞在无饲养层培养条件下维持培养,然后在神经培养基中悬浮培养分化为神经球,通过把神经球贴壁在多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的培养板上,利用流式分选细胞方法获得神经嵴干细胞(NCSC),通过把神经嵴干细胞在外周神经诱导培养基中诱导分化,获得外周神经元,利用免疫荧光染色的方法检测神经嵴干细胞和外周神经元的标记物.[结果]贴壁的神经球出现特征性的神经花环(Neural rosettes)结构,神经嵴干细胞从神经花环发生迁移;神经嵴干细胞向外周神经元诱导后出现神经丝结构,并表达外周神经元特异性标记物.[结论]人诱导多能干细胞在体外能高效向外周神经元分化.
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人诱导多能干细胞体外扩增生成红系集落并构建红系祖细胞株的研究
目的 将人诱导多能干细胞(hiPSCs)分化成为红系祖细胞并构建稳定的红系祖细胞株.方法 采用与滋养层细胞共培养的方式,添加10 ng/mL的TPO、5 U/mL的EPO、25 ng/mL的SCF、5 ng/mL的Flt-3、20 ng/mL的IL-3的诱导因子,诱导hiPSCs分化成为红系集落,构建稳定的红系祖细胞株;倒置显微镜观察获得的细胞株形态,瑞氏染色并计数,MTT法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞表面标志物.结果 hiPSCs诱导构建的红系祖细胞株遗传性状稳定并可长期传代,细胞呈集落样生长,外观上与正常红系祖细胞无差异.分类计数构建的红系祖细胞株比例(％):P0与P5代细胞为84.90±4.93 vs 72.20±6.24(P ＜0.05);流式检测,hiPSCs诱导构建的红系祖细胞株细胞表面标志物CD235a阳性率(％)表达:P0与P5代细胞为3.02±0.75 vs 5.87±0.37(P＜0.05).结论 诱导hiPSCs生成的红系祖细胞株在表面标志继承性和遗传性状方面都是稳定的.
