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苦参碱抑制神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖作用研究
目的:观察苦参碱对入神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖的影响,并探讨其作用机制.方法:取对数生长期SK-N-SH细胞,用磺酰罗丹明B(SRB)法检测苦参碱(0.5,1.0,2.0 g·L-1)作用24,48,72 h后SK-N-SH细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期,Western blot检测半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-9和Caspase-3蛋白的表达.结果:苦参碱对SK-N-SH细胞增殖具有明显抑制作用,且表现出剂量和时间依赖性.0.5,1.0,2.0 g·L-1苦参碱作用24,48,72 h后SK-N-SH细胞的抑制率分别为(19.06±3.17)％,(30.18±3.02)％,(38.55±6.12)％;(45.12±4.02)％,(60.45 ±5.51)％,(71.38±7.91)％;(58.91±4.36)％,(73.44±8.17)％,(88.37±4.57)％.流式细胞仪检测对照组及各浓度组凋亡率分别为(2.45±0.49)％,(12.56±2.21)％,(19.44±4.32)％,(30.12±3.35)％,与对照组比较,苦参碱组的凋亡率均显著性增高(P＜0.001);细胞周期结果显示苦参碱作用SK-N-SH细胞48 h后G0/G1期细胞明显增多(P＜0.01),S期细胞明显减少(P＜0.01).苦参碱可显著上调Caspase-9和Caspase-3蛋白表达(P＜0.01,P＜0.01).结论:苦参碱对神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的增殖具有抑制作用,这种作用与其阻滞细胞周期和激活Caspase-9和Caspase-3表达进而诱导产生细胞凋亡有关.
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成年人神经母细胞瘤骨髓转移一例
神经母细胞瘤是常见于儿童时期的恶性肿瘤,成年人尤其中老年人罕见,国内外鲜有报道,近本院通过骨髓细胞学分析确诊了1例成人神经母细胞瘤,现报告如下.
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回转器模拟微重力对神经细胞自噬的影响
目的 探讨回转模拟微重力对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)自噬的影响.方法 利用回转模拟微重力的细胞学效应,回转条件下培养细胞12 h、24 h,相同条件下静置培养细胞作为对照.Western Blot方法检测LC3蛋白表达变化水平.荧光显微镜观察GFP-LC3点状聚集物,计数含有大于5个GFP-LC3点状聚集物的细胞数量.结果 回转组SH-SY5Y细胞LC3-Ⅱ蛋白表达高于对照组,荧光显微镜检测到GFP-LC3点状聚集物也随之增多.结论 回转可以引起SH-SY5Y细胞自噬增多.
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五味子酚对H2O2诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用
目的 探讨五味子酚(schisanhenol,Sal)对H2 O2诱导人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞的保护作用及可能机制.方法 SH-SYSY细胞给予Sal(1,10和50 μmol·L-1)处理4h后给予H2O2 100 μmol·L-1处理24h,利用MTT法测定Sal对H2O2损伤的SH-SY5Y细胞存活率的影响,Western blot检测Sal对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞中沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)、PGC-1α、p-tau(S396)蛋白的表达.结果 Sal可明显提高H2O2损伤的SH-SY5Y细胞的生存率,Western blot检测结果显示,H2O2处理后p-tau(S396)位点tau蛋白含量增加,SIRT1和PGC-1α的表达下降.Sal能够增加SIRT1和PGC-1α的表达,降低p-tau含量.结论 Sal对H2O2损伤的SH-SY5Y细胞具有一定保护作用,并可能通过上调SIRT1蛋白的表达、降低tau蛋白的磷酸化发挥神经保护作用.
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二(噁)英对星形胶质细胞和神经母细胞瘤细胞线粒体的影响
目的 探讨2,3,7,8-四氯二苯并二(噁)英(TCDD)的神经毒性.方法 选择人星形胶质细胞和人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),4个染毒组和对照组分别暴露于1、10、50、100 nmol/L TCDD和二甲基亚砜(DMSO)24 h.用透射电镜观察细胞线粒体超微结构,用RT-PCR检测细胞的线粒体相关基因mRNA表达水平.结果 透射电镜观察到TCDD染毒组细胞线粒体嵴数目减少,出现空泡化.RT-PCR结果显示,与对照组相比,染毒组两种细胞HSPD1、MFN1、MFN2、SLC25A10mRNA的表达水平下降,TSPO和SLC25A 27 mRNA的表达水平升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 TCDD对星形胶质细胞和SH-SY5Y细胞具有损伤作用,可以影响神经细胞线粒体的正常形态、正常转运功能和动力学过程.
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2’-溴-2-羟基-4，6，4’，5’-四甲氧基查尔酮抑制SK-N-SH细胞增殖的作用研究
目的：研究2’-溴-2-羟基-4，6，4’，5’-四甲氧基查尔酮（2’-bro-2-hydroxy-4，6，4’，5’-tetrametho-xychalcone，C30）的抗人神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH）作用及其机制，为查尔酮类新型化合物开发用于神经母细胞瘤的预防和治疗提供初步的实验依据。方法：磺酰罗丹明B（sulforhodamine B，SRB）法检测药物作用肿瘤细胞后的细胞活性；流式细胞术检测细胞周期和凋亡；Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡。结果：C30在1.5625~25.0000μmol·L-1的浓度范围内对SK-N-SH细胞有较强的抑制作用，抑制效应在此范围内呈剂量和时间依赖性。且C30使SK-N-SH细胞的周期阻滞于G1期，并可以诱导SK-N-SH细胞发生凋亡。结论：查尔酮类新型化合物C30能抑制SK-N-SH细胞增殖，作用机制可能与其改变SK-N-SH细胞周期分布和诱导细胞凋亡相关。
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新型ALK和c-Met激酶抑制剂的合成及抗肿瘤活性
目的 设计合成一系列新型ALK和c-Met激酶抑制剂,并测定其抗肿瘤细胞增殖活性.方法 以上市的ALK和c-Met激酶抑制剂克里唑替尼(crizotinib)为先导化合物,设计并合成了含1,2,3-三氮唑的吡嗪类化合物.采用Alarm Blue方法测试了目标化合物对人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)以及人胃癌细胞(SNU-5)的抗增殖活性.结果与结论 合成了8个未见文献报道的新化合物,其结构经1H-NMR、13 C-NMR、MS谱确证.初步体外活性评价结果表明,目标化合物对人神经母细胞瘤、人胃癌细胞均具有抑制活性,其中化合物7a对SH-SY5Y抑制活性高,与阳性对照药克里唑替尼相当;化合物7a～ 7e对SNU-5的抑制活性略低于阳性对照药,但其IC50值比较理想,此系列化合物可能具有潜在的抗肿瘤活性.
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微波辐射诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的可能机制
目的:观察微波辐射对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的影响,并探讨其机制.方法:采用10、30和50 mW·cm-2辐射强度的微波辐射SH-SY5Y细胞5 min,以假辐射组(0 mW·cm-2)为对照,光镜下观察细胞形态变化;荧光显微镜下观察DAPI染色细胞核的形态;CTAB法提取细胞基因组DNA,电泳观察DNA ladder;台盼蓝拒染法检测细胞存活率;AnnexinV-FITC和PI双染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率;MTT法检测细胞相对活性;蛋白质印迹检测细胞凋亡相关蛋白的表达.结果:微波辐射后SH-SY5Y细胞形态即刻改变,胞核、胞质结构欠清,细胞皱缩甚至脱壁;细胞核内的染色质出现不规则凝集,碎裂成2～5个微核;细胞DNA出现明显的梯状条带;细胞存活率随微波辐射强度增大逐渐降低,10 mW·cm-2辐射组与假辐射组比较,细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05),但30、50 mW·cm-2辐射组细胞存活率明显低于假辐射组(P<0.05);微波辐射后6 h的细胞凋亡率随辐射强度的增加逐渐升高,各辐射组细胞凋亡率均明显高于假辐射组(P<0.05);微波辐射后24和48 h,细胞相对活力随辐射强度的增加明显降低,各辐射组的细胞相对活力均明显低于假辐射组(P<0.05).微波辐射后,细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、survivin表达水平逐渐下降,Bax、caspase-3 和caspase-7表达水平逐渐升高,caspase-8和-9表达水平无明显变化.结论:微波辐射可诱导SH-SY5Y细胞凋亡,其作用机制可能与survivin、Bcl-2蛋白表达水平下调、Bax蛋白表达水平上调及caspase-3和caspase-7的作用有关,而与caspase-8和caspase-9介导的caspase-3活化这一作用无密切关系.
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miR-138-5p在锰致SH-SY5Y细胞自噬中的作用
[目的]探讨miR-138-5p在氯化锰(MnCl2)诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬中的作用及其机制.[方法]以生理盐水处理组作为对照,0.125、0.25、0.5、1 mmol/L MnCl2染毒SH-SY5Y细胞6h后,利用MTT法检测细胞活力;0.25和0.5 mmol/LMnCl2处理细胞6h后,采用Western blot检测自噬相关蛋白LC3和Beclin1的表达;MnCl2染毒6h后,使用反转录PCR和Western blot检测miR-138-5p和组蛋白脱乙酰酶SIRT1 mRNA以及蛋白表达的变化;使用miRNA模拟物转染细胞实现miR-138-5p过表达,然后0.25 mmol/L MnCl2染毒6h,检测SIRT1 mRNA和蛋白的表达以及自噬相关蛋白LC3和Beclin1的变化.[结果] MnCl2可剂量依赖性地降低SH-SY5Y细胞活力(趋势x2=12.42,P＜0.05).与对照组相比,0.25、0.5 mmol/LMnCl2染毒后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值和Beclin1表达水平明显增加(P＜0.05);miR-138-5p表达下调,SIRT1 mRNA及蛋白表达上调(均P＜0.05).miR-138-5p过表达后,相比未过表达的MnCl2染毒组,SIRT1 mRNA及蛋白表达均出现下调,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值及Beclin1蛋白表达也相应下调(P＜0.05).[结论] miR-138-5p过表达可通过调节SIRT1的表达抑制锰诱导的SH-SY5Y细胞自噬.
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曲古抑菌素A对恶性黑素瘤的抗癌作用
组蛋白乙酰化和去乙酰化在基因的转录调控中发挥着重要作用,组蛋白乙酰化水平由组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的动态平衡调节.HAT和HDAC的异常与肿瘤的发生有着密切的关系[1].近年来大量研究表明,组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)可抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞分化和凋亡,并可发挥免疫调节作用,是新一代具有广泛应用前景的抗肿瘤药[2].曲古抑菌素A源自链霉菌代谢产物,先作为抗真菌药物使用,近来研究表明其具有明显的组蛋白去乙酰化酶抑制剂活性,对肝癌、胃癌、口腔癌及人神经母细胞瘤等肿瘤细胞具有明显的细胞毒作用[3].本实验主要研究曲古抑菌素A对恶性黑素瘤细胞A375的细胞毒作用并对比研究曲古抑菌素A对A375和正常黑素细胞的细胞毒性.
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葛根素保护双氧水诱导的SH-SY5Y细胞凋亡
目的 探讨葛根素对双氧水(H2O2)诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用及其机制.方法 建立体外神经元损伤模型,MTT法观察细胞存活率;Hoechst 33342染色观察细胞核改变;JC-1染色检测细胞线粒体膜电位的改变;酶活性检测线粒体caspase-3和caspase-9的变化;Western blot检测细胞中Bcl-2、Bax、p-Akt、Akt蛋白的表达.结果 与 H2O2模型组相比,葛根素预处理能明显改善 H2O2诱导的 SH-SY5Y细胞存活率下降(P<0.05),缓解H2O2引起的线粒体膜电位的下降(P<0.01),抑制caspase-3和caspase-9的酶活性(P<0.01),减少H2O2诱导的细胞凋亡.此外,葛根素还促进细胞内p-Akt、Bcl-2蛋白表达,抑制Bax蛋白表达,而这种作用能被PI3K/Akt的抑制剂LY294002所抑制.结论葛根素可保护H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,这种保护作用可能是通过激活PI3K/Akt信号通路实现的.
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Bcl-2反义核酸对SK-N-SH细胞增殖和凋亡的影响
目的 研究Bcl-2反义核酸对人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH的增殖和凋亡的作用.方法 设Bcl-2反义核酸ASODN组、正义核酸SODN组、脂质体组及空白对照组.MTT法检测Bcl-2反义核酸对SK-N-SH细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡情况.结果 ASODN组72 h细胞增殖抑制率达(68.24±2.41)%,较空白对照组差异显著(P<0.01);ASODN可使SK-N-SH细胞周期阻滞于G2/M期,72 h细胞凋亡率达(23.25±2.34)%.结论 Bcl-2反义核酸可抑制SK-N-SH细胞增殖并诱导其发生凋亡.
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P2X7受体阻断剂对三磷腺苷诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞内Ca2+水平的影响
目的 观察三磷腺苷(ATP)诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞内Ca2+水平变化的特点,并探讨P2X7受体阻断剂对其的影响.方法 取对数生长期的SH-SY5Y细胞接种于含体积分数10％胎牛血清高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中,在37℃、体积分数5％ CO2培养箱中培养24 h,随机分为4组,分别加入含0、1、3、5 mmol·L-1ATP的培养液,每孔100 μL,各组均分别作用15、30、60 min,然后用Hank's溶液洗涤细胞3次,Fluo-3/AM染细胞内Ca2+,Hoechst 33258染细胞核.荧光显微镜下观察细胞内荧光发射强度.另取对数生长期的SH-SY5Y细胞悬液接种于含体积分数10％胎牛血清高糖DMEM的96孔板中,在37℃、体积分数5％ CO2培养箱中培养24h,随机分为正常对照组、ATP组及KN-62低、中、高剂量组,正常对照组细胞在每孔100 μL培养液中常规培养,ATP组细胞在每孔100 μL含5 mmol·L-1 ATP的培养液中培养,KN-62低、中、高剂量组细胞分别每孔先用100 μL含100、500、1 000 nmol·L-1 KN-62的培养液孵育30 min,每孔再用100 μL的5mmol·L-1 ATP培养液处理1h,用Hank's溶液洗涤细胞3次,Fluro-3/AM染色细胞内Ca2,Hoechst 33258染色细胞核.荧光显微镜下观察细胞内荧光发射强度变化,图像分析软件记录结果,测每组细胞中Ca2+的平均荧光强度.每次实验每组设3个平行复孔,实验重复3次.结果 0 mmol·L-ATP组呈现荧光的细胞数量少,荧光强度弱;1、3、5 mmol·L-1 ATP组随着ATP剂量增加,呈现荧光的细胞数量逐渐增多,荧光强度逐渐增强;若ATP剂量相同,则随着ATP作用时间的延长,呈现荧光的细胞数量逐渐增多,荧光强度逐渐增强.正常对照组、ATP组、KN-62低、中、高剂量组细胞荧光强度分别为468.24±45.67、3 292.35±159.64、3 013.27 ±321.42、2 515.77 ±320.98、2 486.32 ±318.31,ATP组细胞平均荧光强度显著强于正常对照组(P＜0.05);KN-62低、中、高剂量组细胞平均荧光强度均低于ATP组(P＜0.05).结论 ATP诱导SH-SY5Y细胞内Ca2+升高具有浓度和时间依赖性,KN-62可部分阻断ATP的这一作用.
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神经母细胞瘤裸鼠移植瘤模型的建立及相关应用研究进展
自1969年Rygarrd和Povlsen(Concer Res, 1975)首次将人结肠癌成功移植于裸鼠,建立裸鼠移植瘤模型以后.人们已将这一方法应用于许多肿瘤的研究,神经母细胞瘤也不例外.1975年Lawrence Helson第一次成功的将人神经母细胞瘤SK-N-SH、SK-N-MC细胞移植于裸鼠皮下建立起移植瘤模型.
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人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞Ca2+通道的电生理特性
目的研究人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞L型Ca2+通道的特性及其激动剂BayK 8644对通道的影响.方法培养SK-N-SH细胞,用膜片钳细胞贴附式技术记录和研究L型Ca2+通道的特性.结果SK-N-SH细胞L型Ca2+通道电导为(27.8±2.56)pS,平均开放时间为(0.65±0.08)ms,平均关闭时间的短关闭时间常数(0.53±0.05)ms,长关闭时间常数(6.02±3.46)ms.Bay K 8644使Ca2+通道平均开放时间延长(P＜0.05),但不影响其电导(P＞0.05).结论人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞上存在L型Ca2+通道,与其他神经元上L型Ca2+通道特性相近.
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华蟾素对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的影响
目的 观察华蟾素对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法 采用巯基罗丹明B(SRB)法检测华蟾素对SH-SY5Y细胞的抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率,荧光探针二乙酸二氯荧光素盐(DCFH-DA)法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;罗丹明123(Rhodamine 123)染色法检测细胞线粒体膜电位;Western blot检测胞质细胞色素C(Cyt-C)的表达;ELISA检测Caspase-3和Caspase-9酶活性.结果 华蟾素对SH-SY5Y细胞增殖具有明显抑制作用,且表现出剂量和时间依赖性.流式细胞术检测对照组及各浓度组凋亡率分别为(3.12±0.91)％、(17.65±4.28)％、(29.14±6.72)％、(50.01±9.26)％,与对照组比较,华蟾素组的凋亡率均显著性增高(P＜0.01);华蟾素能够呈浓度依赖的增加细胞内ROS水平(P＜0.01),降低线粒体膜电位(P＜0.01),增加胞质中Cyt-C的表达(P＜0.01),同时增加Caspase-3和Caspase-9酶活性.结论 华蟾素能够通过诱导SH-SY5Y细胞产生凋亡而发挥增殖抑制作用,其作用机制可能与激发线粒体凋亡途径有关.
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Beta-淀粉样蛋白对体外培养人神经母细胞瘤细胞的毒性作用
目的 观察Beta-淀粉样蛋白(beta-amyloid,Aβ)对体外培养人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的毒性作用.方法 将体外培养的人神经母细胞瘤细胞,分为BSA对照组(0.5 mg/mL)、Aβ组(Aβ1-42寡聚体,50 μg/mL)和Aβ+p75-FC组(50μg/mL Aβ1-42+100 μg/mL p75-FC,p75-FC为p75NTR胞外段与人IgG FC段的融合蛋白,能够竞争性阻断p75NTR),分别干预72 h,采用结晶紫染色法观测SH-SY5Y细胞轴突的生长长度,采用MTT法检测SH-SY5Y细胞存活率.结果 干预结束后,Aβ组SH-SY5Y细胞轴突长度(42.83±14.98) μm明显短于BSA对照组[(69.76±19.24) μm,P=0.003];在同时给予p75-FC干预后,其轴突长度(65.37±17.52) μμm与BSA对照组轴突长度比较差异无统计学意义(P =0.600).Aβ组SH-SY5Y细胞D(490)值(0.203±0.068)明显低于BSA对照组(0.428±0.094,P=0.002);在同时给予p75-FC干预后,其D(490)值(0.447 ±0.103)与BSA对照组比较差异无统计学意义(P=0.768).结论 Aβ对人神经母细胞瘤细胞具有毒性作用,且通过p75NTR介导实现.
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缺氧调节基因/产物参与CoCl2预处理对分化SH-SY5Y细胞缺氧损伤的保护
目的 探讨缺氧调节基因/产物在CoCl2化学缺氧预处理抵抗神经型细胞缺氧损伤中的作用.方法 分化的SH-SY5Y细胞分为对照组、化学缺氧预处理组(细胞先用50 μmol/LCoCl2预处理3 h,换液后常氧培养1 h,然后在2%的低氧孵箱内缺氧28 h)、缺氧组(2%的低氧孵箱内缺氧28 h).RT-PCR测VEGF、GLUT-1、EPO、LDH-A的mRNA表达.通过应用重组人VEGF纯品,进一步确定VEGF在化学缺氧预处理组中的保护作用.结果 化学缺氧预处理组细胞GLUT-1、EPO mRNA表达显著高于缺氧组(P＜0.05),VEGF mRNA表达显著高于缺氧组(P＜0.01),LDH-A mRNA表达在两组之间没有显著性差异(P＞0.05).MTT细胞活力测定显示,重组人VEGF可模拟预处理组的保护作用.结论 CoCl2化学缺氧预处理很可能通过促进VEGF、GLUT-1、EPO等缺氧调节基因/产物表达,发挥其神经保护作用.
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氯化钴预处理在培养分化的人神经母细胞瘤细胞株缺氧损伤中的保护作用
目的 探讨氧化钴(CoCl2)对体外培养分化的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株的缺氧损伤保护作用及缺氧诱导因子1、2和其调节基因产物血管内皮生长因子在其中的作用.方法 分化的SH-SY5Y细胞分为对照组、化学缺氧预处理组(细胞用50 μmol/L CoCl2预处理3 h,换液后常氧培养1 h,然后在2%的低氧孵箱内缺氧28 h)、缺氧组(无CoCl2预处理过程,其余同化学缺氧预处理组).用Western blotting法测细胞HIF-1α、HIF-2α和VEGF的蛋白表达,通过乳酸脱氢酶释放率测定、MTT细胞活力测定判断细胞损伤程度.结果 化学缺氧预处理组细胞 HIF-2α和VEGF的蛋白表达显著高于缺氧组(P＜0.01),HIF-1α蛋白表达在两组之间没有显著性差异(P＞0.05),化学缺氧预处理组细胞较缺氧组细胞存活率高、乳酸脱氢酶释放率减少(P＜0.01).结论 CoCl2化学预缺氧可保护分化的SH-SY5Y细胞对缺氧产生耐受,缺氧预处理可能通过HIF-2促进VEGF的表达而产生保护作用.
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神经细胞化学缺氧预处理模型的建立
目的 建立体外培养神经细胞的化学缺氧预处理实验模型.方法 分化的SH-SY5Y细胞分为对照组、化学缺氧组、化学缺氧预处理组.用MTT法筛选合适的化学缺氧预处理和化学缺氧浓度.然后,分化的SH-SY5Y细胞随机分为对照组、化学缺氧组(250 μmol/L CoCl2,24 h)、化学缺氧预处理组(75 μmol/L CoCl2,1.5 h,常氧3 h后,250 μmol/L CoCl2,24 h).实验终点测乳酸脱氢酶释放率,并用MTT法检测细胞活力,以此来评价化学预缺氧对神经细胞化学缺氧的保护作用.结果 化学缺氧预处理组细胞较化学缺氧组细胞存活率高、乳酸脱氢酶释放率减少,说明用CoCl2化学预缺氧可保护神经细胞对化学缺氧产生耐受.结论 建立了简单易行、重复性好,可进一步应用于阐明缺氧预处理保护机制的神经细胞化学缺氧预处理实验模型.
