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小鼠卵母细胞减数分裂过程中活化Pak1的表达及其与染色体分离的相关性
目的：研究活化的Pak1在小鼠卵母细胞减数分裂进程中的表达、亚细胞定位及其与染色体分离的相关性。方法用Western blot 方法半定量分析活化的Pak1（Ser204位点磷酸化，pPak1Ser204）在小鼠卵母细胞减数分裂各个时期的蛋白表达量；用免疫荧光染色法分析减数分裂进程中pPak1 Ser204的亚细胞定位模式及其与纺锤体和微管组织中心（MTOC）的时空相关性。结果 pPak1Ser204在小鼠卵母细胞减数分裂重启时（GVBD）开始表达，其表达量随减数分裂进程逐渐升高，在第一次减数分裂中期（MⅠ）时达到峰值并持续保持至第二次减数分裂中期（MⅡ）。在第一次减数分裂前中期（pro-MⅠ）、MⅠ和MⅡ期，pPak1Ser204与MTOC核心蛋白pericentrin和γ-tubulin共同定位于纺锤体两极，pPak1Ser204同时存在于染色体上；在第一次减数分裂后期（AI）到末期（Tel I）进程中pPak1Ser204离开MTOC和染色体，聚集在收缩环部位。结论 pPak1Ser204在卵母细胞减数分裂恢复时开始表达，是一种MTOC相关蛋白，可能通过参与纺锤体结构的形成和维持而调控染色体的分离。
关键词： pPak1Ser204 卵母细胞 减数分裂 染色体分离 -
小鼠卵母细胞减数分裂过程中LIMK1参与调控Aurora-A在纺锤体的定位
目的 研究小鼠卵母细胞减数分裂进程中活化的LIMK1(pLIMK1Thr508)与Aurora-A亚细胞分布的相关性, LIMK1活性变化对Aurora-A和纺锤体组装的影响.方法 收集21日龄CB6F1小鼠卵母细胞,分别体外培养至生发泡期(GV)、生发泡破裂期(GVBD)、第1次减数分裂中期(MI)、第1次减数分裂后期(AI)和末期(Tel I)以及第2次减数分裂中期(MII),固定并利用免疫荧光染色法分析减数分裂进程中pLIMK1Thr508的亚细胞定位模式及其与纺锤体组装调控因子Aurora-A的时空相关性;利用抑制剂BMS-3处理MI期细胞,结合免疫荧光染色分析LIMK1活性缺失对于Aurora-A空间分布和纺锤体形成的影响.结果 在小鼠卵母细胞减数分裂前期(prophase)(即GV期), pLIMK1Thr508信号微弱并主要聚集于生发泡,此时 Aurora-A 在胞内没有特殊聚集;在临近减数分裂重启时, pLIMK1Thr508离开生发泡,Aurora-A 信号出现,两者呈高度致密的点状聚集并紧密重合;在生发泡完全破裂后, pLIMK1Thr508和Aurora-A又呈多个点片状聚集在凝集的染色体周围;在MI期和MII期,pLIMK1Thr508与Aurora-A共同定位于纺锤体两极;在从AI期到Tel I期进程中pLIMK1Thr508离开纺锤体两极,聚集在收缩环部位,Aurora-A在纺锤体两极有微弱聚集.LIMK1抑制剂BMS-3能够破坏 Aurora-A在纺锤体两极的聚集,并影响纺锤体结构.结论 pLIMK1Thr508在卵母细胞减数分裂中是一种微管组织中心(MTOC)相关蛋白,可能通过调控Aurora-A而参与纺锤体结构的形成和维持.
关键词： pLIMK1Thr508 Aurora-A 卵母细胞 减数分裂 纺锤体 -
Pak1在小鼠卵母细胞纺锤体形成中的相关性
目的 研究自动磷酸化Pak1在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的亚细胞定位模式及其在纺锤体形成中的相关性.方法 用Western blot检测Ser144位点自动磷酸化的Pak1(pPak1S144)的蛋白表达量的动态变化;免疫荧光染色追踪pPak1S144的亚细胞定位模式及其与纺锤体和微管组织中心蛋白之间的时空关系.结果 在小鼠卵母细胞内pPak1S144持续稳定地表达于减数分裂各期,pPak1S144与中心粒周围蛋白(pericentrin)和γ微管蛋白(γ-tubulin)在时空上呈现紧密的共定位关系并特异地定位于纺锤体两极.结论 pPak1 S144是小鼠卵母细胞MTOC相关蛋白,提示其与减数分裂纺锤体形成相关.
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小鼠卵母细胞减数分裂过程中新型微管蛋白ε-tubulin稳定表达并与纺锤体的组装和维持相关
目的 研究新型微管蛋白ε-tubulin在小鼠卵母细胞减数分裂进程中的蛋白表达、亚细胞定位及其与纺锤体的相关性.方法 用Western blot法检测ε-tubulin在小鼠卵母细胞减数分裂各个时期的蛋白表达;免疫荧光染色分析ε-tubulin在减数分裂进程中的亚细胞定位模式及其与纺锤体的相关性.结果 ε-tubulin在小鼠卵母细胞减数分裂各个时期均有稳定的蛋白表达,在减数分裂前期均匀分布在细胞核中,在生发泡破裂后直到第二次减数分裂中期始终保持与纺锤体微管的共定位特性,并持续存在于染色体上.ε-tubulin对纺锤体毒性药物Taxol和Nocodazole敏感并呈现出与微管一致的反应性.结论 小鼠卵母细胞内新型微管蛋白ε-tubulin稳定表达并与纺锤体的组装和维持相关.
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小线虫帮助人类研究染色体分离
秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的性器官占据了身体的大部分空间,这一特征使得线虫尤其适用于生殖研究.Yanowitz的研究组在他们研究遗传重组过程中利用了这一点.线虫通过减数分裂的方式产生性细胞,这和人类非常相似.这一过程依赖于许多基因来调控特定的步骤.通过研究这些基因,了解重组如何正常工作以及知道重组是怎么出错的.
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人类卵母细胞减数分裂进程及形态学研究
目的对人类未成熟卵母细胞进行体外培养,观察卵母细胞直径和卵周隙随卵母细胞成熟所发生的形态学改变,并按照其染色体变化确定人类卵母细胞减数分裂进程.方法穿刺收集多囊卵巢患者未成熟卵母细胞进行体外培养成熟,分别于体外培养4、8、12、16、20、24和28h进行卵母细胞直径及大卵周隙测量,然后行染色体形态学观察并进行分析.结果未成熟卵母细胞体外培养10 h约有50%发生生发泡破裂(GVBD)恢复减数分裂;减数分裂Ⅰ(MⅠ)前中期由培养8 h的31.37%上升到16 h的45%,然后下降;MⅠ中期(Meta-MⅠ)在培养20 h进入高峰,占到40.63%,MⅠ后、末期(Ana/tel-MⅠ)维持时间相对较短,24 h后多数已进入减数分裂Ⅱ(MⅡ)成熟期,28 h未成熟卵母细胞体外培养的成熟率为68.85%.另外发现随着卵母细胞的体外成熟,其直径不会发生明显改变,但卵周隙(PVS)却在逐步增加.结论按照常规的体外培养方法可大致确定人类未成熟卵母细胞的体外成熟进程,且认为卵周隙的扩大可作为卵母细胞成熟分期的另一标志.
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CDK2在精母细胞和卵母细胞减数分裂中的作用
细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependent kinase,CDK)2是驱动细胞通过G1/S期检验点进入S期完成DNA合成的关键性调控蛋白.过去一度认为CDK2在减数分裂中的作用不像在有丝分裂中那么重要.直至2003年在敲除小鼠CDK2基因后出乎意料地发现小鼠生长发育正常,只是不育:生殖细胞减数分裂受到影响.这一发现引起人们重新审视CDK2在细胞增殖中的作用,对CDK2在减数分裂中的作用研究受到关注,本文就此作一综述.
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RNA 的 m6A 甲基化受 microRNAs 调控并促进细胞多能性重编程
m6 A 是普遍存在于 mRNA 的转录后修饰，约50％的核糖核酸甲基化修饰为 m6 A，指腺苷酸上6位 C 上连的氨基中的一个H 被甲基取代。已有研究表明 m6 A 甲基化形成缺陷可以影响昼夜节律、细胞减数分裂和胚胎干细胞增殖从而参与各种病理生理过程，然而 m6 A 形成的调控和参与细胞重编程的机制尚不清楚。作者为了探究这一过程，对四种不同分化潜能的小鼠ESC（胚胎干细胞），iPSC（诱导多能干细胞），NSC（神经干细胞）和 Sertoli cell（睾丸支持细胞）使用 anti-m6 A 抗体免疫沉淀甲基化的 mRNA，再通过 RNA 测序得到全基因组甲基化富集分布图谱。基因注释（gene ontology，为基因参与的生物过程进行注释的数据库）分析表明在四种细胞类型中稳定表达的转录本中，m6 A 富集于介导基本生物过程如细胞周期（cell cycle），RNA加工（RNA processing）的转录本；而介导蛋白的合成和功能的转录本中 m6 A 分布少。对转录本中 m6 A 分布的位置进行分析，发现 m6 A 在编码区和翻译终止区的富集是保守的。通过对细胞特异的 m6 A 甲基化富集分析，发现 m6 A 多分布在四种细胞特异的标记基因，参与细胞特异的生物过程如细胞干性维持和发育调控。
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SNP与遗传流行病学的发展
在本篇综述中,我们对现今单核苷酸多态(SNP)研究所蕴之动机进行了分析.许多此方面的研究都是建立于大样本、群体水平之上的,在此,着重探讨它在遗传流行病研究中的应用.首先回顾遗传性多态用于减数分裂绘图分析疾病易感基因的历史,继而讨论SNP的一些独特之处,以及它在人群研究中的利弊.以下就SNP技术在六方面的应用作一描述和评价.
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人类生精细胞在培养过程中的分化与变形
目的 探讨体外培养条件下生精细胞向单倍体精子细胞分化以及精子细胞变形为精子的可能性.方法 对11例非梗阻性无精子症患者行睾丸活检,将其中9份具有生精细胞的活检标本在终浓度为50 U/L卵泡刺激素和1μmol/L睾酮的改良人输卵管液培养液中进行体外培养,对培养前及培养后24h标本中精子及其他细胞进行计数,计算各种细胞的比例.应用流式细胞仪对2例患者培养前和培养后24 h的细胞进行细胞倍体分析.结果 9例标本培养前精子比例为(17.7±8.9)％,培养24h后为(25.6±10.3)％,培养前后差异有统计学意义(P=0.004).2例细胞倍体分析结果显示,培养前可见4、2和1 n波峰,培养后4 n波峰消失,1 n波峰显著增宽和增高.结论 生精细胞体外培养可使生精细胞发生减数分裂,并使精子细胞向精子变形.
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纺锤体与人卵母细胞质量的关系
纺锤体是卵母细胞的一个重要组成部分,是由极间微管、染色体牵丝及区间牵丝排列组成的中部宽阔,两极缩小的形状如纺锤的结构.一般在细胞分裂中期,其结构为典型.在细胞分裂过程中,纺锤体对卵母细胞染色体的平衡、运动、分配和极体的排出有非常重要的作用.纺锤体异常,会导致异常的减数分裂,有可能产生异常的胚胎.纺锤体对细胞质和周围环境的改变非常敏感[1],因此,它的形态学变化可能反映了体外培养环境中卵母细胞的质量.本研究从受精、卵裂及正常受精卵培养第3天的良好胚胎形成等3个方面,探讨纺锤体与人卵母细胞质量的关系;同时,通过观测纺锤体与第一极体之间的角度,预测卵母细胞质内单精子注射(ICSI)操作的安全性.
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荧光原位杂交技术用于1;12染色体平衡易位携带者胚胎植入前遗传诊断一例分析
染色体异常已成为不孕、不育的主要原因之一.染色体平衡易位患者因其具有完整的遗传物质,故往往表型正常,但在生殖细胞发生减数分裂时可产生多种不平衡配子而导致反复自然流产、死胎、死产、新生儿死亡、畸形或智力低下的后代.胚胎植入前遗传诊断(preimplantatation genetic diagnosis,PGD)通过选择正常的胚胎植入,从而降低流产风险,获得健康的后代.本例应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术,成功对1例1;12染色体平衡易位的患者进行PGD.现报道如下.
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不同冷冻法对小鼠未成熟与成熟卵母细胞的成熟及胚胎发育的影响
本研究观察应用慢速冷冻-快速复温(常规冷冻法)与玻璃化冷冻法,对小鼠生殖泡期未成熟及第二次减数分裂中期(metaphage Ⅱ,MⅡ)成熟卵母细胞冷冻后的解冻、体外成熟、受精及早期胚胎发育的影响.
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卵母细胞辅助激活技术在生殖医学领域的应用
随着各项研究的深入,卵母细胞激活作为受精过程中一个关键环节,日益受到人们的重视.研究人类卵母细胞激活,不但有助于深入了解人类生殖过程中卵母细胞减数分裂恢复和受精等机制,更可进而寻求一种有效的卵母细胞辅助激活方式,以提高人类辅助生殖技术的受精率.现将卵母细胞辅助激活的机制和卵母细胞辅助激活技术在生殖医学领域中的应用,综述如下.
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卵母细胞成熟障碍发生机制的研究进展
控制性超促排卵对辅助生殖技术有重要意义，可使不孕症患者在1个生理周期中同时获得多个卵母细胞。不过这些卵母细胞的成熟度常参差不齐，甚至成批次的发育停滞，从而导致整个治疗周期的失败。因而对卵母细胞发育停滞的机制进行研究具有重要的临床意义，有助于提高卵母细胞利用率。卵母细胞的成熟涉及的因素复杂，卵母细胞的来源可追溯于原始生殖细胞（primordial germ cell）。胚胎发育期间，原始生殖细胞进入生殖嵴生长，并停留于第一次减数分裂（MⅠ）前期（前期Ⅰ）的双线期直至青春期。在青春期之后，部分初级卵母细胞恢复MⅠ并进一步成熟，之后卵母细胞将停留于第二次减数分裂（MⅡ）中期（中期Ⅱ），等待排卵、受精。
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叶酸代谢相关基因与唐氏综合征关系的研究进展
唐氏综合征(down syndrome,DS),又称先天愚型,是常见的一种常染色体三体综合征,是人类智力低下常见的遗传学原因,在活产儿中,发病率为1/600～1/1000,在胎儿中发生率为1/150,其中80%为早期流产[1].其发生原因,约95%是由于母亲的生殖细胞减数分裂时第21号染色体不分离[2-4],但其细胞和分子机制仍不十分明确,有研究表明与遗传及营养因素有关,现对其研究进展综述如下.
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多能干细胞核心调控基因Nanog介导生殖母细胞减数分裂的作用研究
目的 探讨多能干细胞核心调控基因Nanog在原始生殖纽胞(PGCs)向生殖母细胞方向分化过程中的作用.方法 取11.0d胎鼠PGCs,按胚胎干细胞(ES)培养标准进行体外胚胎生殖细胞(EG细胞)培养.采用脂质体方法将Nanog靶向特异性小干扰RNA(siRNA)转染人EG细胞.RT-PCR、免疫荧光法检测siRNA的沉默效率；在倒置相差显微镜下进行体外克隆计数,检测EG细胞增殖未分化状态；TUNEL法和透射电镜检测EG细胞凋亡情况；半定量RT-PCR检测与生殖母细胞减数分裂相关的标志基因(Mvh、Stra8、Sycp3)的mRNA表达.结果 转染siRNA后48h EG细胞Nanog mRNA和蛋白表达明显受抑,典型未分化EG细胞克隆数量显著下降,呈现分化现象,悬浮细胞增多.TUNEL法、透射电镜检测悬浮EG细胞呈现凋亡征象.伴随Nanog表达下调,Mvh、Stra8、Sycp基因mRNA表达上调.结论 到达生殖腺后,多能性PGCs发生生殖母细胞化,开始减数分裂,该过程可能与多能干细胞核心调控基因Nanog的表达下调有关.
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DNA损伤应答与DNA双链断裂修复
在多种多样的生物体中,基因组保持完整具有极为重要的意义,它是细胞发挥功能和维持生存的必要条件.但是许多内源或外源因素如电离辐射(IR)、基因毒性剂、复制叉停止、核酸酶、减数分裂、免疫细胞V(D)J基因重排等,均可引起DNA损伤,破坏基因组的稳定性.
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人卵母细胞冻融的研究与应用
冷冻卵母细胞与冷冻胚胎对于治疗不孕症都具有重要价值.冷冻胚胎技术于1983年首次成功用于人类胚胎的保存[1].这些年来精子及胚胎冷冻已普遍用于生殖领域,但卵母细胞冷冻仍未在临床上广泛应用.1986年澳洲Chent2]首次报告卵母细胞冷冻合并体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization embryo transfer,IVF-ET)成功妊娠1例.目前这方面成功的经验仍不多.
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人DNA修复基因HR24L/HRAD17校正酵母细胞减数分裂缺陷表型
啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)DNA修复基因RAD24在进化上具有高度保守性, 非洲粟酒酵母(Schizosaccaromyces pombe)的同源物则是RAD17.我们分离了啤酒酵母RAD24基因温度敏感突变株rad24L,进而用遗传互补法克隆出人类同源基因HR24L (北京医科大学学报,1999,31:269) .继我们报道之后,美国哈佛大学学者通过分析基因组信息,比较与非洲粟酒酵母RAD17同源片段,利用PCR方法扩增出人类RAD17同源cDNA,然后筛选文库获得人类RAD17(HRAD17)基因(Cancer Research, 1999,59:2023-2028),序列测定结果表明与我们克隆的HR24L是同一个基因.该基因编码的产物不仅参与DNA损伤切除修复和重组修复,而且还参与细胞周期检定点调控.鉴于细胞周期检定点调控是体细胞进行有丝分裂(mitosis)和生殖细胞进行减数分裂(meiosis)共有的周期性事件,因此,我们用遗传学方法分离酵母细胞减数分裂突变株,用功能互补法研究人HR24L基因的互补作用.
