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兔移植肝糖原在缺血再灌注期间的代谢特点
我们研究了兔肝移植的供肝糖原含量在缺血再灌注期间的变化及代谢特点,现报告如下.材料与方法1.动物分组及模型:选用健康成年新西兰大耳白兔42只,体重2.0～2.5kg,雌雄不限,随机均分为供体组(21只)和受体组(21只).其中供体组再随机均分成3个亚组,分别作相应处理:A组(7只):术前禁食24*!h,自由饮水;B组(7只):正常喂食,术前2*!h禁食;C组(7只):正常喂食,并于术前24*!h内自耳缘静脉点滴25%葡萄糖液30*!ml/6*!h,共4次,每次平均于30*!min内注射完.受体组均给予正常喂食,术前2*!h禁食.以B组为对照组.参照Jamieson等[1]介绍的方法进行供体组兔肝的原位灌注及切取.将切取的供肝立即置于4℃ Euro-collines液,冷存6*!h后,按我科自建的方法再灌注2*!h.
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大鼠全胰十二指肠移植供体的切取与灌注技术改进
高质量供体的获得是决定大鼠胰十二指肠移植术后存活的关键因素.传统方法均采用充分游离供体后注射器推注原位灌注的方法[1],但此方法易于在胰十二指肠毛细血管内形成微血栓,造成灌注不充分,影响移植物术后存活率.在原有方法基础上,我们采用输液器持续灌注后,迅速整块切取供体,再在冷盐水中修剪的方法,取得较好效果.
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大鼠原位灌注模型研究靛玉红吸收机制
目的 研究靛玉红在大鼠肠道的吸收动力学特征,并考察不同药物浓度和增溶方法对其吸收速率的影响.方法 选用适当增溶剂提高靛玉红的溶解度,进行大鼠原位肠灌注实验.结果 靛玉红吸收较差,在4～16 mg·L-1内靛玉红的Ka值基本保持不变.各部位吸收速率依次为十二指肠≈回肠＞结肠＞空肠.尽管是否结扎胆管对吸收参数影响不大,但未结扎胆管时,小肠全肠段和十二指循环液的剩余药量-时间曲线波动较大,结扎胆管后波动明显减弱.结论 在实验剂量范围内,靛玉红在大鼠肠道内的吸收呈现一级吸收动力学特征,其吸收机制为被动扩散,并可能存在肠肝循环.
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2例原位肝移植术供肝灌注配合
我院于1999年11月和2000年9月为2例终末期肝病病人实施了原位肝移植手术.在供肝的切取过程中,均使用UW液和HCA液作为灌注液,采用快速重力法对供肝原位灌注降温,临床效果满意.现将原位肝移植术供肝灌注配合体会报告如下.
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原位灌注肝肾联合快速切除方法的应用(附69例临床应用报告)
1996年5月～2003年11月作者共施行129例供肝获取手术,其中69例为原位灌注肝肾联合切取.现报告如下.
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尸体肝肾联合切取及其临床应用
我院自2000年10月至2002年12月采用4℃器官保存液及UW液低温原位灌注,快速切取供肝、肾23次.施行19例肝移植,40例肾移植及4例肝肾联合移植,疗效满意.现将肝肾联合切取的体会总结如下.
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大鼠胰腺原位灌注实验模型的建立及可行性研究
目的 建立大鼠胰腺原位灌注实验模型,并对其用于胰岛β细胞功能研究的可行性进行验证.方法 将10只健康SD大鼠随机分为观察组和对照组各5只,均用戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉,按文献将胰腺与脾、胃和结肠等组织器官分离后建立原位灌注实验模型,观察组分别以低糖灌注液灌注10 min、依拉地平—高糖灌注液灌注25 min,对照组分别以低糖灌注液灌注10 min、高糖灌注液灌注25 min；用4℃预冷并加有20μl抑肽酶的eppendorf管收集两组门静脉插管的流出液,用放射免疫分析法检测胰岛素水平,计算胰岛素分泌率、基础胰岛素分泌率、葡萄糖刺激的胰岛素分泌率.结果 ①两组基础胰岛素分泌率无显著差异,均呈现低水平状态.②对照组在第1时相胰岛素分泌水平迅速升高,分泌高峰出现在第12分钟,随后迅速下降,并在一个较高水平稳定波动(即第2时相)；观察组胰岛素分泌峰值及胰岛素第1、2时相分泌率均显著低于对照组(P均＜0.01).结论 胰腺原位灌注模型较体外灌注模型更易于操作,且同样具备可定量、可重复、可动态观察等优点；此为胰岛β细胞功能的研究提供了一种有效实用的方法.
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腹腔镜下原位低温灌注技术在肾肿瘤部分切除术中的运用
目的 探讨腹腔镜下原位低温灌注技术在肾肿瘤部分切除术中的运用,评估可行性及安全性.方法 行腹腔镜肾肿瘤部分切术的患者26例,将26例患者随机分为实验组和对照组,每组各13例.实验组采用自制灌注设备,将两根管道从Trocar旁间隙导入体内,穿刺肾动脉进行灌注,将静脉回流液导出体外.对照组按照常规手术方式进行手术.比较两组患者平均手术时间、出血量、灌注时间和术前肌酐.结果 26例患者手术均获成功,实验组体重指数(BMI)为(24.5±3.1)kg/m2,Radius Exophytic Nearness Anterior Location评分(RENAL)为(3.1±1.1)分,肿瘤直径(3.1±1.1)cm,平均手术时间(15.8±4.1)分钟,出血量(58±8)ml,灌注时间平均5.4秒,术前肌酐(58±11)mmol/L;对照组BMI为(26.0±2.4))kg/m2,RENAL评分(3.3±0.7)分,肿瘤直径(3.2±0.9)cm,平均手术时间(16.5±7.5)分钟,出血量(46±9)ml.两组病例肿瘤大小、手术时间及出血量比较,差异无统计学意义.实验组与对照组术后1周、1个月、3个月肌酐比较,差异有统计学意义(P<0.05),实验组所有病例术后早期肾功能评价优于对照组.所有肿瘤切缘均为阴性.结论 采用腹腔镜下原位低温灌注技术,可以将肾脏热缺血变为肾脏冷缺血,为延长手术时间提供保障,同时能够更好的保护肾脏功能.成功手术
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改良法分离肝纤维化不同阶段小鼠肝星状细胞
目的 探索一种应用于肝纤维化不同阶段小鼠的肝星状细胞(HSCs)分离方法.方法 联合肝脏原位灌注胶原酶、离体消化、细胞梯度密度离心等方法,分离获取小鼠原代HSCs;采用形态学观察及细胞自发荧光检测,进行细胞纯度鉴定;利用锥虫蓝染色进行细胞活力评估;应用免疫荧光染色,对HSCs活化状态进行检测.结果 通过本方法,从正常小鼠可获得1.14×106个HSCs,纯度达95.7％,活力为92.8％;从肝纤维化不同阶段小鼠可获得1.85×106个HSCs,纯度达90.6％,活力为97.3％;分离所得的HSCs均可于体外继续培养及活化.结论 基于梯度密度离心的改良法简便高效,适用于肝纤维化不同阶段小鼠肝星状细胞的分离与培养.
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大鼠原代肝细胞与枯否细胞同步分离的优化研究
目的 优化分离培养高纯度的大鼠肝细胞与枯否细胞,为肝细胞与枯否细胞的共同培养提供实验细胞.方法 ①原位胶原酶灌注法分离细胞;②Percoll液不连续密度梯度离心法分离枯否细胞;③选择性贴壁纯化枯否细胞;④台盼蓝拒染法判定细胞活力,PAS染色法鉴定肝细胞,墨汁吞噬及CD68免疫染色法鉴定枯否细胞.结果 通过改良的原位胶原酶灌注法,不连续密度梯度离心法以及选择性贴壁法等手段,成功实现了肝细胞与枯否细胞的同时分离,且所分离出的2种细胞的得率与纯度均达到后续实验所需细胞的要求.结论 通过该创新方法同时分离肝细胞与枯否细胞是有效可行的.
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原位灌注制作大唾液腺管道铸型标本
大唾液腺包括有,腮腺,下颌下腺和舌下腺.有作者离体插管灌注,成功制作唾液腺管道铸型[1-3].但改变了它们原位置和形外态.为了配合临床对唾液腺手术的课题研究.除显示唾液腺管道的构筑情况外,对腺体的位置和形态要求更高.为此我们对原有的技术方法进行了改进.
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内毒素血症时内皮素及受体致肝损伤的分子机理研究
目的:探讨内毒素血症时大鼠肝组织内皮素-1(endothelin-1,ET-1)和内皮素受体(endoth elin receptor, ETR)活性变化、mRNA表达以及与肝损伤的关系.方法: 选用Wistar大鼠9 0只,分为对照组、内毒素组(10 mg/kg)和内皮素抗体组(内毒素10 mg/kg+1∶2 000 ET-1 抗体2 mL/kg).采用内毒素血症动物模型、肝脏原位灌注模型,斑点杂交和原位杂交技术, 细胞培养技术.观察了3、6、12和24 h四个时相点肝组织ET-1、ETR活性变化、mRNA表达,肝组织中MDA、ATP、GPT的变化.结果:(1)ET-1的变化:肝组织中内皮素的含量增加6倍;肝组织中内皮素mRNA相对含量增加7.3倍;肝组织中肝小叶中央静脉内皮细胞、肝血窦内皮细胞内反应颗粒密集堆积:内毒素能使培养的人脐静脉血管内皮细胞分泌内皮素的量增加12.3 倍.(2)ETR的变化:肝组织ETR的解离常数(KD)无明显变化,大结合数(Bmax)伤后3 h显著降低,持续24 h;肝组织内皮素A型受体(endothelin receptor A) mRNA相对含量均高于对照组;原位杂交结果显示肝血窦周围、肝小叶间动脉壁的平滑肌细胞呈阳性反应,颗粒堆积.(3)内皮素在内毒素致肝损伤中的作用:原位灌注肝脏:内皮素不仅使门静脉压升高, 而且导致肝细胞浊肿:在体实验:肝组织中内皮素含量与MDA呈正比,与ATP成反比.在体实验和原位灌注肝脏结果表明内皮素抗体可部分拮抗内毒素所致的肝损伤作用.结论 :内毒素血症时,内毒素能使ET-1含量增加,ETR的大结合数降低.内毒素可能是在转录和翻译水平调节ET-1和ETAR的合成.内皮素及受体参与内毒素所致的肝损伤.
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大鼠原代肝细胞、星状细胞、枯否细胞和肝窦内皮细胞的同步分离与培养
目的：探索和建立同步分离大鼠原代肝细胞、星状细胞、枯否细胞和肝窦内皮细胞，并进一步鉴定和培养的方法。方法联合应用原位灌注、离体灌注、梯度密度离心和差速贴壁等分离方法，获取4种大鼠肝内原代细胞，采用形态学观察、免疫荧光染色和墨汁吞噬实验等方法对所分离的各种原代细胞进行纯度鉴定。结果通过原位灌注结合离体灌注、密度梯度离心结合差速贴壁等分离手段，成功实现了大鼠原代肝细胞、星状细胞、枯否细胞以及肝窦内皮细胞的同步分离，且所得原代细胞得率、活力及纯度等指标均符合后续细胞实验要求。结论通过简易方法同步分离大鼠原代肝细胞、星状细胞、枯否细胞以及肝窦内皮细胞是可行的。
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青黛配方分散片对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用及大鼠原位灌注试验
目的:从药效和药物吸收两方面比较两种剂型的青黛,为将青黛开发成分散片形式的新型配方颗粒提供试验依据.方法:采用相同剂量青黛饮片和配方分散片药液进行预防给药,以腹腔注射四氯化碳建立小鼠急性肝损伤模型,检测各组动物血清中ALT和AST;建立大鼠原位灌注模型,灌注相同剂量药液,2h后检测大鼠胃和十二指肠中灌注液靛蓝、靛玉红浓度.结果:同等剂量下,两种剂型的青黛均能显著降低四氯化碳所致小鼠急性肝脏损伤模型动物ALT、AST,减轻病理性损伤,其中分散片剂型效果更佳.同时,青黛配方分散片在胃和十二指肠中的吸收率均高于原饮片.结论:青黛配方分散片使药物有效成分在水中溶出度大幅度增加,有利于其在体内的吸收,从而增强药物疗效.
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猪肝细胞分离方法的改良
目前,在供体器官短缺的情况下,大家公认猪是合适的异种器官和组织的提供者,用猪肝细胞治疗急性肝衰病人已有报道.如何将肝细胞大限度完整地、无损伤地分离出来,这是非常关键和重要的一步.我室在进行猪肝细胞的分离中,逐渐探索出一套比较行之有效的方法.材料与方法:采用中国实验用小型猪,常规麻醉、消毒、开腹,用D-Hank′s液进行肝脏原位灌注,再用0.02%EDTA-Hank′s液(37℃)灌注18～20mi n,摘取肝脏行多点灌注5min,置肝脏于60目钢网上,用直剪迅速剪开肝脏被膜,用镊子夹起轻轻抖动,并用1640液冲洗,边抖动边冲洗,使细胞滤出漏于烧杯中.与此同时,用剪刀把肝组织剪成小块,再用玻璃注射器芯轻轻研磨,边研磨边冲洗,操作要轻,并保持无菌,收集肝细胞,离心洗涤三次,并逐级用80目、100目、120目、150目钢网过滤.分离出的肝细胞进行计数、台盼蓝拒染试验检查、PAS染色、葡萄糖-6-磷酸酶染色及电镜检查.结果:肝细胞存活率90±1.3%,PAS染色显示肝糖元丰富,葡萄糖-6-磷酸酶染色显示酶的活性良好.电镜观察,肝细胞的线粒体、内质网等亚显微结构未见异常.对于猪肝细胞的分离,国外文献报道多采用Ⅳ型胶原酶循环灌注法,但费用很昂贵.在实践中,我们用EDTA代替胶原酶,采用肝脏原位灌注+多点灌注+机械研磨的方法,取得了较为满意的效果.此法与胶原酶灌注法比较,从分离的肝细胞数量、活力、肝糖元及细胞中一些酶的活性都与胶原酶法无显著差异,且光镜及电镜观察,显示细胞形态及亚细胞结构未见异常.我们认为此方法易于控制,价格低廉;而胶原酶法容易消化过度,造成细胞膜破损 ,或消化不完全造成多个细胞连在一起,且费用昂贵.实验证明,改良的猪肝细胞分离方法为用猪肝细胞治疗急性肝衰病人的研究提供了一个可行的方法.
