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中国脑膜炎奈瑟菌nadA基因多态性分析
目的 了解我国脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis,Nm)主要黏附蛋白(Neisseria adhesion A,NadA)编码基因nadA的多态性特征,以期研究我国主要流行Nm菌株NadA蛋白的流行病学意义及NadA蛋白作为脑膜炎球菌蛋白疫苗候选蛋白研发的可行性.方法 选取我国26个省(市、自治区)1963-2012年间不同血清群代表性Nm菌株230株,采用多位点序列分型(muliti-locus sequence typing,MLST)、PCR、斑点杂交、基因测序等方法,检测Nm菌株基因型特征、nadA基因分布的多态性及其基因序列特征,利用BioEdit、Mega 4.0等软件对nadA基因序列进行比对分析.结果 我国230株不同血清群的Nm菌株中,nadA+菌株55株,仅存在于ST-5complex(序列群)的A群和ST-11complex的W135群Nm菌株中,B、C及其他血清群Nm菌株nadA-.nadA+菌株基因型以variant 3(V3)型为主(54/55),包括5种亚型(NadA V3.1～3.5),同源性高达99％以上.结论 我国Nm菌株中,仅ST-5complex的A群和ST-11complex的W135群菌株存在NadA黏附蛋白,型别以variant 3型为主.B群菌株不含有NadA蛋白,variant 3型NadA蛋白不适合作为我国B群Nm(B meningococci,MenB)蛋白疫苗的候选蛋白.
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采用弓形虫T7噬菌体文库筛选黏附相关蛋白基因的研究
目的 用原代培养的猫肠上皮细胞(IECs)对已构建的弓形虫T7噬菌体展示文库进行筛选,期望得到将新的弓形虫入侵宿主细胞黏附相关蛋白基因. 方法 将猫IECs与混有噬菌体文库的DMEM培养基孵育培养后进行洗脱筛选,再与宿主菌BLT5403共同培养扩增文库,筛选噬菌体DNA并进行基因序列测定与分析. 结果 洗脱下的噬菌体滴度从第1轮7.6×105到第5轮的3.6×107,富集了230倍,非特异性结合和亲和力低的噬菌体被成功去除;核苷酸序列分析表明含插入片段为394 bp的噬菌体富集量大,经检索为弓形虫棒状体蛋白基因,是棒状体蛋白基因ROP2和ROP8的共有序列. 结论 初步证明弓形虫棒状体蛋白为黏附相关蛋白基因,其表达产物为ROP2.
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梅毒螺旋体Tp0751黏附蛋白的表达、纯化及免疫活性研究
目的 表达梅毒螺旋体黏附蛋白Tp0751,纯化表达产物并进行免疫活性分析,为探索Tp0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定基础.方法 通过生物信息学分析,去除Tp0751信号肽序列,构建原核表达体进行诱导表达;Ni亲和层析柱纯化重组蛋白,Western blot检测其免疫反应性,用重组蛋白免疫新西兰家兔,评价其免疫原性.结果 成功构建了pET-28a(+)-0751原核表达载体,经表达、纯化后获得了相对分子质量约为26×103的融合蛋白;Western blot检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应;利用纯化的Tp0751重组蛋白免疫新西兰家兔,能诱导家兔产生特异性免疫应答,ELISA法测定免疫血清中特异性抗体滴度在1∶10 240以上.结论 重组表达的Tp0751黏附蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其在梅毒致病过程中的作用和生物学功能奠定了基础.
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应用噬菌体展示肽库筛选生殖支原体黏附蛋白的模拟表位
目的 利用纯化的兔抗重组生殖支原体黏附素蛋白(rMgPa)的多克隆抗体(pAb)从噬菌体展示随机12肽库筛选MgPa的模拟表位.方法 用纯化的兔抗rMgPa的pAb对噬菌体随机12肽库进行生物淘洗,随机挑取噬菌体克隆进行DNA测序与分析,并用MIMOX对噬菌体克隆所展示的肽序列进行生物信息学分析.用ELISA、竞争性结合试验和Western blot检测噬菌体与pAb结合的特异性.结果 4轮生物淘洗后特异性噬菌体克隆得到了明显的富集.依据氨基酸组成的不同,74个噬菌体克隆所展示的肽序列可大致分为3组.经对肽序列进行比较分析以及用MIMOX进行生物信息学分析,结果表明这3组的核心序列分别为:P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P、A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I.ELISA、竞争性结合试验和Western blot方法检测的结果表明噬菌体能与pAb发生特异性结合,说明其可能是MgPa的模拟表位.结论 成功筛选到MgPa的3个可能的模拟表位,为研制基于Mg抗原表位的诊断试剂与多肽疫苗奠定了一定的实验基础.
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生殖支原体黏附蛋白MgPa特异结合多肽的筛选与鉴定
目的：利用噬菌体展示随机12肽库筛选生殖支原体黏附蛋白( MgPa)的特异结合多肽，以了解MgPa的生物学功能及其可能的致病机制。方法以纯化的重组生殖支原体黏附蛋白( rMgPa)为靶分子，对噬菌体展示随机12肽库进行3轮生物淘选，收集淘选后的噬菌体进行扩增培养，利用碘化钠法提取其单链DNA进行测序分析。用ELISA、竞争性结合试验和斑点免疫印迹试验检测阳性噬菌体与rMgPa结合的特异性。结果进行3轮生物淘选后，噬菌体克隆有明显富集。随机挑取的38个噬菌体克隆中，共出现11种不同的外源性多肽序列( P1~P11)。根据11条多肽序列中氨基酸出现的重复次数，推导出两条核心序列，即：V-H-W-D-F-R-Q-W-W-Q-P-S和D-W-S-S-W-V-H/Y-R-D-P-Q-T/S。 ELISA、竞争性结合试验和斑点免疫印迹试验的结果表明：11个代表性克隆中，有10个(P1~P10)能与rMgPa发生特异结合。结论成功筛选到了能与rMgPa发生特异结合的2条多肽，为了解MgPa的生物学功能，从而进一步了解Mg可能的致病机制提供前期实验基础。
关键词： 生殖支原体 黏附蛋白 噬菌体展示随机12肽库 特异结合多肽 -
肺炎支原体P1黏附因子主要抗原表位的表达及其临床应用研究
目的 探索肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1蛋白作为抗原成分在临床血清抗体检测中的应用.方法 通过生物信息学分析P1基因主要抗原决定簇,选择其分值较高的部位进行原核表达、纯化,并进行Western blot鉴定,用纯化后的蛋白免疫小鼠,评价其免疫原性,同时用其作为抗原,采用ELISA方法检测肺炎支原体患儿血清抗体并与全菌体抗原进行比较.结果 成功构建了pET-28C-P1-534原核表达载体,经表达、纯化后获得了相对分子质量为26×103的融合蛋白;Western blot检测其能与Mp阳性血清发生特异性反应;利用纯化的重组蛋白免疫小鼠,能诱导小鼠产生特异性免疫应答,抗体滴度可达 1∶2000;用此蛋白作为抗原成分检测患儿血清,其敏感性和特异性分别为85.00%及97.67%.结论 重组表达的P1-534蛋白具有良好的免疫原性,作为新的抗原成分其敏感性和特异性优于全菌体抗原,为肺炎支原体抗原成分及其蛋白保护作用的研究奠定了基础.
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Periostin在恶性肿瘤发生发展过程中的作用
Periostin又被称为成骨细胞特异性因子-2，初从小鼠的成骨细胞系MC3T3-E1中分离［1］。 Periostin作为细胞黏附蛋白能够促进成骨，此后其同源基因在人类及斑马鱼上也被克隆［2-3］。Periostin在骨外膜、软骨膜、牙周膜、肌肉筋膜、软骨关节面以及关节韧带中高表达。因此，Periostin被认为在形成和维持上述机械应力持续存在的组织中发挥了重要作用［4］。此外，也有研究证实了Periostin的表达与心脏的发育和心脏疾病密切相关［5-6］。近，有许多研究报道了Periostin在多种人类恶性肿瘤的细胞系以及肿瘤实体中高表达。本文将Periostin在恶性肿瘤中的作用综述如下。
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川芎嗪对放射损伤小鼠骨髓白细胞功能相关抗原-1表达的影响
骨髓属于辐射敏感器官,造血功能障碍是放射损伤基本的病理变化.造血细胞的增殖、分化和释放是通过造血细胞与基质细胞上的黏附蛋白配体结合而实现的.以往研究证明川芎嗪可以改善骨髓微环境,提高基质细胞黏附功能[1].本实验采用流式细胞术检测骨髓造血细胞表面黏附分子白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)表达水平的变化及骨髓造血恢复的分子生物学机制.
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苍白密螺旋体Tp0751黏附蛋白的表达、纯化及免疫反应性分析
目的 表达苍白密螺旋体(梅毒螺旋体)黏附蛋白Tp0751,纯化表达产物并进行免疫反应性分析,为探索Tp0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定基础.方法 通过生物信息学分析,去除Tp0751信号肽序列,构建原核表达体进行诱导表达;Ni亲合层析柱纯化重组蛋白,Western-印迹检测其免疫反应性.结果 成功构建了PET-28a(+)-0751原核表达载体,经表达、纯化后获得了相对分子量约为26×103的融合蛋白,其表达产物占全菌总蛋白的＞30%,并且主要可溶性形式存在;Western-印迹检测其能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性.结论 重组表达的Tp0751黏附蛋白为可溶性蛋白,且具有良好的免疫反应性,为进一步研究其在Tp0751黏附蛋白在梅毒致病过程中的作用和其生物学功能奠定了基础.
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呼吸道合胞病毒感染及反义基因治疗的研究进展
一、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染及治疗现状1.RSV基因结构与蛋白功能:RSV属于副黏病毒科,肺炎病毒属,为非节段性单股负链RNA病毒,含有大约15 000个核苷酸,其基因顺序依次为:3'NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-(M2-1/M2-2)-L-5',共编码11个病毒蛋白[1,2],分别为:核衣壳蛋白N、磷蛋白P、多聚酶亚单位L、转录延长因子M2-1、黏附蛋白G、融合蛋白F、小疏水蛋白SH、非结构蛋白NS1和NS2、基质蛋白M和M2-2.
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空肠弯曲菌黏附蛋白(PEB1)基因工程疫苗外周神经安全性的实验研究
目的以空肠弯曲菌(campylobacter jejuni, CJ)菌体全抗原为对照,以基因重组的该菌融合黏附蛋白(TrxA/PEB1)作为CJ疫苗免疫大鼠,并对其神经安全性进行实验性评价. 方法分别以纯化的TrxA/PEB1和CJ Pen19菌体全抗原经全身免疫增强法免疫大鼠,初次免疫后第2、4、5周采用ELISA法动态观察抗体滴度,并分别于第 3、5周分离坐骨神经原纤维及行甲苯胺蓝染色光镜观察.采用ELISA法检测第5周抗血清与GM1抗原的结合反应.神经外膜下注射抗TrxA/PEB1和抗CJ 全菌抗原的特异性抗血清,观察其神经病理学改变. 结果 (1)经两种抗原免疫后,大鼠均产生高滴度特异性IgG,且各自与两种抗原发生交叉反应;(2)以CJ Pen19全抗原免疫后抗血清可与GM1抗原结合,而TrxA/PEB1免疫者则否;(3)CJ Pen19免疫组有60%大鼠坐骨神经出现以轴索变性为主的免疫性损伤,而TrxA/PEB1融合蛋白免疫者则未发生;(4)CJ Pen19免疫血清神经外膜下注射后全部大鼠均发生轴索变性为主的病变,且75%为显著病变,而TrxA/PEB1免疫血清外膜下注射后却未引起明显病变. 结论 CJ Pen19全菌抗原和TrxA/PEB1纯化蛋白作为免疫原均可激发大鼠有效体液免疫应答,但与CJ全菌抗原相比,TrxA/PEB1蛋白所产生的全身免疫反应未引起周围神经损伤,其抗血清不含针对GM1抗原的抗体,对外周神经无免疫损伤作用.据此可认为 TrxA/PEB1作为CJ疫苗安全可靠.
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整合素连接激酶与肾脏疾病
整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)是一种新发现的进化保守的黏附蛋白,属于一种丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,可以同整合素β1、β2、β3亚基胞浆区域及细胞骨架相关蛋白,包括PINCH、Parvins等结合,并发生相互作用,在调节基质积聚、细胞黏附、凋亡、迁移、生长、肿瘤形成等过程中起重要作用,与肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)和蛋白尿的发生相关.现就ILK及其与肾脏疾病关系综述如下.
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血小板膜糖蛋白研究进展
血小板膜糖蛋白(platelet membrane glycoprotein)是血小板膜内、膜表面及血浆中特定的血小板糖蛋白(glycoprotein,GP)成分.血小板膜糖蛋白在初的止血、血小板黏附到细胞外基质及随后的血小板聚集过程中发挥作用.除了作为黏附蛋白的受体,血小板膜糖蛋白还作为血小板特有的免疫受体及免疫原,起到重要的免疫学作用.现将其主要成分、主要功能、分析方法及临床应用方面的研究进展综述如下.
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芪丹通脉片对肿瘤坏死因子-α诱导的心肌细胞的细胞间黏附分子-1表达的影响
近年来,冠心病发生发展中的细胞黏附机制日益受到重视,其中内皮细胞(EC),白细胞和血小板之间以及与血管内皮基质间相互黏附、相互作用而导致炎症反应和促凝异常、血栓形成,从而促进冠心病的形成和发展,而黏附分子和黏附蛋白是介导细胞黏附的分子基础.
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成骨细胞与纳米植入材料相互作用研究进展
骨植入材料与周围骨组织的骨整合对于材料的稳定性有着巨大影响,其中成骨细胞产生各种不同的蛋白质分子完成胞体与材料以及周围细胞的连接.这些蛋白质分子包括细胞外基质蛋白、细胞骨架蛋白和黏附蛋白等.实验证实:带有纳米表面结构的植入材料具有良好的生物相容性和理化特性;纳米表面粗糙程度大大增加,亲水性、电化学特性明显提高,更有利于细胞外基质蛋白等的黏附和相互作用,从而促进成骨细胞黏附、增殖和分化;纳米表面也能促进成骨细胞产生前列腺素E2(prostagIandin E2,PGE2)、转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)等细胞因子,影响新骨形成.纳米表面骨植人材料及其对成骨细胞的影响的作用机制还有待进一步研究.
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慢性再生障碍性贫血患者骨髓基质细胞和单个核细胞黏附作用及部分相关抗原的表达
骨髓造血干细胞的增殖、分化、释放是通过造血干细胞表面黏附分子与基质细胞、细胞外基质上的黏附蛋白配体结合而实现的,细胞间的黏附作用有转导生长和生存信号的作用,黏附本身亦或能够转导依赖于细胞因子及生长因子的信号,一系列的细胞间接触调控造血过程[1].我们对慢性再生障碍性贫血(CAA)患者的骨髓基质细胞(BMSC)及骨髓单个核细胞(BMMNC)相关黏附分子进行了研究,报告如下.
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肺炎支原体黏附蛋白P1羧基末端的原核表达及纯化
目的 原核表达并纯化肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)黏附蛋白P1羧基末端.方法 提取MP FH型基因组DNA,以其为模板,PCR扩增P1羧基末端基因,插入原核表达载体pET-32a(+),构建重组表达质粒,转化E.coli Rosetta,IPTG诱导表达.表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot和ELISA鉴定.结果 重组表达质粒pET-32a-MP-PIC经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约55 900,以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的47%;纯化的重组蛋白纯度达94%以上,浓度为3.77 mg/ml,可与支原体肺炎患者血清特异性反应,经3 000倍稀释后,仍可与支原体肺炎患者血清发生阳性反应.结论 原核表达并纯化了MP黏附蛋白P1羧基末端,为进一步研究MP的致病机制及研发诊断试剂和基因疫苗奠定了基础.
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人呼吸道合胞病毒黏附蛋白片段的原核表达及纯化
目的 原核表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株黏附蛋白(G)片段.方法 利用PCR技术从HRSV兰州株(A亚型)中扩增G基因AA75-225片段,克隆至原核表达载体pET-42b(+)中,构建重组表达质粒pET-42b-G,转化大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果 PCR扩增获得453 bp的DNA片段；重组表达质粒pET-42b-G经双酶切及测序鉴定证明构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量为50 230,表达量占菌体总蛋白的25％,以包涵体和可溶性两种方式存在；纯化后重组蛋白纯度可达95％以上,可与抗RSV-G蛋白单克隆抗体特异性结合.结论 已成功地在大肠杆菌BL21( DE3)中表达了HRSV兰州株G片段,为后续RSV疫苗的研制、RSV感染的血清学诊断及试剂盒的研发提供了材料.
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肺炎支原体主要黏附蛋白的研究进展
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)可引起呼吸道感染,是儿童社区获得性肺炎的常见致病菌,并且可导致多系统并发症.Mp尖端的黏附蛋白复合体与肺纤毛上皮细胞的黏附过程是其主要致病机制.P1、P30、P116等蛋白作为黏附复合体的主要成分,在感染过程中起到了关键作用.在缺失这些蛋白的突变株中,细胞结构异常,黏附能力、运动速度、致病性均表现出不同程度的下降.由于Mp生长缓慢,对营养要求苛刻,常规微生物分离培养不适用于临床快速诊断,目前亚洲地区Mp耐药率居高不下,Mp感染后又无特异性临床症状,使得临床工作中Mp感染的诊治常被延误.重组蛋白表达技术的出现,使得Mp主要蛋白可以应用在Mp诊断试剂盒和疫苗研发中,本文针对Mp主要黏附蛋白的基因结构、致病机制及其应用方面的新研究进展进行综述.
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生殖支原体对宿主细胞黏附机制的研究进展
生殖支原体通过其黏附细胞器定植于人体相关组织,引发非淋菌性尿道炎等感染性疾病,但其具体的黏附过程可能相当复杂.探讨其黏附机制有助于了解其致病过程,以促进有关疾病诊断和防治等方面的研究.本文着重介绍了生殖支原体黏附细胞器的形态、结构,各种黏附蛋白的定位、功能及相关基因序列.
