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糖肾宁含药血清对高糖刺激肾小管上皮细胞增殖作用及RhoA/ROCK信号通路影响的实验研究
目的:探讨糖肾宁含药血清对高糖刺激肾小管上皮细胞增殖作用及RhoA/ROCK信号通路的影响.方法:10％ FBS的RPMI 1640培养细胞,培养细胞分为正常组、模型组、厄贝沙坦组和糖肾宁组,按每孔3000个细胞接种于96孔板中.每组8个复孔,加入6％的各组合药血清培养,分别于12、24、48、60h观察细胞形态并应用MTT法检测细胞增殖情况;Western blotting检测RhoA、ROCK1、α-SMA和E-Cadherin蛋白的表达.结果:正常组细胞呈扁平不规则多角形,高糖刺激下,细胞呈梭型,加入含药血清后呈扁平不规则多角形.MTT:24、48 h,正常组与模型组比较,有极显著性差异(P＜0.01),60 h,正常组与模型组比较,有显著性差异(P＜0.05);24 h,糖肾宁组与厄贝沙坦组比较,有显著性差异(P＜0.05);48 h,糖肾宁组与厄贝沙坦组、Y27632组比较,有极显著性差异(P＜0.01);60 h,糖肾宁组与厄贝沙坦组、Y27632组比较,有显著性差异(P＜0.05).Western blotting:正常组与模型组、Y27632组比较RhoA蛋白表达减少,有极显著性差异(P＜0.01);糖肾宁组与模型组比较,有极显著性差异(P＜0.01);糖肾宁组与Y27632组比较,有显著性差异(P＜0.05).正常组与模型组比较ROCK1蛋白表达减少,有极显著性差异(P＜0.01);Y27632组、各治疗组和模型组比较,有显著性差异(P＜0.05).正常组与模型组比较α-SMA蛋白表达减少,有极显著性差异(P＜0.01);Y27632组、各治疗组和模型组比较,有显著性差异(P＜0.05).正常组与模型组组比较E-Cadherin蛋白表达增加,有显著性差异(P＜0.05);Y27632组与糖肾宁组比较,有显著性差异(P＜0.05);模型组与Y27632组、各治疗组比较,有显著性差异(P＜0.05).结论:糖肾宁可抑制高糖培养肾小管上皮细胞增殖和RhoA/ROCK信号通路相关分子的表达,逆转肾小管上皮细胞转分化、减轻肾间质纤维化、延缓DKD进程.
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糖肾平含药血清对高糖诱导肾小管上皮细胞增殖作用及RhoA/ROCK信号通路影响的研究
目的:探讨糖肾平含药血清对高糖刺激肾小管上皮细胞增殖作用及RhoA/ROCK信号通路的影响.方法:制备鼠含药血清;培养肾小管上皮细胞分为:正常组,高糖组,抑制剂(Y27632)组,厄贝沙坦组,糖肾平低、中、高剂量组,3000细胞/孔种于96孔板,每组8个复孔,12、24、48、60 h观察细胞,MTT法检测细胞增殖.Western blotting检测肾小管上皮细胞中RhoA、ROCK1、α-SMA和E-Cadherin蛋白的表达.结果:高糖诱导后细胞呈梭型或不规则三角形;含药血清干预后,细胞呈扁平不规则多角形.MTT:12 h,与正常组比,各组OD值升高;24、48、60 h,与正常组比,高糖组OD值显著升高(P＜0.01);与高糖组比,各治疗组OD值有不同程度降低(P＜0.05),48 h,与Y27632组、厄贝沙坦组和糖肾平高剂量组比,糖肾平低、中剂量组OD值降低(P＜0.05);60 h,与Y27632组比,糖肾平中剂量组降低;与厄贝沙坦组比,糖肾平各剂量组OD值降低(P＜0.05);与糖肾平高剂量组比,糖肾平低剂量组升高(P＜0.05).Western blotting,与正常组比,高糖组E-Cadherin蛋白表达减少,RhoA、ROCK1和α-SMA蛋白表达增加(P＜0.01);与高糖组比,各组E-Cadhenn蛋白表达增加,RhoA、ROCK1和α-SMA蛋白表达减少,高剂量组有显著差异(P＜0.01);与Y27632组比,糖肾平高剂量组ROCK1、E-Cadherin和α-SMA蛋白表达无统计学差异(P＞0.05),RhoA蛋白表达减少(P＜0.01);与厄贝沙坦组比,糖肾平高剂量组RhoA、ROCK1、E-Cadherin和α-SMA蛋白表达无统计学差异(P＞0.05).结论:糖肾平通过抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖和RhoA/ROCK信号通路相关分子的表达,从而逆转上皮-间质转分化,抑制肾间质纤维化,延缓糖尿病肾病病情进展.
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“以松治痛”推拿手法治疗腰部慢性软组织损伤的疗效及机制
目的:观察“以松治病”手法治疗腰部慢性软组织损伤的疗效,同时评价其对外周血RhoA/ROCK信号通路表达的影响.方法:选取2013年1月至2016年12月新疆维吾尔自治区中医医院收治的慢性疼痛患者70例,随机分为对照组和观察组,每组35例.对照组予以复方氯唑沙宗及功能锻炼,观察组在对照组治疗方案基础上加用松筋止痛推拿手法及柔筋补脾中药,2组均连续干预14 d,疗程结束后比较2组患者简易McGill疼痛评分、Oswestry功能障碍指数、汉密尔顿焦虑量表(HAMA)评分、汉密尔顿抑郁量表(HAMD)量表评分以及腰肌表面肌电图信号变化以及RhoA/ROCK信号通路变化情况.结果:治疗后2组患者McGill疼痛评分、Oswestry功能障碍指数均有不同程度下降,与治疗前比较,差异有统计学意义(P＜0.05),观察组下降得趋势大于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).2组患者负性情绪均有明显改善,其中观察组优于对照组(P＜0.05).治疗后2组患者竖脊肌及多裂肌的平均肌电值(AEMG)均有所上调,平均功率频率(MPF)低于治疗前,差异有统计学意义(P＜0.05),观察组改善的幅度均较对照组明显(P＜0.05).2组患者治疗后外周血单核细胞的RhoA、ROCK蛋白水平均有所下降,观察组下降较对照组明显,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:“以松治痛”手法可明显改善慢性软组织损伤的临床症状,其作用机制可能与介导RhoA/Rho信号通路有关.
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Smoothened表达对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞RhoA/ROCK通路的影响
目的：初步探讨Sonic Hedgehog（Shh）信号通路分子Smoothened（Smo）对类风湿关节炎（RA）成纤维滑膜细胞（FLS）RhoA/ROCK通路相关分子的影响。方法收集病情活动（DAS28≥3.2）RA 患者关节镜手术或关节置换术切除的滑膜组织，组织块培养法培养 RA-FLS 作为细胞模型，流式细胞术检测CD55阳性率鉴定细胞，然后分别予Smo分子激动剂Purmorphamine或抑制剂KAAD-Cyclopamine处理，应用GST-pull down法检测RhoA活性，Western blot检测ROCK活性与Smo蛋白表达。结果与对照组相比，RA-FLS经Purmorphamine刺激后，活性RhoA蛋白、磷酸化MYPT1蛋白及Smo蛋白均上调（P＜0.05）；经KAAD-Cyclopamine处理后，活性RhoA蛋白、磷酸化MYPT1蛋白及Smo蛋白均下调（P＜0.05）。结论 RA-FLS Smo表达可影响RhoA/ROCK信号的传导。Smo可能参与了RA-FLS中Shh信号通路非经典途径的调控。
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按部选穴针刺对糖尿病胃轻瘫大鼠胃窦平滑肌RhoA/ROCK信号表达的影响
目的:通过固定循经取穴配伍以不同部位选穴进行对比研究,以糖尿病胃轻瘫(diabetic gastroparesis,DGP)大鼠为观察对象,研究不同按部选穴针刺治疗对DGP大鼠RhoA/ROCK信号的表达差异,探讨按部选穴是影响腧穴配伍效应的主要影响因素.方法:将60只♂SPF级SD大鼠,适应性喂养1 wk后,随机分为空白对照组、模型组、足三里+中脘组、足三里+内关组、足三里+非经非穴组,每组1 2只,除空白对照组12只外,其余48只大鼠运用链脲佐菌素腹腔注射造糖尿病模型,普通喂养8 wk后建立DGP大鼠模型,针刺治疗4 wk,于13 wk末墨汁灌胃后处死,取胃窦组织.运用Western blot检测胃窦平滑肌组织Ras同源物基因组成员A(Ras homolog gene family,member A,RhoA)、Rho蛋白相关卷曲螺旋激酶(Rho-associatedc,oiled-coil containing protein kinase,ROCK)、肌球蛋白磷酸酶靶亚单位l (myosin phosphatase target subunit 1,MYPTl)、p-MYPT1蛋白的表达量;应用免疫组织化学检测胃窦平滑肌组织RhoA蛋白平均灰度值改变.结果:与空白对照组相比,模型组的小肠推进率、胃窦平滑肌组织RhoA、ROCK、MYPT1、p-MYPT1蛋白的表达量明显降低(P＜0.01),胃窦平滑肌组织RhoA灰度值表达升高(P＜0.05).与模型组相比,足三里+中脘组、足三里+内关组、足三里+非经非穴组的小肠推进率和胃窦平滑肌组织RhoA、ROCK、MYPT1、p-MYPT1蛋白的表达量明显升高(P＜0.05),胃窦平滑肌组织RhoA 灰度值表达均具有降低的趋势(P＜0.05).与足三里+中脘组相比,足三里+内关、足三里+非经非穴组胃窦平滑肌组织RhoA、ROCK、MYPT1、p-MYPT1蛋白的表达量降低(P＜0.05),胃窦平滑肌组织RhoA灰度值表达升高(P＜0.05).在治疗期间,与模型组相比,足三里+中脘组的饮食量明显降低(P＜0.05).结论:针刺能通过上调RhoA/ROCK信号的表达来促进胃平滑肌收缩,改善DGP的症状;证实按部选穴是影响腧穴配伍效应的重要因素,且配伍局部穴明显优于配伍远端穴及非经非穴.
关键词： 腧穴配伍 按部选穴 糖尿病胃轻瘫 针刺治疗 RhoA/ROCK信号通路 -
转染靶向RhoA基因小干扰RNA对高糖刺激下人肾小球系膜细胞RhoA/ROCK信号通路表达的影响
目的 观察小G蛋白(RhoA)小干扰RNA(Stealth RNAm siRNA)对高糖刺激下的人肾小球系膜细胞(HMC)炎症反应及纤维化的影响,探讨RhoA/ROCK信号通路在糖尿病肾病发生发展中的作用.方法 传代培养的HMC同步化后分组,LipofectaminerTM2000脂质体转染抑制RhoA表达的Stealth RNA或无关的siRNA,用荧光倒置显微镜观察各组转染效率,利用实时定量RT-PCR、ELISA技术检测RhoA、ROCK-I、纤维连接蛋白(FN)、结缔组织生长因子(CTGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达情况.结果 (1)RhoA-siRNA转染可抑制高糖刺激的HMC中P&oA、ROCK-I、CTGF mRNA的表达水平,各mRNA的表达较高糖组少26%-60%(均P<0.05).(2)RhoA-siRNA转染HMC后继续培养48 h,FN、CTGF和TNF-α仪的蛋白表达水平较高糖组明显少[FN:(1.99±0.04)mg/L比(4.31±0.13)ms/L,CTGF:(4.98-1-0.17)mg/L比(6.06±0.09)ms/L;TNF-α:(61.17±2.59)ns/L比(91.76±2.27)ng/L;均P<0.05],几乎使FN和CTGF下降到正常糖培养HMC的水平.结论 通过RNA干扰技术抑制RhoA的表达,可减少高糖刺激下HMC中FN、CTGF、TNF-α的积聚,降低细胞外基质的蓄积,减少肾小球的纤维化和炎症反应,为糖尿病肾病的防治提供新的干预靶点.
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重组人红细胞生成素对高糖诱导人肾小管上皮细胞增殖及凋亡的影响及其可能机制
目的：探讨重组人红细胞生成素（rhEPO）对高糖诱导的正常人肾小管上皮（HK-2）细胞增殖及凋亡的影响及其可能机制。方法将体外培养的HK-2细胞按随机数字表法分为空白对照组、高糖诱导组（高糖终浓度为30 mmol/L）、甘露醇对照组（甘露醇浓度为24.5 mmol/L）、rhEPO对照组（rhEPO终浓度为20 U/mL）、不同浓度rhEPO干预组（高糖终浓度为30 mmol/L+rhEPO终浓度分别为5、10、20 U/mL）及Rho激酶抑制剂（Y27632）组（Y27632终浓度为30μmol/L+高糖终浓度为30 mmol/L），各组均刺激24 h。应用 RT-PCR 法检测各组 HK-2细胞 RhoA、ROCK1 mRNA的表达；MTT法测定细胞增殖，流式细胞技术分析细胞凋亡。结果高糖诱导组RhoA及ROCK1 mRNA表达较空白对照组显著升高（P<0.05），不同浓度rhEPO干预组RhoA mRNA及ROCK1 mRNA的表达较高糖诱导组显著减少（P<0.05），高糖诱导组及不同浓度rhEPO干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA表达呈正相关。rhEPO可明显促进HK-2细胞增殖（P<0.05），而高糖可诱导正常人肾小管上皮细胞凋亡，加入不同浓度rhEPO或Y27632干预后，其凋亡明显受抑制（P<0.05），且在实验rhEPO浓度范围内，rhEPO促进增殖及抑制凋亡的作用呈现浓度依赖性。结论 rhEPO可促进高糖诱导的HK-2细胞增殖，抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡，其机制可能与阻断RhoA/ROCK信号通路有关。
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葶苈生脉方对充血性心力衰竭大鼠心肌RhoA/ROCK信号通路的干预效应
目的:研究葶苈生脉方对充血性心力衰竭(CHF)大鼠左心室肌RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表达的影响,探讨其防治心肌重塑的作用机制.方法:将健康雄性SD大鼠随机分为5组,假手术组、模型组、葶苈生脉方低剂量组、高剂量组和对照组.除假手术组只分离腹主动脉不结扎外,其余4组采用腹主动脉缩窄法制作CHF大鼠模型.5组均于手术后4周开始灌胃、腹腔注射给药(水),连续8周.停药(水)24h后迅速股动脉取血及左心室组织剥离,采用放射免疫分析法检测血浆AngⅡ含量,Western Blotting技术测定RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白的表达.结果:与假手术组比较,模型组大鼠血浆AngⅡ含量,心肌组织RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表达均明显增高(P＜0.01).与模型组比较,各给药组大鼠心肌组织RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表达均显著降低(P＜0.01),葶苈生脉方低剂量组、高剂量组大鼠血浆AngⅡ含量降低(P＜0.01).结论:葶苈生脉方通过调节RhoA/ROCK信号通路,降低RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表达,改善心肌重塑,从而有效缓解大鼠CHF.
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人红细胞生成素对高糖诱导肾近曲小管上皮细胞转分化过程中炎性因子的影响及其可能机制
目的：探讨重组人红细胞生成素（ rhEPO）对高糖诱导的正常人肾小管上皮细胞（ HK-2细胞）转分化过程中炎性因子的变化及其可能机制。方法体外培养HK-2细胞，采用随机数字表法分为空白对照组（未加任何刺激物）、高糖诱导组（高糖终浓度为30 mmol/L）、甘露醇对照组（甘露醇为24.5 mmol/L）、rhEPO对照组（ rhEPO终浓度为20 U/ml ）、不同浓度 rhEPO 干预组（ rhEPO 终浓度分别为5、10、20 U/ml +高糖）及 Rho 激酶抑制剂（Y27632）组（Y27632终浓度为30μmol/L，加入Y2763230 min后加高糖，高糖终浓度为30 mmol/L），以上各组均培养24 h。采用RT-PCR检测各组细胞RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达水平；采用细胞免疫荧光法检测E-钙黏蛋白（E-cadherin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达水平；采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测人纤维连接蛋白（FN）、白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的蛋白表达水平。结果各组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达比较，差异均有统计学意义（ P<0.05）；其中高糖诱导组与5 U/ml rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均高于空白对照组，10 U/ml rhEPO组、20 U/ml rhEPO组及Rho激酶抑制剂组RhoA、ROCK1 mRNA表达均低于空白对照组（P<0.05）；不同浓度rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均低于高糖诱导组（P<0.05），Rho激酶抑制剂组ROCK1 mRNA表达低于高糖诱导组（ P<0.05）；10 U/ml rhEPO组与20 U/ml rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均低于5 U/ml rhEPO组（P<0.05）；20 U/ml rhEPO组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达均低于10 U/ml rhEPO组（P<0.05）。各组α-SMA、E-cadherin、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其中高糖诱导组、不同浓度rhEPO组、Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均高于空白对照组， E-cadherin均低于空白对照组（ P<0.05）；不同浓度rhEPO组、Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于高糖诱导组，E-cadherin均高于高糖诱导组（P<0.05）；10 U/ml rhEPO组、20 U/ml rhEPO组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于5 U/ml rhEPO组，E-cadherin均高于5 U/ml rhEPO组（P<0.05）；Rho激酶抑制剂组α-SMA、FN蛋白表达均低于5 U/ml rhEPO组，E-cadherin均高于5 U/ml rhEPO组（P<0.05）；20 U/ml rhEPO组α-SMA、FN、IL-6及TNF-α蛋白表达均低于10 U/ml rhEPO组，E-cadherin均高于10 U/ml rhEPO组（P<0.05）；Rho激酶抑制剂组α-SMA、E-cadherin、FN蛋白表达均低于10 U/ml rhEPO组（P<0.05）。Pearson直线相关结果分析，高糖诱导组、不同浓度rhEPO干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA表达水平呈正相关（ r=0.885、0.901、0.886、0.868，P<0.05）。结论 rhEPO可抑制高糖诱导的HK-2细胞转分化，rhEPO还可以通过减少炎性因子的产生，减轻炎性反应，从而延缓糖尿病肾病（ DN）的进展，延缓肾间质纤维化，其机制可能与RhoA/ROCK信号通路有关。
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全反式维甲酸对高糖诱导的HK－2细胞外基质合成的影响及可能机制
目的：探讨全反式维甲酸（ATRA）对高糖诱导 HK－2细胞外基质合成的影响及其在延缓糖尿病肾病肾间质纤维化中的可能作用机制。方法将体外培养的 HK－2细胞随机分为七组：A 组（5．5 mmol ／L D－葡萄糖）、B 组（30 mmol ／L D－葡萄糖）、C 组（5．5 mmol ／L D－葡萄糖＋24．5 mmol ／L甘露醇）、D 组（10－7 mol ／L ATRA＋30 mmol ／L 高糖）、E 组（10－6 mol ／L ATRA＋30 mmol ／L 高糖）、F 组（10－5 mol ／L ATRA＋30 mmol ／L 高糖）、G 组（10μmol ／L Y－27632＋30 mmol ／L 高糖），各组细胞均培养48 h。应用 ELISA 法检测细胞培养液结缔组织生长因子（ CTGF）和Ⅳ型胶原的表达水平；RT－PCR 法检测细胞 RhoA、ROCK1的表达水平。结果B 组 RhoA mRNA 及 ROCK1 mRNA 的表达较 A 组显著升高（ P＜0．05），D、E、F 组 RhoA mRNA 及 ROCK1 mRNA 较 B 组均表达减少（P＜0．05），且随着 ATRA 浓度的升高呈现剂量依赖性。 G 组 RhoA mRNA 的表达与 B 组无明显差异，但ROCK1 mRNA 的表达较 B 组显著减少（P＜0．05）；直线相关分析显示高糖组，D、E、F 组 RhoA mRNA 与 ROCK1 mRNA 表达呈正相关（r ＝0．854，P ＝0．030；r ＝0．895，P ＝0．016；r ＝0．883，P ＝0．020；r＝0．867，P ＝0．025）；ELISA 结果显示 D、E、F 组及 G 组 CTGF、Ⅳ型胶原表达较 B 组显著下降（ P＜0．05），且下降程度与 ATRA 浓度呈现剂量相关性。结论ATRA 在一定浓度范围内可抑制高糖诱导的 HK－2细胞外基质的合成，延缓肾间质纤维化，其机制可能与抑制 RhoA ／ROCK 通路有关。
关键词： 高糖 全反式维甲酸 RhoA/ROCK信号通路 HK-2细胞 -
车前草总黄酮对大鼠前列腺增生的治疗作用及机制
目的：探讨车前草总黄酮对大鼠前列腺增生（ BPH）的治疗作用及机制。方法清洁级雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、法舒地尔组、车前草总黄酮低、中、高剂量组（n＝8）。除对照组外，其余各组大鼠皮下注射丙酸睾酮（7.5 mg／kg，1次／d，连续10 d）复制BPH模型，车前草总黄酮组分别给予车前草总黄酮灌胃治疗（分别给予1 mg／kg、10 mg／kg和50 mg／kg灌胃，1次／d，持续60 d），法舒地尔组给予法舒地尔（5 mg／kg，1次／d，持续60 d）灌胃治疗。分析各组大鼠前列腺湿重、前列腺指数、RhoA／ROCK通路蛋白及细胞凋亡蛋白的表达。结果研究发现前列腺增生大鼠前列腺湿重及前列腺指数水平明显升高，促进凋亡蛋白 Caspase-3、Caspase-9及 Bax 蛋白水平明显升高而抑制凋亡蛋白 Bcl-2表达明显降低， RhoA-ROCK1／2和肿瘤坏死因子（TNF）-α表达明显升高而转化生长因子（TGF）-β表达明显降低（P＜0.01）；而车前草总黄酮能够有效改善上述指标的异常（ P＜0.01），且高剂量组比中剂量和低剂量组效果更显著（ P＜0.01）。结论车前草总黄酮能够通过抑制RhoA／ROCK通路蛋白和细胞凋亡过程发挥改善丙酸睾酮引起的大鼠BPH病理过程。
关键词： 前列腺增生 车前草总黄酮 法舒地尔 RhoA/ROCK信号通路 细胞凋亡 -
四逆汤抑制RhoA/ROCK信号通路改善大鼠心肌纤维化
目的 探究四逆汤(附子、干姜、甘草)对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌纤维化的影响.方法 40只SD大鼠随机分为空白组、模型组、卡托普利组[100 mg/(kg·d)]、四逆汤组[3.8 g/(kg·d)],每组10只.除空白组外,其余大鼠皮下注射异丙肾上腺素[5 mg/(kg·d)]制备心肌纤维化模型,连续给药4周.末次给药后20 h,检测心脏血流动力学变化,计算心脏质量指数,苏木精-伊红(HE)染色及Masson染色观察心肌病理形态学变化,硝酸还原酶法检测血清中NO水平,黄嘌呤氧化酶法检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力,硫代巴比妥酸法检测血清中丙二醛(MDA)水平,Western blot法检测心肌组织中RhoA、ROCK1、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白的表达.结果 与模型组比较,四逆汤组大鼠心脏功能明显改善,心肌胶原含有量明显减少,血清中MDA水平明显降低,NO水平及SOD活力显著提高,心肌组织中RhoA和ROCK1蛋白的表达显著下降,eNOS蛋白的表达显著升高.结论 四逆汤能改善异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌纤维化,其机制可能与抑制了RhoA/ROCK信号通路,进而上调了eNOS的表达后,导致氧化应激减少有关.
关键词： 四逆汤 心肌纤维化 RhoA/ROCK信号通路 eNOs -
甜菜碱调控RhoA/ROCK信号通路抑制大鼠急性心肌缺血损伤
目的 探讨从枸杞中分离得到的甜菜碱对异丙肾上腺素(ISO)诱导的大鼠急性心肌缺血损伤的保护作用机制.方法 大鼠分别灌胃给予不同剂量甜菜碱(100、200和400 mg/kg)共40 d,于第39天和第40天皮下注射ISO85 mg/(kg·d)诱发大鼠急性心肌缺血.取大鼠心肌组织进行病理学观察,ELISA法测定血清TGF-β1与ET-1的水平,并采用Western-blot法测定相关蛋白的表达.结果 与模型组比较,甜菜碱(100、200和400 mg/kg)明显改善心肌组织坏死,炎细胞浸润及间质水肿.甜菜碱(100、200、400 mg/kg)可明显降低血清TGF-β1及ET-1的水平(P＜0.01),抑制心肌组织RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白表达的升高(P＜0.01).结论 甜菜碱可通过调控RhoA/ROCK信号通路保护ISO诱导的大鼠急性心肌缺血损伤.
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丹参酚酸B盐抑制大鼠肝星状细胞中内皮素-1激活的RhoA／ROCK Ⅱ信号通路
目的：探讨丹参酚酸B盐（Sal B）对大鼠肝星状细胞（HSC）中内皮素-1（ET-1）激活的RhoA/ROCK 信号通路的影响。方法采用肝脏原位灌流酶消化、Nycodenz密度梯度离心法分离大鼠 HSC。免疫蛋白印迹法检测肌球蛋白磷酸酶靶亚基1（MYPT1）磷酸化。特异性抗体沉淀ROCK，进行体外磷酸化反应，以磷酸化底物Thr696-MYPT1（654-880）的含量反映ROCK活性。GST下拉实验检测RhoA活性。结果在大鼠HSC中，ET-1刺激后，RhoA和ROCK II活性显著增加，ROCK I活性无明显变化，MYPT1 Thr696和Thr850磷酸化水平均显著增加。ET-1刺激1 min和10 min时，RhoA活性分别是基础状态下的1．95倍（P＜0．05）和5．84倍（P＜0．01）。ET-1刺激2．5 min和15 min时，ROCK II 活性分别是基础状态下的3．49倍和4．83倍，均P＜0．01，差异有统计学意义。ET-1刺激2．5 min时，MYPT1 Thr696磷酸化水平是基础状态下的3．86倍；刺激15 min 时，Thr696磷酸化达到高峰，是基础状态下的5．17倍。Thr850磷酸化亦在 ET-1刺激15 min达到高峰，是基础状态下的3．33倍，均P＜0．01，差异有统计学意义。在ET-1刺激前给予10-5mol/L Sal B预处理，则使ET-1诱导的RhoA和ROCK II活性分别下降66．84％和76．79％，ET-1诱导的MYPT1 Thr696磷酸化下降80．09％，对Thr850磷酸化水平无影响。结论 Sal B 能显著抑制大鼠 HSC 中 ET-1诱导的 RhoA 和 ROCK II 活化，抑制 MYPT1 Thr696磷酸化。
关键词： 肝星状细胞 内皮素-1 丹参酚酸B RhoA/ROCK信号通路 -
RhoA/ROCK信号通路在糖尿病结肠肌层中的表达
背景：糖尿病（ DM）胃肠动力障碍的机制目前尚不明确，越来越多的研究认为胃肠平滑肌肌源性因素在该病的发生中起重要作用。近年RhoA/ROCK信号通路在DM并发症中的作用成为研究热点。目的：分析DM患者结肠肌层中RhoA/ROCK信号通路主要信号分子的表达变化，探讨该信号通路在DM结肠动力障碍中的可能作用。方法：收集2012年9月-2013年12月南京医科大学第一附属医院行结肠癌根治术患者的正常结肠组织，根据糖化血红蛋白水平，将患者分为DM组和对照组。采用免疫组化或蛋白质印迹法检测结肠肌层中RhoA/ROCK信号通路主要信号分子RhoA、ROCK1、MYPT1和p-MYPT1的表达情况。结果：免疫组化结果显示DM组结肠肌层中RhoA表达明显低于对照组，差异有统计学意义（ P＜0.05）；蛋白质印迹法结果显示，与对照组相比，DM组RhoA、ROCK1和p-MYPT1蛋白表达均明显减少（0.62±0.42对1.15±0.69，0.54±0.09对0.75±0.05，0.70±0.28对1.04±0.47；P＜0.05），而MYPT1蛋白表达差异无统计学意义（0.94±0.50对1.21±0.80，P＞0.05）。结论：DM患者结肠肌层中RhoA/ROCK信号通路活性被抑制，可能与DM结肠动力障碍有一定相关性。
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梅毒螺旋体膜蛋白Tpp47通过RhoA/ROCK信号通路调控血管内皮细胞通透性
目的 探讨梅毒螺旋体膜重组蛋白Tpp47对血管内皮细胞通透性影响的调控机制.方法 用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)构建细胞单层模型,重组蛋白Tpp47(rTpp47)直接与HUVEC单层模型混合培养,或RhoA/ROCK信号通路特异性抑制剂Y-27632预处理后再用rTpp47刺激HUVEC单层模型,以煮沸灭活的rTpp47处理HUVEC单层模型为阴性对照组,采用ELISA检测各组培养1、4h时辣根过氧化物酶(HRP)流量,培养12h用荧光染料罗丹明-鬼笔环肽染色细胞骨架系统,共聚焦显微镜下观察细胞骨架蛋白F肌动蛋白排列变化.用Western印迹检测rTpp47与煮沸灭活的rTpp47分别处理HUVEC单层模型后细胞RhoA的表达水平.结果 rTpp47刺激HUVEC单层模型1h时HRP流量(0.81±0.10)高于阴性对照组(0.39±0.09),差异有统计学意义(P＜0.05),而此时Y-27632预处理组HRP流量(0.51±0.10)与单用rTpp47刺激组及阴性对照组 相比,差异无统计学意义(均P＞ 0.05).培养4h时,单用rTpp47刺激组HRP流量显著增加(2.31±0.14),且高于Y-27632预处理组(1.21±0.12)及阴性对照组(0.73±0.12),差异有统计学意义(均P＜0.05),而Y-27632预处理组与阴性对照组之间差异无统计学意义.rTpp47刺激HUVEC后,与煮沸灭活的rTpp47作用HUVEC相比,细胞中RhoA表达增加.同时,rTpp47刺激细胞中骨架蛋白F肌动蛋白重排,在胞质中形成应力纤维,抑制剂Y-27632可部分抑制F肌动蛋白重排.结论 梅毒螺旋体膜重组蛋白Tpp47可通过RhoA/ROCK信号转导通路调控血管内皮细胞通透性.
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rHuEPO 对肾间质纤维化过程中炎症因子的影响及其可能作用机制
目的：临床治疗虽可延缓肾间质纤维化进展，却无法逆转肾功能丧失。探讨重组人促红细胞生成素（ recombi-nant human erythropoietin ， rHuEPO）对肾间质纤维化过程中炎症因子的影响及其可能作用机制。方法将体外培养的HK-2细胞随机分为7组：空白对照组、rHuEPO对照组（20 U／mL rHuEPO）、清蛋白刺激组（5 mg／mL清蛋白）、5 U／mL rHuEPO干预组（5 mg／mL清蛋白＋5 U／mL rHuEPO）、10 U／mL rHuEPO干预组（5 mg／mL清蛋白＋10 U／mL rHuEPO）、20 U／mL rHuEPO干预组（5 mg／mL清蛋白＋20 U／mL rHuEPO）、Rho激酶抑制组（10μmol／L Y27632＋5 mg／mL清蛋白），各组均作用24 h。观察各组细胞形态的变化；RT-PCR检测各组细胞RhoA、ROCK1 mRNA及白细胞介素-6因子（ interleukin-6， IL-6） mRNA含量水平；ELISA检测细胞上清液中肿瘤坏死因子（ tumor necrosis factor ， TNF-α）、IL-6蛋白的含量表达。结果空白对照组、rHuEPO干预组显示鹅卵石或者铺路石样形态，清蛋白刺激组表现出细长梭状改变，呈现纤维细胞样外观。5、10、20 U／mL rHuEPO干预组细胞向鹅卵石样复转，Rho激酶抑制组细胞形态呈椭圆形、细胞间隙稍增大；与空白对照组比较，清蛋白刺激组RhoA、ROCK1 mRNA及IL-6 mRNA显著升高（P＜0．05），而5、10、20 U／mL rHuEPO干预组逐渐下调（P＜0．05），且与rHuEPO浓度负相关；与清蛋白刺激组比较，Rho激酶抑制组ROCK1 mRNA、IL-6 mRNA表达下调（P＜0．05），但RhoA mRNA表达差异无统计学意义（P＞0．05）。 ELISA结果显示：清蛋白刺激组上清液TNF-α、IL-6蛋白[（1347．54±41．52） ng／L、（884．62±0．73） pg／L]表达较空白对照组[（452．32±33．23） ng／L，（95．12±0．32） pg／L]显著增高（P＜0．05），5、10、20 U／mL rHuEPO干预组、Rho激酶抑制组TNF-α表达[（1003．32±3．42）、（821．32±21．32）、（590．15±7．68）、（488．13±65．03）ng／L）]较清蛋白刺激组[（1347．54±41．52） ng／L]下降（P ＜0．05）、IL-6蛋白表达[（656．68±0．55）、（422．35±0．22）、（217．32±0．35）、（309．49±0．21）pg／L]亦较清蛋白刺激组[（884．62±0．73）pg／L]下降（P＜0．05），5、10、20 U／mL rHuEPO干预组组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0．05）。结论 rHuEPO可能通过减少炎症因子的产生来抑制清蛋白诱导的HK-2细胞转分化过程，其作用机制部分涉及RhoA／ROCK信号通路。
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红细胞生成素对高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响及其可能机制
目的：肾间质纤维化（ renal interstital fibrosia ， RIF）的核心是肾小管上皮细胞转分化。探讨促红细胞生成素（Erythropoietin， EPO）对高糖诱导的正常人肾小管上皮细胞（human kidney cells， HK-2）转分化的影响及其可能机制。方法体外培养HK-2细胞，按随机数字表法分为空白对照组、高糖诱导组（高糖终浓度30 mmol/L）、甘露醇对照组（甘露醇浓度24．5 mmol/L）、EPO对照组（ EPO终浓度为20 U/mL）、5 U/mL EPO干预组、10 U/mL EPO干预组、20 U/mL EPO干预组及ROCK抑制剂（ Y27632）组（ Y27632终浓度为30μmol/L，加入Y2763230 min后加高糖，高糖终浓度为30 mmol/L），各组均刺激24 h。应用RT-PCR法检测细胞 RhoA mRNA、ROCK1 mRNA 的水平；细胞免疫荧光法检测细胞 E-钙黏蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（αsmoothmuscleactin，α-SMA）的表达；ELISA法检测上清液纤维连接蛋白（fibronectin， FN）的表达。结果 RT-PCR结果显示高糖诱导组RhoA mRNA及ROCK1 mRNA表达较空白对照组显著升高（1．400±0．022 vs 0．945±0．132，1．913±0．011 vs 1．007±0．002，P＜0．05）；5、10、20 U/mL EPO干预组，RhoA mRNA的表达水平（0．278±0．006、0．770±0．005、0．334±0．009）均较空白对照组（0．945±0．131）减少（P＜0．05），ROCK1 mRNA的表达水平（1．418±0．006、0．919±0．004、0．477±0．002）较空白对照组（51．007±0．002）减少（P＜0．05）；ELISA及细胞免疫荧光结果显示高糖诱导组FN、α-SMA蛋白的表达较空白对照组明显增加[（14545．53±317．27）ng/mL vs （2582．50±87．20）ng/mL，0．335±0．006 vs 0．224±0．006，P＜0．05]；直线相关性分析，高糖诱导组，5、10、20 U/mL EPO干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA表达均呈正相关（P＜0．05）。高糖诱导组α-SMA较空白对照组上升，E-钙黏蛋白较空白对照组下降（P＜0．05）；EPO干预组及ROCK抑制剂组E-钙黏蛋白表达较高糖诱导组增加，而α-SMA表达下降（P＜0．05）；ELISA结果显示，EPO干预组ROCK抑制剂组FN表达较高糖诱导组下降（P＜0．05），且下降程度与EPO浓度相关。结论 EPO可抑制高糖诱导的HK-2细胞转分化，从而延缓肾间质纤维化，其机制可能与RhoA/ROCK信号通路有关。
关键词： 红细胞生成素 高糖 转分化 RhoA/ROCK信号通路 -
RhoA/ROCK信号通路与心脏重构关系的研究进展
心脏重构是一个极其复杂的病理生理过程,在细胞水平主要表现为心肌细胞肥大和心肌纤维化,是各种心血管疾病到终末期共同的心脏改变,是影响心血管疾病患者预后的主要因素之一.目前对其发生发展机制还未完全明了,暂缺乏特异性的治疗手段,一直以来都是困扰心血管病工作者的难题.因此,对心脏重构发病机制的深入研究,将有助于对心脏重构的进一步认识及提供更多的防治手段.
关键词： 心脏重构 RhoA/ROCK信号通路 心肌纤维化 靶点治疗 -
抗血小板溶栓素对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用机制研究
目的:探讨抗血小板溶栓素( anti-platelet thrombolysin,APT)对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的机制.方法:采用 TLR4-siRNA 在体转染技术,下调大鼠脑组织中Toll样受体4( TLR4)蛋白表达.分别取野生型和TLR4下调的SD大鼠,随机分为假手术组,模型组,TLR4 阻断剂( TAK-242 2 mg/kg)组, APT 高、中、低组( 0. 02、0. 01、0. 005 mg/kg),每组8 只.线拴法建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型,G-LISA法测定大鼠脑组织中RhoA蛋白活性,Western blot 法测定脑组织中TLR4、RhoA相关卷曲螺旋形成蛋白激酶( ROCK1/2) 、磷酸化的 c-Jun 氨基末端激酶( p-JNK)蛋白表达.结果:与对照组比较,TLR4-siR-NA在体转染大鼠脑组织中TLR4 蛋白表达明显下降;在野生型大鼠中,与模型组比较,抗血小板溶栓素可明显降低脑组织中TLR4 蛋白表达,抑制RhoA活性,减少ROCK1/2、p-JNK 蛋白表达;在TLR4下调大鼠中,与模型组比较,APT对脑组织中RhoA活性,ROCK1/2、p-JNK蛋白表达无明显影响.结论:抗血小板溶栓素对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用机制主要与其抑制 TLR4/RhoA/ROCK信号通路有关.
