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Smoothened表达对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞RhoA/ROCK通路的影响
目的：初步探讨Sonic Hedgehog（Shh）信号通路分子Smoothened（Smo）对类风湿关节炎（RA）成纤维滑膜细胞（FLS）RhoA/ROCK通路相关分子的影响。方法收集病情活动（DAS28≥3.2）RA 患者关节镜手术或关节置换术切除的滑膜组织，组织块培养法培养 RA-FLS 作为细胞模型，流式细胞术检测CD55阳性率鉴定细胞，然后分别予Smo分子激动剂Purmorphamine或抑制剂KAAD-Cyclopamine处理，应用GST-pull down法检测RhoA活性，Western blot检测ROCK活性与Smo蛋白表达。结果与对照组相比，RA-FLS经Purmorphamine刺激后，活性RhoA蛋白、磷酸化MYPT1蛋白及Smo蛋白均上调（P＜0.05）；经KAAD-Cyclopamine处理后，活性RhoA蛋白、磷酸化MYPT1蛋白及Smo蛋白均下调（P＜0.05）。结论 RA-FLS Smo表达可影响RhoA/ROCK信号的传导。Smo可能参与了RA-FLS中Shh信号通路非经典途径的调控。
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Smo siRNA对裸鼠食管癌移植瘤细胞凋亡的影响
目的:探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人食管癌裸鼠移植瘤细胞凋亡影响.方法:使用Smo siRNA转染人食管癌EC9706细胞,设无关序列组和空白对照组为对照,将转染好的细胞注射到裸鼠肩胛旁区,4 wk后取瘤组织.采用免疫组织化学SP法、Western blot方法检测裸鼠移植瘤组织中Smo、Glil蛋白的表达;应用原位杂交、半定量RT-PCR方法检测裸鼠移植瘤组织中Smo、Glil mRNA的表达；运用TUNEL法和透射电镜等方法观察裸鼠移植瘤细胞的凋亡情况.结果:转染siRNA后,免疫组织化学和原位杂交结果显示,3组组织中siRNA干扰组Smo蛋白(8.37±1.73)及mRNA(2.32±0.63)、Glil蛋白(3.53±0.37)及mRNA(3.35±0.87)阳性表达细胞数均低于对照组(无关对照组Smo蛋白及mRNA分别为8.42±1.49、9.61±0.85,空白对照组Smo蛋白及mRNA 8.37±1.73、9.82±0.63;无关对照组Glil蛋白及mRNA分别为0.89±0.06、8.41±1.64,空白对照组Glil蛋白及mRNA 0.91±0.05、8.53±1.38),且差异均具有统计学意义(P＜0.05); Western blot及RT-PCR结果显示,与对照组相比(无关对照组Smo蛋白及mRNA分别为9.61±0.85、0.89±0.06;空白对照组Smo蛋白及mRNA为0.91±0.05、0.96±0.07;无关对照组Glil蛋白及mRNA分别为0.87±0.08、0.89±0.07,空白对照组Glil蛋白及mRNA分别为0.84±0.06、0.87±0.06;siRNA干扰组中的Smo(0.33±0.06)及mRNA(0.35±0.07)、G1i1(0.29±0.05)及mRNA(0.29±0.05)的表达量明显下调,组间两两相比差异具有统计学意义(P＜0.05)；TUNEL结果显示,siRNA干扰组凋亡率(apoptosis rate,AI)明显升高,组间两两比较AI差异具有统计学意义(P＜0.05)；透射电镜检测结果显示,实验组与对照组相比凋亡细胞数明显增多.细胞胞质固缩、电子致密度增高,可见凋亡早期细胞,染色质固缩并凝结成形态不同的块状,凋亡晚期细胞可见,细胞核裂解为碎块状,产生凋亡小体.两对照组超微结构,无明显差异,细胞膜完整,线粒体等细胞器正常,细胞核基本正常.结论:Smo siRNA可通过下调裸鼠食管癌细胞中Smo基因的表达,进而体内诱导裸鼠食管癌移植瘤细胞的凋亡.
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Hedgehog信号通路与肿瘤发生机制的研究进展
恶性肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一,确切的发病机制尚不清楚,但可以肯定的是,其形成具有多因素、多步骤的特点,涉及一系列原癌基因异常的激活以及抑癌基因突变导致的失活,从而引起一些信号转导通路的异常.近年来,通过对Hedgehog(Hh)信号通路的研究显示,Hh基因编码一系列分泌型信号蛋白,对胚胎发育过程中的细胞分化和增生具有重要作用,Hh信号通路的异常活化在恶性肿瘤的发生发展过程中起了重要作用.信号蛋白Hh的信号通路至少包括:patched(Ptch)、smoothened(Smo)、fused(Fu)、suppressor of fused (SuFu),costaⅠ-2(Cos-2)以及cubitus interruptus(Ci)等.本文就Hh基因家族的功能及其与多种人类恶性肿瘤发生相关的机制作一简要综述.
关键词： Hedgehog信号通路 Patched Smoothened Gli 肿瘤 -
肾透明细胞癌组织SMO表达与肾癌细胞增殖和凋亡的相关性
目的 Hedgehog信号通路参与了肿瘤的发生发展,本研究探讨该通路关键信号分子Smoothened(SMO)在肾透明细胞癌中的表达及对肾癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 选取2012-01-01-2013-06-30青岛大学附属医院泌尿外科,行手术治疗的80例肾透明细胞癌患者的临床及病理资料,采用免疫组织化学方法检测SMO在肾透明细胞癌组织中的表达并分析其与临床病理特征间的关系.采用小干扰RNA下调SMO在人肾癌细胞786-O中的表达,分别应用CCK-8法、流式细胞术及蛋白质印迹法检测下调SMO表达对细胞增殖、凋亡及Gli1和Gli2表达的影响.结果 SMO在73例(91.25％)肾透明细胞癌组织中有表达,其在高级别肾癌中表达(80.49％)较低级别(56.41％)显著升高,x2 =5.39,P=0.02.RT-PCR 检测结果显示,SMO在人肾癌细胞系786-O中表达量为0.704±0.059;蛋白质印迹结果显示,SMO在786-O中表达量为0.651±0.074.在786-O细胞中应用小干扰RNA沉默SMO表达后,实验组细胞相较于对照组其活力百分比在48、72和96 h分别为92.7％、80.9％和79.9％,3个时间点差异有统计学意义(P=0.003),细胞凋亡显著增加,t=-29.2,P＜0.001;与空白对照组和阴性对照组相比,其下游分子Gli1和Gli2蛋白表达明显减少(Gli1:3.2 vs 2.9 vs1;Gli2:2.5 vs 2.1vs 1).结论 SMO可能通过调控细胞增殖和凋亡,以及调节Gli蛋白表达参与了肾癌的发生发展.
关键词： 肾细胞癌 Smoothened 细胞增殖 凋亡 RNA干扰 -
Smoothened、STAT3和MMP-9在三阴性乳腺癌中的表达及临床意义
目的：探讨Smoothened （ SMO）、STAT3和MMP-9蛋白在三阴性乳腺癌组织中的表达及临床意义。方法：应用免疫组织化学SP法检测33例三阴性乳腺癌、30例乳腺增生及18例癌旁正常乳腺组织中SMO、STAT3、MMP-9蛋白的表达情况，并分析它们与三阴性乳腺癌临床病理因素及预后的关系。结果：在三阴性乳腺癌和乳腺增生组织中SMO蛋白的阳性表达率分别为90．9％和60．0％，STAT3蛋白的阳性表达率分别为96．9％和73．3％，MMP-9蛋白的阳性表达率分别为90．9％和36．7％，三者在正常乳腺组织中均无表达；SMO、STAT3和MMP-9蛋白表达在三阴性乳腺癌、乳腺增生及正常乳腺组织中均有显著差异（P＜0．05）。 SMO和STAT3的表达与乳腺癌组织学分级、pTNM分期有关（P＜0．05），其表达均随着组织学分级和临床分期的增高而增高；MMP-9的表达与淋巴结转移有关（P＜0．01）。 SMO和STAT3（r＝0．361，P＜0．05）、SMO和MMP-9（r＝0．633，P＜0．01）、MMP-9和STAT3（r＝0．803，P＜0．01）在三阴性乳腺癌中的表达均呈正相关。 SMO的表达及pTNM分期与三阴性乳腺癌患者的生存时间有关（P＜0．05）。结论：SMO、STAT3和MMP-9在三阴性乳腺癌发生发展过程中可能具有重要作用，可作为三阴性乳腺癌患者治疗的重要靶标。
关键词： 三阴性乳腺癌 Smoothened STAT3 MMP-9 -
胰腺癌SMO靶标治疗研究启示:从中药中发现新药
跨膜蛋白Smoothened(SMO)是音猬因子(sonic hedgehog homology,SHH)信号转导通路的主要成员,在SHH通信过程里发挥桥梁作用.在多种肿瘤组织中均可以检测到SHH的异常表达,胰腺癌干细胞SHH信号的表达明显高于普通胰腺癌细胞.SHH信号与肿瘤干细胞的自我复制,肿瘤血管和基质形成密切相关.使用以环巴胺、GDC-0449等SMO拮抗剂可以抑制SHH信号的异常转导,有效阻止肿瘤的生长和转移.目前已有多种SMO拮抗剂作为抗肿瘤药物进入Ⅰ期或Ⅱ期临床试验,已经有以SMO拮抗剂治疗胰腺癌的Ⅰ期临床试验.作为经典的SMO拮抗剂,环巴胺是从传统药用植物中提取出来的生物碱,这可能为中医药研究者提供思路,从中药中研发更加有效的SMO拮抗剂.
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Smo基因在小鼠胚胎颌面部的表达
目的:探讨Smoothened(Smo)基因在小鼠胚胎颌面部正常发育中的表达.方法:应用免疫组织化学ABC法和图像分析系统研究Smo基因在小鼠胚胎11.5、13.5及17.5d颌面部的表达情况.结果:Smo基因在胚胎11.5、13.5及17.5d的颌面上下颌突均有表达,且较对照组有显著性差异(P＜0.05),但在上下颌突之间表达没有显著性差异,在上皮和结缔组织之间表达基本无差异.结论:Smo基因在小鼠胚胎颌面部正常发育有明显表达,提示Smo基因可能参与颌面部生长发育.
关键词： Smoothened 小鼠胚胎 颌面部 免疫组化 图像分析 -
sonic hedgehog信号通路蛋白在人胚胎前列腺发育不同阶段的表达及意义
目的:探明sonic hedgehog信号通路中几个关键的效应蛋白sonic hedgehog(SHH)、Patchedl(PTC1)、Smoothened(SMO)及GLI1在人胚胎前列腺组织中的定位表达及变化.方法:应用免疫组织化学方法研究SHH、PTC1、SMO及GLI1在不同胎龄(10～39周)人胚胎前列腺组织中的表达变化情况.结果:随胎龄增大,SHH、PTC1、SMO及GLI1在前列腺组织中的表达水平呈由弱变强,由强渐弱,又由弱转强的双峰变化趋势.SHH和SMO仅表达在胚胎前列腺上皮细胞中;而PTC1和GLI1主要表达在上皮细胞外,也可表达在腺体周围的间质中.结论:SHH信号通路参与了人胚胎前列腺发育的调控过程,可能对于腺体发育初期的诱导发生,以及后期的增殖、分化都具有重要的调控作用.
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Hedgehog信号通路在人牙周膜干细胞应力成骨中的作用及转导机制
目的 探讨Hedgehog信号通路在人牙周膜干细胞(PDLSCs)应力成骨中的作用及转导机制.方法 通过构建人SMO基因的siRNA慢病毒表达载体,感染人牙周膜干细胞,应用Flexcell FX-4000T应力加载系统分别对感染后的PDLSCs施加大型变量12％,小型变量0的正弦波,频率0.1Hz的张应力,提取加力0、6、12、24小时后的蛋白,采用Western印迹法检测Hedgehog重要信号分子Gli-1、Patch1、SMO的表达,同时检测成骨分化因子Runx2、ALP的表达.结果 SMO基因沉默后,与对照组相比,SMO特异性siRNA慢病毒组成骨分化因子Runx2、ALP表达减弱,重要信号分子Gli-1、Patch1表达也显著减弱.结论 Hedgehog信号通路调控了PDLSCs的应力成骨过程,这种调控作用主要表现在成骨分化的早期,且应力刺激12小时时具有较强的促成骨分化作用.
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人类肿瘤组织及肿瘤细胞系中Smoothened第十外显子基因序列变异的检测
目的 研究Hedgehog (Hh)信号通路中的重要作用分子Smoothened (SMO)第10外显子基因序列变异在人类肝、肺、胃、卵巢肿瘤及5种肿瘤细胞系中存在的状况.方法 提取人类肝、肺、胃、卵巢肿瘤组织及5种肿瘤细胞系的基因组DNA,对基因组DNA中SMO第10外显子进行PCR体外扩增,然后进行DNA测序,对测序结果进行序列比对分析.结果 测序结果显示,在2例胃肿瘤组织中存在SMO第10外显子序列的变异,分别为1958C→T,1971A→G,胃肿瘤细胞系AGS中也存在SMO第10外显子序列的变异2002T→C( rs2016607).结论 在胃肿瘤中存在SMO基因序列的变异,而其基因的改变与SMO构象和活性存在一定关系,从而为进一步研究人类胃肿瘤的发生与SMO基因序列变化之间的相关性提供依据.
关键词： Hedgehog Smoothened 外显予 寡核苷酸序列分析 -
Smoothened shRNA载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖的影响
目的 构建并筛选Smoothened(SMO)基因的RNAi表达质粒,了解Hedgehog信号通路影响乳腺癌细胞增殖的作用机制.方法 以脂质体LipofectaminemTM 2000介导转染乳腺癌MCF-7细胞.转染后48 h,采用实时定量RT-PCR技术检测转染细胞中SMO基因mRNA的转录水平,筛选有效的SMO RNAi质粒,Western blot检测SMO蛋白在乳腺癌MCF-7细胞中的表达,CCK-8法比较转染前后乳腺癌细胞增殖变化,实时定量RT-PCR检测SMO短发夹状RNA(shRNA)对cyclinD1 mRNA表达的影响.结果 4个SMO shRNA表达载体SMO shRNA-1、SMO shRNA-2、SMO shRNA-3和SMO shRNA-4经测序鉴定证明插入正确.转染48 h后,与MOCK组相比,SMO shRNA-1、SMOshRNA-3、SMO shRNA-4组SMO mRNA表达量均下降(P=0.015、0.002、0.000),其中转染SMO shRNA-4的MCF-7细胞中SMO mRNA表达水平低于SM0 shRNA-1、SMO shRNA-2、sMO shRNA-3组(P=0.007、0.000、0.046).SMOshRNA-4干扰抑制效率为87%.Western blot可检测到SMO在MCF-7中的表达,干扰片段SMO shRNA-4的抑制效果较好.转染SMO shRNA-4的MCF-7细胞增殖受到明显抑制(P<0.01),转染SMO shRNA后cyclinD1 mRNA表达下降(P=0.000).结论 已成功构建并筛选出SMO基因的RNAi表达质粒,SMO shRNA对乳腺癌细胞增殖有明显的抑制作用,Hedgehog信号通路可通过活化cyclinD1诱导细胞恶性增殖.
关键词： Smoothened shRNA 载体构建 增殖 CyclinD1 -
音猬因子、Smo、胶质母细胞瘤转录因子基因在胰腺癌中的表达及临床意义
目的 检测音猬因子(Shh)、Smoothened (Smo)、胶质母细胞瘤转录因子(Gli1)在胰腺癌组织和癌旁组织中表达的差异,探讨Shh、Smo、Gli1在胰腺癌中异常表达与肿瘤发生的关系.方法 选取50例手术切除的新鲜胰腺癌组织和癌旁组织,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和Western blot检测胰腺癌组织和癌旁组织中Shh、Smo、Gli1 mRNA和蛋白的表达,并分析其与胰腺癌临床病理特征之间的关系.结果 RT-PCR检测结果显示:Shh、Smo、Gli1 mRNA在胰腺癌组织中的相对表达量分别为0.309 ±0.162、0.327±0.264、0.341 ±0.132,在胰腺癌旁组织中为0.184±0.227、0.148 ±0.276、0.105±0.351(P＜0.05).Western blot检测结果显示:Shh、Smo、Gli1蛋白在胰腺癌组织中的相对表达量分别为0.624 ±0.139、0.547 ±0.418、0.563 ±0.271,在胰腺癌旁组织中为0.388 ±0.294、0.294 ±0.152、0.328 ±0.129(P＜0.05).胰腺癌组织中Shh、Smo、Gli1 mRNA与蛋白表达均高于癌旁组织.胰腺癌组织中Shh、Smo、Gli1 mRNA与蛋白表达均与胰腺癌的分化程度相关(P＜0.05),与患者年龄、肿瘤直径、TNM分期、侵犯血管和神经、淋巴结转移、远处转移无相关(P＞0.05).结论 Shh、Smo、Gli1信号分子在胰腺癌组织中表达增高,Hedgehog信号途径可能在胰腺癌发生发展过程中起重要作用.
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Hedghog信号通路与肿瘤发生
0 引言Hh是由英文"刺猬"(hedgehog)简写而来的.这类基因早是在果蝇里发现,果蝇和其他动物一样身体分成多个节段,幼虫的每个节段内一部分有毛、一部分无毛,Hh基因突变使无毛部分变成有毛部分,所以被戏称为"刺猬"基因.果蝇Hh基因是美国霍普金斯大学毕淇实验室在90年代初克隆的,在果蝇只有一个Hh基因,以后多个实验室在高等动物发现有三个Hh基因.Hedgehog通路不仅在胚胎正常发育中起着重要作用,通路的异常还可引发畸形和肿瘤.本文就Hedgehog通路的构成、途径及在胚胎发育和肿瘤形成中的作用、肿瘤治疗的进展进行综述.
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人microRNA-338-3p慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定
目的 构建人microRNA-338-3p (has-miR-338-3p)慢病毒表达载体并初步筛选鉴定miR-338-3p的靶基因.方法 由miRBase数据库查找获得miR-338-3p前体序列,设计目的基因片段并人工合成；将miR-338-3p前体序列和pLV-THM载体经双酶切后连接,产生pLV-THM-miR-338-3p慢病毒表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆；以pLV-THM-miR-338-3p、psPAX2和pMD2.G质粒共转染包装细胞293T,包装产生慢病毒并测定滴度.流式细胞仪筛选建立稳定过表达miR-338-3p的SW-620亚细胞系,利用Real-time RT-PCR检测miR-338-3p表达,Western-blot检测SMO蛋白表达水平,Transwell小室穿透实验检测肿瘤细胞转移能力.结果 经双酶切鉴定和测序证实,成功构建了miR-338-3p的慢病毒表达载体pLV-THM-miR-338-3p,倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293T表达绿色荧光.稳定过表达miR-338-3p的SW-620亚细胞系中,miR-338-3p表达水平显著高于阴性对照组和未处理组,SMO蛋白表达水平明显下降,且肿瘤细胞表现出侵袭转移能力的减弱.结论 成功构建了has-miR-338-3p慢病毒表达载体和稳定过表达miR-338-3p的SW-620亚细胞系,初步证实miR-338-3p可通过抑制结直肠癌细胞中SMO蛋白表达而抑制肿瘤细胞转移,此为进一步深入研究miR-338-3p在结直肠癌中生物学功能奠定了基础.
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Smoothened慢病毒干扰载体的构建及其对人牙周膜干细胞增殖与分化的影响
目的 体外构建及筛选人Smoothened(SMO)基因的慢病毒干扰载体,使用此载体下调人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem ceils,PDLSCs)中SMO基因表达并检测其对细胞增殖与分化的影响.方法 针对人SMO 基因设计3条干扰序列,构建RNA干扰慢病毒载体,在293FT细胞中包装病毒液并转染293A细胞,通过实时荧光定量PCR检测干扰效率,得到具有佳干扰效率的病毒后,转染PDLSCs,用Western blot检测其对PDLSCs中SMO基因的干扰效果及对细胞分化的影响,CCK-8法检测其对PDLSCs增殖的影响.结果 成功构建3个SMO慢病毒干扰载体(pGP-SMO1、pGP-SMO2、pGP-SMO3),通过转染293A细胞并进行实时荧光定量PCR检测后,得到pGP-SMO1具有佳干扰效率,转染后SMO mRNA水平下降到对照的(28.5±2.5)％.利用此病毒能够很好地转染体外培养的PDLSCs,并使PDLSCs中SMO蛋白水平下降80％.进一步检测细胞增殖发现,与未转染组比较,SMO下调后PDLSCs增殖变慢[(1.09±0.20) vs (1.86±0.21),P＜0.01].同时也导致成骨分化标志物Runx2的蛋白表达下调.结论 利用慢病毒介导的干扰病毒载体成功干扰了PDLSCs SMO基因的表达,SMO基因的下调会导致PDLSCs增殖减慢,成骨分化能力减弱.
关键词： Smoothened RNA干扰 慢病毒 人牙周膜干细胞 -
音猬因子、Smo基因在宫颈鳞状细胞癌中的表达及临床意义
目的:探讨音猬因子(Shh)、Smoothened(Smo)基因在宫颈鳞状细胞癌中的表达及意义.方法:采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Westem blot检测76例宫颈鳞状细胞癌组织和42例正常宫颈组织中Shh、Smo mRNA和蛋白的表达情况.结果:RT-PCR检测结果显示,Shh、Smo mRNA在宫颈鳞状细胞癌中相对表达量分别为0.715±0.048、0.638±0.037,在正常宫颈组织中分别为0.341±0.072、0.311±0.051(P<0.05).Western blot检测结果显示,Shh、Smo蛋白在宫颈鳞状细胞癌中的相对表达量分别为0.568±0.013、0.521±0.056,在正常宫颈组织中分别为0.281±0.047、0.252±0.064(P<0.05).宫颈鳞状细胞癌组织Shh、Smo mRNA和蛋白平均表达水平高于正常宫颈组织,差异有统计学意义(P<0.05);Shh、Smo mRNA和蛋白表达水平与宫颈鳞状细胞癌的分化程度明显相关(P<0.05),与患者年龄、FIGO分期、侵犯血管和神经、淋巴结转移、远处转移无明显相关(P>0.05).结论:宫颈鳞状细胞癌组织中Shh、Smo蛋白呈高表达,Shh、Smo蛋白的高表达可能与宫颈鳞状细胞癌的发生、发展及转移关系密切.
