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颈交感神经阻滞对大鼠面神经损伤修复的影响
目的：研究颈交感神经阻滞（ CSB）对大鼠面神经损伤后的修复作用机制，探讨有效治疗介入时间。方法72只SD大鼠按照随机数字表法分4组，分别为假手术组（ sham组）、模型组（ NS组）、CSB1组和CSB2组，每组均18只。除假手术组外，其余组制成大鼠面瘫模型，不同时间点给予CSB治疗，观察大鼠行为变化，检测不同时期患侧面神经电图（ ENoG）及受损侧面神经核胶质细胞源性神经营养因子（ GDNF）的表达。结果 sham组、NS组、CSB1组和CSB2组大鼠面部触须运动功能评分在7 d时分别为（3.87±0.35）、（0.50±0.52）、（1.07±0.62）和（0.81±0.42）分，差异有统计学意义（F＝2.934， P＝0.035），14 d时分别为（3.85±0.37）、（0.91±0.52）、（1.57±0.65）和（1.07±0.62）分，差异有统计学意义（F＝2.537， P＝0.038），28 d时分别为（3.85±0.37）、（1.71±0.47）、（3.00±0.68）和（2.36±0.49）分，差异有统计学意义（F＝3.627， P＝0.024）。术后7 d，NS组及CSB1、CSB2组刺激面神经均未能引起面肌的兴奋；14 d时 sham 组、NS组、CSB1组和 CSB2组的LatSD分别为（1.26±0.19）、（6.67±0.36）、（4.67±0.36）和（6.17±0.36） ms，差异有统计学意义（F＝3.052， P＝0.024），AmpSD 分别为（6.42±1.93）、（2.16±1.87）、（4.16±1.80）和（3.66±1.40）mv，差异有统计学意义（F＝3.634，P＝0.021）；28 d时LatSD 分别为（1.31±0.17）、（3.17±0.19）、（1.93±0.12）和（2.60±0.22） ms，差异有统计学意义（F＝2.729， P＝0.032），AmpSD分别为（6.82±2.30）、（4.72±5.23）、（6.22±3.50）和（5.82±4.10） mv，差异有统计学意义（F＝3.827，P＝0.019）。各组GDNF表达量7 d时分别为4.67±0.81、13.52±0.58、26.17±1.01和14.86±1.03，差异有统计学意义（F＝3.637， P＝0.028），14 d时分别为5.67±0.57、24.41±2.86、26.52±1.36和25.48±1.42，差异有统计学意义（F＝2.946， P＝0.031），28 d时分别为5.37±0.92、26.64±1.68、27.38±1.66和25.69±1.99，差异有统计学意义（F＝4.273， P＝0.012）。结论大鼠面神经损伤后早期行CSB治疗可能使受损侧面神经核GDNF表达在早期增加，从而加快损伤的面神经恢复。
关键词： 面神经损伤 神经传导阻滞 胶质细胞源性神经营养因子 -
小鼠精原干细胞生物学特征及其体外培养
精原干细胞是成年哺乳动物体内唯一能将遗传信息传递给下一代的成体干细胞,如能体外培养建系或建立其长期培养系统将会极大促进精原干细胞在生殖医学和干细胞研究中的实际应用.影响精原干细胞体外存活、增殖的因素很多,为促进精原干细胞体外培养条件优化,综述小鼠精原干细胞基本生物学特征.血清和胶质细胞源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、白细胞抑制因子等生长因子对精原干细胞体外培养的影响.以及精原干细胞在临床的应用前景.
关键词： 精原干细胞体 外培养 胶质细胞源性神经营养因子 碱性成纤维细胞生长因子 -
益智宁神颗粒对SHR大鼠前额叶-纹状体多巴胺含量、GDNF mRNA及其蛋白表达的影响
[目的]研究益智宁神颗粒对幼龄自发性高血压(SHR)大鼠前额叶-纹状体多巴胺含量、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)mRNA及其蛋白表达的影响.[方法]以32只幼年SHR大鼠为研究对象,采用随机区组法分为模型对照组、益智宁神组、盐酸哌甲酯组、托莫西汀组,另设8只京都(WKY)大鼠为正常对照组.按各组设计剂量连续给药4周后,取前额叶、纹状体,采用高效液相法检测多巴胺(DA)含量、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测GDNF mRNA表达、蛋白免疫印迹(Western blot)法检测GDNF蛋白表达.[结果]1)SHR各组大鼠前额叶、纹状体DA的含量均有低于WKY组的趋势,其中,益智宁神组大鼠前额叶DA含量明显高于模型对照组(P<0.05);益智宁神组大鼠纹状体DA含量低于正常对照组、盐酸托莫西汀组(P<0.05).2)SHR各组前额叶、纹状体GDNF mRNA表达依次为盐酸托莫西汀组>盐酸哌甲酯组>益智宁神组>模型对照组(P<0.05).3)SHR大鼠各组间前额叶、纹状体GDNF蛋白表达均高于WKY组;其中,益智宁神组前额叶GDNF蛋白表达与其余SHR大鼠各组无统计学差异(P>0.05),其纹状体GDNF蛋白表达低于盐酸哌甲酯组(P<0.05).[结论]益智宁神颗粒能够提高SHR特定脑区DA含量、GDNF mRNA及其蛋白表达,对促进幼龄SHR大鼠特定脑区DA能神经网络成熟度具有一定的作用.
关键词： 益智宁神颗粒 注意缺陷多动障碍 多巴胺 胶质细胞源性神经营养因子 SHR大鼠 -
三七三醇皂苷对糖尿病大鼠学习记忆能力及星形胶质细胞活性的影响
目的：探讨三七三醇皂苷（PTS）对糖尿病大鼠学习记忆的改善作用，并从星形胶质细胞角度揭示其机制。方法24只SD大鼠随机分为对照组、糖尿病组及PTS治疗组，每组8只。于SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病模型，对照组为正常SD大鼠，PTS治疗组为糖尿病大鼠给予PTS治疗。检测大鼠血糖和体质量，3个月后，水迷宫实验观察各组大鼠的学习记忆功能，免疫组化染色检测脑海马区星形胶质细胞形态，Western blot法检测神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）表达。结果糖尿病组较对照组学习记忆能力减退，脑海马区星形胶质细胞胞体萎缩、突起变细，脑海马区GFAP及GDNF表达明显减少（均P<0.05）。PTS组较糖尿病组学习记忆能力改善，脑海马区星形胶质细胞形态改善、GFAP及GDNF表达明显恢复（均P<0.05）。结论 PTS能恢复糖尿病大鼠脑海马区星形胶质细胞活性，恢复GDNF表达，提高糖尿病大鼠学习记忆功能。
关键词： 糖尿病 神经胶质原纤维酸性蛋白质 模型 动物 学习记忆 三七三醇皂苷 星形胶质细胞 胶质细胞源性神经营养因子 -
GDNF及其受体GFRα1在小儿肾母细胞瘤中的表达及意义
目的：研究胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）及GDNF受体α1(GFRα1)在小儿肾母细胞瘤中的表达及其临床意义。方法应用免疫组织化学法检测GDNF及其受体GFRα1在30例小儿肾母细胞瘤组织及16例瘤旁正常肾组织病理石蜡标本中的表达。结果 GDNF在肾母细胞瘤中的阳性表达率高于瘤旁正常肾组织（66.7%vs 6.3%）,GFRα1在肾母细胞瘤中的阳性表达率高于瘤旁正常肾组织（63.3%vs 6.3%）；两者在上皮型和胚芽成分强烈表达，在间叶成分表达较弱。GDNF及其受体GFRα1在不同组织分型、临床分期及有无淋巴结转移的患者间表达差异无统计学意义。结论肾母细胞瘤中GDNF及其受体GFRα1的高表达可能与肿瘤的发生密切相关。
关键词： 肾母细胞瘤 胶质细胞源性神经营养因子 GDNF受体α1 免疫组织化学 -
电针对面神经损伤兔面神经核中GDNF、CHAT表达的影响
目的 观察电针对面神经损伤兔面神经核中胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、胆碱乙酰转移酶(CHAT)表达及神经元细胞形态的影响,探讨电针对面神经损伤再生修复的作用机制.方法 将76只健康家兔随机分为假手术组、模型组、电针组、西药组,其中假手术组4只,其余每组24只.除假手术组外,其余组均制备面神经损伤模型.术后假手术组、模型组不给予干预;西药组造模后第1天开始给予维生素B110 mg、维生素 B1250 μg加地塞米松2 mg肌肉注射,1次/d,地塞米松每7 d减半,连续4周;电针组造模后第1天开始进行电针治疗,每天连续治疗30 min,治疗5 d后休息2 d,疗程4周.术后4周镜下观察面神经损伤后面神经核中神经元细胞形态,并分别于术后1,2,3,4周免疫组化法检测各组兔面神经核中GDNF、CHAT表达情况.结果 与模型组比较,电针组、西药组神经细胞轮廓结构清晰完整,肿胀、空泡数目减少,细胞数目增多.术后2,3,4周,电针组、西药组GDNF阳性表达数均明显高于模型组(P均<0.05),且电针组明显高于西药组(P均<0.05).术后1,2,3,4周,模型组CHAT阳性表达数均明显低于假手术组(P均<0.05),且呈先下降后上升的趋势;电针组、西药组CHAT阳性表达数随时间增加而增高,相邻两治疗阶段比较差异有统计学意义(P<0.05),且电针组各时间段CHAT阳性表达数均明显高于模型组和西药组(P均<0.05).结论 电针刺激有促进面神经损伤修复的作用,其机制可能与增加面神经核中GDNF、CHAT的表达有关.
关键词： 面神经损伤 电针 胶质细胞源性神经营养因子 面神经核 胆碱乙酰转移酶 -
GDNF对肠黏膜屏障影响的研究进展
肠黏膜屏障主要是指由不断更新的肠上皮细胞为结构基础构成的消化道屏障. 肠黏膜屏障是机体肠腔与微生物内环境的第一道屏障,其高度的选择渗透性保证了机体内外环境物质交换的动态平衡.胶质细胞源性神经营养因子( glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)是转化生长因子β超家族的一个远系成员,本质来说其是一种以二硫键连接而成的二聚体糖蛋白. 越来越多的研究结果显示,GDNF除参与神经细胞的存活、增殖、迁移和分化外,还对肠黏膜屏障起着积极的作用. 失去肠黏膜的完整性将会导致肠腔内有害物质进入黏膜层,持续启动炎症和组织损伤[1] ,引起炎症性肠病、乳糜泻、肠道感染、肠易激综合征等许多肠道疾病,严重者可致多器官功能障碍综合征甚至死亡. 因此,明确GDNF对肠黏膜屏障的作用机制有着十分重要的意义.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 肠黏膜屏障 肠神经胶质细胞 -
瑞芬太尼诱发切口痛大鼠痛觉过敏时切口周围皮肤artemin表达的变化
目的 评价瑞芬太尼诱发切口痛大鼠痛觉过敏时切口周围皮肤artemin表达的变化.方法 健康雄性SD大鼠32只,10～12周龄,体重250～280 g,采用随机数字表法分为4组(n=8):对照组(C组)、切口痛组(I组)、瑞芬太尼组(R组)和切口痛+瑞芬太尼组(I+R组).R组尾静脉输注瑞芬太尼1μg·kg-1·min-160 min;I组制备大鼠切口痛模型的同时尾静脉输注等容量生理盐水60 min;I+R组制备大鼠切口痛模型的同时尾静脉输注瑞芬太尼1μg·kg-1·min-160 min;C组尾静脉输注等容量生理盐水60 min.分别于输注瑞芬太尼或生理盐水前24 h、输注停止后2、6、24和48 h(T0-4)时测定机械缩足反应阈(MWT)和热缩足潜伏期(TWL).后一次测定痛阈后处死大鼠,取术侧足底皮肤,采用荧光定量PCR法与Western blot法测定足底皮肤artemin及其mRNA的表达水平.结果 与C组比较,R组、I组和I+R组T1-4时MWT降低,TWL缩短,足底皮肤artemin及其mRNA表达上调(P<0.01);与R组和I组比较,I+R组T1-4时MWT降低,TWL缩短,足底皮肤artemin及其mRNA表达上调(P<0.01).结论 瑞芬太尼诱发切口痛大鼠痛觉过敏形成的外周机制可能与切口皮肤artemin表达上调有关.
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鞘内注射GDNF对神经病理性痛大鼠脊髓背角p38MAPK蛋白表达的影响
目的 评价鞘内注射胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对神经病理性痛大鼠脊髓背角p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)蛋白表达的影响.方法 取鞘内置管成功的健康雄性SD大鼠120只,周龄6周,体重180～200 g,随机分为4组(n=30):对照组(C组)、假手术组(S组)、神经病理性痛组(P组)和GDNF组.采用结扎L5.6脊神经的方法建立大鼠神经病理性痛模型.C组不给予任何处理;S组只暴露脊神经,但不结扎;P组脊神经结扎后鞘内注射生理盐水10μl,隔日1次,连续14 d;GDNF组脊神经结扎后鞘内注射GDNF 2μg,用生理盐水稀释至10μl,隔日1次,连续14 d.分别于脊神经结扎后3、7和14 d时,取10只大鼠,测定机械痛阈,然后处死,取脊髓背角,分别采用免疫组化法和蛋白质印迹法测定p38MAPK蛋白的表达水平.结果 与S组比较,P组和GDNF组机械痛阈降低,脊髓背角p38MAPK蛋白表达上调(P＜0.05或0.01);与P组比较,GDNF组机械痛阈升高,脊髓背角p38MAPK蛋白表达下调(P＜0.05或0.01).结论 鞘内注射GDNF可通过抑制脊髓背角p38MAPK蛋白的表达减轻大鼠神经病理性痛.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 注射 脊髓 神经痛 p38丝裂原活化蛋白激酶类 -
GDNF基因修饰的骨髓基质干细胞分泌物对多巴胺能神经元的营养作用
目的:克隆GDNF基因并修饰骨髓基质干细胞,观察该工程细胞分泌物对多巴胺能神经元的营养作用.方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从新生小鼠大脑皮层细胞克隆出GDNFcDNA片断,以pECPP-C1为载体导入骨髓基质干细胞,制备稳定表达GDNF基因的MSCs工程细胞,收集并浓缩MSCs和GDNF基因修饰的MSCs工程细胞的条件培养液,通过MTT、倒置显微镜和免疫组织化学的方法观察MSCs和GDNF基因修饰的MSCs工程细胞分泌物对多巴胺能神经元的营养作用.结果:MSCs和GDNF基因修饰的MSC工程细胞分泌物均能促进多巴胺能神经元的存活和生长,MSCs工程细胞作用更强.结论:成功构建了GDNF基因修饰的MSCs工程细胞,该细胞对多巴胺能神经元有明显营养保护作用,在帕金森病治疗中可能有重要价值.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 骨髓 干细胞 基因 多巴胺能神经 -
胶质细胞源性神经营养因子对运动神经元病培养模型的保护作用
目的 利用运动神经元病的脑片和脊髓片培养模型,观察胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对运动神经元的保护作用.方法 取1日龄SD乳鼠的大脑做脑片培养,取8日龄SD乳鼠脊髓做脊髓片培养.脑片在培养2周后,脊髓片在培养1周后,随机分为对照组、模型组(100 μmol/L THA)、不同浓度GDNF组(1 ng/ml、5 ng/ml和50 ng/ml),继续培养3周后,SMI-32免疫组化染色,分别计数脑片中皮层运动神经元和脊髓片中前角运动神经元数目的变化,测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量.结果 模型组SMI-32阳性的皮层运动神经元数目和脊髓运动神经元数目较对照组明显减少,差异有显著性意义(P＜0.05),而GDNF各组神经元存活数目较模型组显著增多,差异有显著性意义(P＜0.05),脑片组和脊髓片组中的模型组LDH含量均对照组显著增高,差异有显著性意义(P＜0.05),GDNF各组培养液中LDH含量较对照组均升高,差异有显著性意义(P＜0.05).结论 GDNF能保护运动神经元免受谷氨酸兴奋毒性的损伤,使得GDNF在临床上治疗MND成为可能.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 运动神经元病 谷氨酸 脑片 脊髓片 -
髓质海绵肾的新认识
髓质海绵肾（MSK）是一种肾脏发育异常性疾病，通常表现为肾钙质沉着或肾结石、肾小管酸化和浓缩功能障碍、髓质集合管囊性扩张及尿路感染等。以前关于 MSK 发病机制的研究较少，病因不明，一般认为属于先天性疾病。近年来，随着对 MSK 的重视以及研究的深入进展，对本病有了新认识。本文着重介绍了 MSK 的发病机制、临床表现、诊断、治疗和预后，认为在肾脏发育过程中，胶质细胞源性神经营养因子（ GDNF）和受体酪氨酸激酶（RTK）发挥重要作用，很可能与 MSK 等肾脏发育异常性疾病相关；而在疾病的诊断方面，MSK 主要依赖影像学检查，以往静脉肾盂造影是首选的诊断方法，但随着 CT 的发展，有逐渐替代静脉肾盂造影的趋势。
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清热化瘀方对脑缺血再灌注大鼠GDNF mRNA及其蛋白表达的影响
摘要:目的 观察大鼠脑缺血再灌注后脑内胶质细胞源性神经营养因子(GDNF) mRNA和蛋白的表达变化以及清热化瘀方对其的影响.方法 采用线栓法制作局灶性脑缺血大鼠(MCAO)模型,用原位杂交法和免疫组化法观察脑缺血后3h、6h、12 h及1d、3d、7d共6个时间点GDNF mRNA及其蛋白的表达变化.结果 缺血半暗带GDNF mRNA及其蛋白的表达均于缺血灌注后3h开始明显上升,6h达高峰,12 h表达开始减弱(P＜0.05或P＜0.01),3d后降至正常水平.清热化瘀方治疗后可以上调GDNF的表达.结论 清热化瘀方可促进脑缺血后GDNF的表达,保护神经元.
关键词： 清热化瘀方 脑缺血 胶质细胞源性神经营养因子 -
胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体穿梭质粒的构建及鉴定
目的构建含大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)cDNA的重组腺病毒穿梭载体.方法提取新生大鼠纹状体总RNA,用RT-PCR方法克隆大鼠GDNFcDNA,PCR产物回收后经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,插入pAdTrack-CMV中,用氯化钙法将其转染入大肠杆菌DH5α中,酶切、PCR及测序分析对重组质粒做进一步鉴定.结果大鼠GDNFcDNA被成功克隆,重组载体的PCR检测、酶切鉴定及测序分析表明,所克隆的GDNFcDNA与基因库注册的相同,大鼠GDNFcDNA被定向插入.结论成功构建了GDNFcDNA重组腺病毒载体.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 大鼠 基因重组 -
静脉注射骨髓基质细胞后局灶性脑缺血大鼠胶质细胞源性神经营养因子的表达
背景:骨髓基质细胞移植对局灶性脑缺血的治疗作用,一个更为合理的解释是进入脑内的骨髓基质细胞与宿主大脑相互作用导致其自分泌或旁分泌大量的神经营养因子,这些因子可能有助于损伤神经功能的恢复.目的:观察局灶性脑缺血大鼠静脉移植骨髓基质细胞后胶质细胞源性神经营养因子的表达.设计、时间及地点:随机对照动物观察,于2003-10/2004-09在中国医科大学完成.材料:清洁级健康2月龄Wistar大鼠45只,随机分为细胞移植组、盐水对照组、空白对照组,15只/组.另取Wistar大鼠1只用于骨髓基质细胞的分离培养.方法:贴壁+胰酶消化法分离培养大鼠骨髓基质细胞,取传至第8代前的细胞用于移植,接种前1d进行BrdU标记,制成单细胞悬液,调整细胞密度为3×109L-1.各组大鼠均采用改良Longa线栓法建立大脑中动脉栓塞模型,造模后24h,细胞移植组每只大鼠股静脉注射骨髓基质细胞悬液1mL,盐水对照组同法注射等量生理盐水,空白对照组不做任何处理.主要观察指标:分别在造模后3,7,14d,对各组大鼠进行神经功能损伤评分,分值越高代表损伤程度越重.采用免疫组化法检测梗死区胶质细胞源性神经营养因子及BrdU阳性细胞的表达.结果:[1]造模后各时间点,细胞移植组神经功能损伤评分均低于盐水对照组、空白对照组,至造模后14d差异有显著性意义(P＜0.05).[2]造模后各时间点,细胞移植组梗死区胶质细胞源性神经营养因子水平均明显强于盐水对照组、空白对照组(P＜0.05).在梗死半球可见大量BrdU阳性细胞,对侧半球BrdU阳性细胞数量较少.结论:骨髓基质细胞静脉移植治疗局灶性脑缺血,可能与其促进胶质细胞源性神经营养因子大量分泌密切相关.
关键词： 骨髓基质细胞 静脉注射 大鼠局灶性脑缺血 胶质细胞源性神经营养因子 -
胶质细胞源性神经营养因子缓释微球及NogoA、硫酸软骨素酶ABC缓释微球联合促大鼠损伤脊髓再生神经功能的修复
背景:前期研究证实胶质细胞源性神经营养因子促损伤脊髓再生修复效果良好.目的:观察胶质细胞源性神经营养因子、NogoA 与硫酸软骨素ABC 缓释微球联合促进大鼠损伤脊髓再生运动功能修复的作用.方法:取64 只SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组(仅行椎板切除)、模型组、胶质细胞源性神经营养因子组、胶质细胞源性神经营养因子微球组、硫酸软骨素ABC微球组、NogoA抗体微球组、联合组(胶质细胞源性神经营养因子微球+硫酸软骨素ABC微球+NogoA抗体微球).后6 组制备T10脊髓完全横断伤模型,于脊髓断端间缓慢注射一半相应药液,另用一块明胶海绵吸附另一半相应药液覆盖断端背面.结果与结论:①BBB 运动功能评分:术后5,6,7,8,9,10 周,联合组评分高于模型组、胶质细胞源性神经营养因子组、胶质细胞源性神经营养因子微球组、硫酸软骨素ABC 微球组、NogoA 抗体微球组(P < 0.05).②术后10 周皮质体感诱发电位:假手术、模型组、胶质细胞源性神经营养因子组均未检测出.联合组主反应潜伏期低于其他各组(P < 0.05),但高于正常对照组(P < 0.05);主反应峰峰值高于其他各组(P < 0.05),但低于正常对照组(P <0.05).说明胶质细胞源性神经营养因子缓释微球及NogoA、硫酸软骨素ABC 缓释微球联合促大鼠损伤脊髓再生神经功能修复效果优于单用胶质细胞源性神经营养因子缓释微球.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 微球 聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物 脊髓损伤 神经再生 -
胶质细胞源性营养因子及内皮素B受体基因共转染小鼠神经干细胞
背景:胶质细胞源性神经营养因子与内皮素B受体基因的缺失将导致肠神经系统发育异常.神经干细胞移植不仅可以从解剖和功能上修复神经系统,还可以作为基因转染的载体.目的:拟将携带胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因的重组腺病毒转染至小鼠神经干细胞,并观察目的基因的表达.设计:细胞-基因学观察.材料:新生昆明小鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供.jetPEI转染试剂为PolyPlus公司产品;携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子、内皮素B受体基因共表达腺病毒由本室孙念峰博士和张景辉博士构建并惠赠.方法:无菌条件下取新生小鼠脑组织,制备单细胞悬液.取携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因共表达腺病毒,溶解于NaCI中制备JetPEI/DNA复合体.用DMEM/F12完全培养基调整次代神经干细胞密度为5×10~8L~(-1),向24孔板中每孔加入400 μL细胞悬液、100 μL、JetPEI/DNA复合体,置37℃、体积分数为5%的CO_2培养箱中,分别于转染24,48,72 h后收集神经干细胞.主要观察指标:采用荧光显微镜、流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测目的基因在神经干细胞内的表达.结果:转染24 h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达,转染24,48,72 h后绿色荧光蛋白阳性率分别为15.36%,24.67%,25.73%.各转染时间点神经干细胞均表达胶质细胞源性神经营养因子及内皮素B受体基因,转染24 h条带亮度较低,72 h时外源基因表达水平高.结论:运用jetPEI试剂成功将目的基因转染至小鼠神经干细胞内,且胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因在靶细胞中得到有效转录和表达.
关键词： 神经干细胞 胶质细胞源性神经营养因子 内皮素B受体基因 转染 -
胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化
背景:胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1同属于转化生长因子β超家族,两者在哺乳动物中枢与外周神经系统发育、分化及细胞周期的调节中扮演重要角色.目的:观察胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导脊髓源性神经干细胞的分化,并与单一因子诱导培养液比较.设计:对照观察.单位:南方医科大学附属深圳医院中心实验室.材料:选用10只清洁级孕16 d的SD大鼠,由华中科大同济医学院动物中心提供.主要试剂及材料:DMEM/F12,B27(GIBCO);碱性成纤维细胞生长因子,EGF,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子-β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白(nestin)多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多抗,神经丝蛋白(NF-200)单抗(Sigma).方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成.无菌条件下分离大鼠胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养.实验分①基础培养基组:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02 B27添加液的DMEM/F12.原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆.②对照组:在基础培养基中加入体积分数为O.1的胎牛血清.③碱性成纤维细胞生长因子组.④转化生长因子β1组.⑤胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组.换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2 μg/L转化生长因子β1、10 μg/L胶质细胞源性神经营养因子+2 μg/L转化生长因子β1.①光镜观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化情况.②免疫细胞化学染色标记检测神经元与星状胶质细胞的表达.③通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率.主要观察指标:①各组细胞分化的形态学特点.②各组神经干细胞免疫组织化学检测结果.③各组神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率.结果:①细胞分化形态:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程.在细胞密度较低区域可辨认出神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞.②免疫组织化学检测结果:对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组及胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性.③神经元及星状胶质细胞的阳性百分比:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子+转化生长因子β1组神经元阳性百分比高于血清对照组、碱性成纤维细胞生长因子组及转化生长因子β1组(x2=24.15,19.56,25.32,P＜0.05～0.01),星状胶质细胞阳性百分比低于血清对照组及转化生长因子β1组(x2=24.45,23.79,P＜0.01).结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,说明两者具有协同作用.
关键词： 神经干细胞 分化 神经元 胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1 -
小胶质细胞活化刺激骨髓间充质干细胞释放胶质细胞源性神经营养因子保护多巴胺能神经元的实验
背景:目前尚未见骨髓间充质干细胞对活化的小胶质细胞特异性反应的报道,且有关骨髓间充质干细胞在特定微环境下如何维持多巴胺能神经元的存活也缺乏相应的实验证据.目的:观察骨髓间充质干细胞在活化的小胶质细胞刺激下保护多巴胺能神经元存活的作用.方法:取Wistar大鼠,贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,体外培养并活化小胶质细胞,酶消化法培养中脑多巴胺能神经元.实验分为5组:骨髓间充质干细胞组;小胶质细胞组;脂多糖+小胶质细胞组;骨髓间充质干细胞+脂多糖+小胶质细胞组;分别取各实验组的培养上清,对中脑多巴胺神经元进行培养.单纯多巴胺能神经元组采用体积分数为10%胎牛血清+DMEM/F12进行培养.采用免疫荧光技术检测不同微环境对多巴胺能神经元存活的影响及不同微环境对骨髓间充质干细胞释放胶质细胞源性神经营养因子的影响.结果与结论:含有骨髓间充质干细胞的实验组胶质细胞源性神经营养因子的释放量均较相应的对照组高.酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果发现,单纯多巴胺能神经元组神经元的存活率为15%;小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率为10%;骨髓间充质干细胞组多巴胺能神经元的存活率为35%;脂多糖+小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率为5%;而骨髓间充质干细胞+脂多糖+小胶质细胞组多巴胺能神经元的存活率达到了28%,高于除骨髓间充质干细胞组外的其他各组(P < 0.05).此外体外培养多巴胺能神经元存活率随培养时间延长下降,但含有骨髓间充质干细胞实验组的多巴胺能神经元存活率明显高于相应对照组.提示小胶质细胞活化刺激骨髓间充质干细胞上调胶质细胞源性神经营养因子表达,使得多巴胺能神经元免受毒素的损害,抑制了多巴胺能神经元的延迟性死亡.
关键词： 多巴胺能神经元 骨髓间充质干细胞 胶质细胞源性神经营养因子 小胶质细胞 帕金森病 -
胶质细胞源性神经营养因子基因修饰神经干细胞移植短暂性脑缺血再灌注损伤大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达
背景:以往对脑缺血再灌注后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific protease 3,Caspase-3)的表达均缺乏长时间的动态观察.目的:探讨胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞移植对暂时性脑缺血大鼠脑组织Caspase-3表达的影响.设计:随机对照动物实验.材料:清洁级成年SD大鼠60只,随机分为4组:正常对照组5只、缺血再灌注组5只、单纯细胞移植组25只、基因修饰细胞移植组25只.另取清洁级新生SD大鼠数只,用于分离培养神经干细胞.方法:除正常对照组外,其余3组大鼠按改良性线栓法制备暂时性脑缺血模型.再灌注3 d,单纯细胞移植组从右侧侧脑室每只注入20 μL神经干细胞悬液,含(4.0-5.0)×10~5个神经干细胞;基因修饰细胞移植组每只注入等量胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞悬液;缺血再灌注组每只注入20μL生理盐水.正常对照组、缺血再灌注组在缺血再灌注1周麻醉处死动物,单纯细胞移植组、基因修饰细胞移植组分别在缺血再灌注1,2,3,5,7周麻醉处死动物,5只/时间点.主要观察指标:采用免疫组织化学SP法观察Caspase-3在海马和额顶皮质表达及分布特点.结果:免疫组织化学染色显示,Caspase-3免疫阳性产物位于细胞核、细胞质和部分突起.在海马:单纯细胞移植组、基因修饰细胞移植组Caspase-3阳性细胞数均随再灌注时间的延长而逐渐减少;除缺血再灌注第1周外,其余各时间点基因修饰细胞移植组Caspase-3阳性细胞数均明显少于单纯细胞移植组(P<0.05).在额顶皮质:单纯细胞移植组、基因修饰细胞移植组Caspase-3阳性细胞数亦均随再灌注时间的延长而逐渐减少;除缺血再灌注第1,2周外,其余各时间点基因修饰细胞移植组Caspase-3阳性细胞数均明显少于单纯细胞移植组(P<0.05).结论:胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的神经干细胞移植通过降低Caspase-3的表达,减少神经元凋亡,从而抑制缺血性脑损伤的进行性恶化,其移植效果优于单纯神经干细胞移植.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 Caspase-3 神经干细胞 移植 脑缺血再灌注
