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高糖环境对人肾小球系膜细胞表达结缔组织生长因子及其受体蛋白的影响
目的 探讨高糖环境对体外培养的人肾小球系膜细胞(HMC)表达结缔组织生长因子(CTGF)及其受体——低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)的影响以及相应的信号机制.方法 以体外培养的HMC为研究对象,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ABC-ELISA)测定正常糖组(NG组)、高糖组(HG组)和甘露醇组(MG组)培养液中CTGF、人磷酸化细胞外信号调节激酶(pERK)及LPR的浓度变化,分别观察高糖环境对系膜细胞CTGF蛋白表达、丝裂素激活蛋白激酶(MAPKS)信号通路的活化以及CTGF受体LRR表达的影响.结果 HMC本身存在基础水平的CTGF蛋白表达,HG组培养1d后,CTGF蛋白表达升高,峰值出现在第3天,自第4天开始下降;而NG组、MG组的CTGF蛋白表达未随时间发生显著变化;高糖环境下HMC外信号调节激酶(ERK)出现动态活化:1h即开始检测到pERK升高,峰值出现在第8至24小时,于48 h内降至基础水平,而NG组、MG组在各时点均未能检测到pERK表达;加入ERK活化特异抑制剂PD98059后发现高糖环境对HMC表达CTGF蛋白增加的影响被抵消;另外,高糖环境未影响LRP的表达.结论 高糖环境下HMC表达CTGF蛋白增加,但未增加CTGF受体LRP的表达,初步明确CTGF的高表达是通过磷酸化激活ERK实现的.
关键词: 高糖 结缔组织生长因子 LDL受体相关蛋白质 人肾小球系膜细胞 -
HBV在人肾小球系膜细胞内的表达及对其凋亡的影响
目的 研究乙型肝炎病毒(HBV)在人肾小球系膜细胞内的表达及对细胞凋亡的影响.方法 采用脂质体转染法将C基因型重组全长乙型肝炎病毒(PHY106-CHBV)转染至人肾小球系膜细胞.收集24、48和72 h细胞培养上清液,进行HBsAg与HBeAg的定量检测;应用倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态学变化;MTT法检测细胞增殖率;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 实验组细胞培养上清液中可检测到HBsAg和HBeAg的高表达;观察细胞形态学变化发现,转染PHY106-CHBV后可诱导人肾小球系膜细胞凋亡;MTT结果显示细胞增殖受抑;流式细胞仪检测显示细胞凋亡率增加.结论 HBV可在人肾小球系膜细胞内表达,且能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡.
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1,25(OH)2D3对人肾小球系膜细胞凋亡活性的影响及机制探讨
目的 探讨1,25(OH)2D3对人肾小球系膜细胞(HMC)凋亡活性及凋亡相关因子表达的影响,并探讨其机制.方法 体外培养HMC,随机分为空白对照组(N组)、表皮生长因子(EGF)组(E组)、1,25(OH)2D3组(V组)、EGF联合1,25(OH)2D3组(EV组).N组在5%胎牛血清的DMEM培养基中培养,E组在DMEM培养基中加入含10 ng/mL EGF的培养液,V组加入含10-8 mol/L 1,25(OH)2D3的培养液,EV组加入含10 ng/mL EGF及10-8 mol/L 1,25(OH)2D3的培养液,各组均干预48 h.应用半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性试剂盒检测各组Caspase-3活性,Western blot法检测各组凋亡相关因子Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表达,荧光实时定量PCR法检测各组Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA表达.结果 E组Caspase-3活性低于N组,V组及EV组Caspase-3活性高于N组,EV组Caspase-3活性高于E组(P均<0.05).E组p-Akt/Akt值高于N组,V组p-Akt/Akt值低于N组,EV组p-Akt/Akt值低于E组(P均<0.05).E组Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表达均低于N组,V组Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表达均高于N组,EV组Caspase-3、Caspase-9蛋白及mRNA表达均高于E组(P均<0.05).结论 1,25(OH)2D3可增强HMC的凋亡活性,从而发挥促HMC凋亡的作用,其机制可能为通过抑制Akt磷酸化,上调Caspase-3、Caspase-9的表达.
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人工培育蝉花菌丝对人系膜细胞增殖及细胞外基质合成的影响
目的:观察人工培育蝉花菌丝对入肾小球系膜细胞(HMC)增殖和细胞外基质(ECM)合成的影响.方法:分离人胚胎肾小球系膜细胞,进行体外培养.将实验大鼠随机分为正常对照组、人工蝉花菌丝组、天然蝉花组、冬虫夏草组及洛汀新组,给予相应的药物,收集动物含药血清.以含药血清刺激HMC,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定对HMC增殖的影响;采用ELISA法测定对Ⅳ型胶原(ColⅣ)和纤维连接蛋白(FN)合成的影响.结果:成功分离、培养了人胚胎肾小球系膜细胞,建立了体外抗肾纤维化研究模型,为进一步的研究工作搭建了良好的研究平台;人工蝉花菌丝组能显著抑制HMC增殖,与正常对照组相比,P<0.05;人工蝉花菌丝组能显著抑制FN的合成,与正常对照组相比,P<0.01,其作用与洛汀新组相近(P>0.05).结论:人工蝉花菌丝可有效减缓肾小球硬化及肾纤维化.
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荔枝核皂苷对血管紧张素Ⅱ诱导的肾小球系膜细胞增殖及分泌IL-6、IL-1β的影响
目的 探讨血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)对体外培养人肾小球系膜细胞(human glomerular mesangial cells,HMC)生长的影响及荔枝核皂苷的干预作用.方法 体外培养HMC细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法进行AngⅡ有效作用浓度筛选和荔枝核皂苷的干预研究,确定AngⅡ作用的佳浓度及荔枝核皂苷的干预作用;ELISA法检测细胞分泌IL-6、IL-1β的含量,观察荔枝核皂苷对其影响.结果 MTT法检测结果显示,AngⅡ作用于HMC细胞后,吸光度值(OD值)明显增加(P<0.05),10-6 mol/ml AngⅡ在48h作用明显(P<0.01).ELISA法检测结果显示,荔枝核皂苷可以抑制HMC细胞的增殖,降低IL-6和IL-1β的水平,与AngⅡ组比较有显著性差异(P<0.01).结论 AngⅡ可诱导HMC细胞增殖,10-6 mol/ml在48h作用明显;荔枝核皂苷可以降低HMC细胞分泌IL-6和IL-1β的含量,抑制HMC细胞的增殖,减少细胞外基质,从而延缓与减轻肾小球硬化.
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AGEs诱导培养人肾小球系膜细胞中NOX4及O-2水平
目的:观察晚期糖基化终末产物(AGEs)培养下人肾小球系膜细胞(HMCs)中还原型尼克安腺嘌吟二核苷酸氧化酶4(NOX4)蛋白及超氧阴离子(O-2)水平变化.方法:将正常浓度葡萄糖(5.6mmol/L)培养的HMCs经过无血清培养液同步化24h后分为两组:正常对照组[5.6mmol/L葡萄糖+200mg/L牛血清白蛋白(BSA)]及AGEs组(5.6mmol/L葡萄糖+200mg/L AGEs),分别干预48h后用Western blotting检测NOX4蛋白表达,用Dihydroethidium(DHE)法检测O-2的荧光水平.结果:与正常对照组比较,AGEs组NOX4蛋白表达明显上调(P<0.01),O-2水平亦明显增加(P<0.01),两者呈显著正相关.结论:AGEs能激活HMCs中NOX4,引起氧化应激,可能与糖尿病肾病(DN)的发生有关.
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AGEs培养的人肾小球系膜细胞中二氢叶酸还原酶及O-2水平
目的:观察晚期糖基化终末产物(AGEs)对人肾小球系膜细胞(HMCs)中二氢叶酸还原酶(DHFR)和超氧阴离子(O-2)水平的影响.方法:在HMCs中加入5.6mmol/L葡萄糖(正常对照组)和200mg/L AGEs(AGEs组),平行培养48h后,采用Western blotting检测两组DHFR蛋白含量,采用二氢乙啶(DHE)法检测两组 O-2的水平.结果:与正常对照组比较,AGEs组DHFR蛋白表达显著下调(P<0.05),O-2水平显著上调(P<0.01).结论:AGEs诱导HMCs产生的O-2可能通过下调DHFR蛋白水平影响四氢生物喋呤(BH4)的生物补救合成途径,导致BH4减少而加重糖尿病肾病(DN)的氧化应激.
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高糖培养人肾小球系膜细胞对JAK2/STAT1信号蛋白活化的影响
糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病常见微血管病变,已成为导致慢性肾衰的主要原因,其发生发展机制尚未完全明确.近年来有研究提示,Janus激酶/信号转导子与转录激活子(Janus Activated Kinase-Signal Transducer and Activator of Trancriptions,JAK/STAT)信号通路与系膜细胞的增殖、肥大及细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)分泌有关,但具体机制尚未十分清楚.本研究通过观察高糖培养人肾小球系膜细胞(HMCs)对JAK2、STATl的激活,以及对转化生长因子β1(Transforming Growth Factorβ1,TGF-β1)和纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)mRNA表达和蛋白分泌的影响,探讨高糖如何通过HMCs的JAK2/STAT1信号途径促进TGF-β1和FN的合成,从而加速肾脏纤维化.
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高糖培养人肾小球系膜细胞对TGF-β1、FN、Smad7表达的影响
糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病常见的微血管并发症,是导致终末期肾病和糖尿病患者死亡的主要原因[1],虽然糖尿病患者的高血糖、高血脂、高血压有很多好的治疗控制方法,但DN的发病率仍然居高不下.因此,研究DN的发生机制和治疗方案是临床亟待解决的问题.Smad蛋白是目前唯一所知的转化生长因子-β1(TGF-β1)的胞内信号转导因子[2],Smad7是TGF-β1/Smad信号转导途径的负反馈调节因子,在DN的发病过程中,Smad7的表达失衡可能是致病环节之一.本文通过体外实验,观察高糖状态下TGF-β1、纤维连接蛋白(FN)增多的同时,Smad7表达的变化,探讨Smad7在细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)沉积中的作用.
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高糖诱导人肾小球系膜细胞SGK的表达
目的研究高糖环境中人肾小球系膜细胞(human mesangial cells, HMC)中血清和糖皮质激素诱导的激酶(serum and glucocorticoid-inducible kinase,SGK)3种亚型SGK1、SGK2和SGK3的表达及意义.方法将培养的HMC分为正常组(5.5 mmol/L D-葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L D-葡萄糖)和甘露醇对照组(19.5 mmol/L甘露醇和5.5 mmol/L D-葡萄糖).采用RT-PCR方法检测SGK1、SGK2和SGK3 mRNA的表达,Western blot方法检测SGK1蛋白的表达.结果在高糖及甘露醇刺激下,HMC中SGK1、SGK2和SGK3 mRNA及SGK1蛋白的表达明显上调(P<0.05);其中高糖上调SGK的表达明显高于甘露醇(P<0.05).结论高糖能促进HMC的SGK1、SGK2和SGK3 mRNA及SGK1蛋白的表达,SGK1可能是高糖作用于HMC的细胞内信号通路中靶分子之一,由它介导的高糖信号转导途径在糖尿病肾病的发生中可能起了重要作用.
关键词: 血清和糖皮质激素诱导的激酶 高糖 人肾小球系膜细胞 -
高糖诱导下人肾小球系膜细胞AMPK、MPO、α-SMA的变化以及α-硫辛酸的干预作用
目的 探讨高糖诱导下人肾小球系膜细胞(HMCs)中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、炎症反应指标、细胞外基质的变化及α-硫辛酸的干预作用.方法 传代培养的HMCs同步化后分组:正常对照组、高糖组、甘露醇对照组、高糖+α-硫辛酸处理组(α-硫辛酸浓度分别为50、100和200μmol/L),于实验0、12、24、48和72 h收集各组细胞及上清液,采用RT-PCR法和ELISA法检测各组细胞中AMPK mRNA及上清液中AMPK、髓过氧化物酶(MPO)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的含量.结果 高糖组人肾小球系膜细胞AMPK mRNA及AMPK蛋白的表达较正常对照组明显下降(P<0.01),MPO、α-SMA蛋白的表达明显增加(P<0.01).α-硫辛酸各处理组AMPK mRNA及AMPK蛋白表达比高糖组有明显增加(P<0.01),MPO、α-SMA蛋白的分泌较处理前明显降低(P<0.05).结论 高糖能够抑制人肾小球系膜细胞中AMPK的表达,诱导MPO(炎症反应指标)、α-SMA(系膜细胞活化从而分泌细胞外基质增多的指标)的表达,抗氧化剂α-硫辛酸可以上调高糖抑制的AMPK的表达,减少高糖刺激下HMCs中MPO、α-SMA蛋白的分泌,为糖尿病肾病的防治提供新的理论依据.
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转染靶向SAA基因siRNA对高糖诱导人肾小球系膜细胞分泌纤连蛋白及肿瘤坏死因子-α的影响
目的 研究siRNA-SAA干扰对高糖条件培养下的人肾小球系膜细胞(human mesangial cells,HM-Cs)炎症反应及细胞外基质(extra-cellular matrix.ECM)的影响,探讨血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,sAA)在糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)发生发展中的作用.方法 传代培养的HMCs同步化后分组,脂质体Lipofectamine TM2000转染抑制SAA表达的siRNA或无关的siRNA (negative siRNA,neg-siR-NA),用荧光倒置显微镜观察转染效率,利用real-time RT-PCR技术检测SAA及肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-d)的mRNA表达,ELISA技术检测SAA、纤连蛋白(fibronectin,FN)、TNF-α蛋白的表达情况.结果 SAA-siRNA转染可抑制高糖刺激的HMCs中SAA、FN、TNF-α的表达水平(P<0.05).结论 SAA是高糖诱导HMCs分泌ECM及炎症反应的重要介质,通过RNA干扰(RNA interference,RANi)技术抑制SAA的表达,可减少高糖刺激下系膜细胞FN、TNF-α的积聚,减少肾小球的ECM和炎症反应,为进一步寻找DKD防治的靶点提供了新的实验依据.
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己酮可可碱对高糖时人肾小球系膜细胞单核细胞趋化蛋白-1表达的影响
目的 探讨高糖对人肾小球系膜细胞单核细胞趋化蛋白1(nonocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)表达的影响及己酮可可碱(pentoxifylline,PTX)对其干预作用.方法 将培养的人肾小球系膜细胞分为6组:正常对照组、高糖组、甘露醇组、PTX甲组、PTX乙组、PTX丙组,分别在24、48和72 h采用RT-PCR法和ELISA法检测PTX对高糖条件下系膜细胞内MCP-1mRNA及蛋白、细胞外基质纤维连接蛋白(fi-bronectin,FN)表达的影响.结果 高糖组人肾小球系膜细胞MCP-1mRNA及蛋白、FN的表达较正常对照组明显增加(P<0.01);己酮可可碱各组比高糖组有明显下降(P<0.01);不同浓度的己酮可可碱对高糖诱导的系膜细胞MCP-1的表达抑制程度不同(P<0.05).结论 己酮可可碱可抑制高糖诱导的人肾小球系膜细胞MCP-1的表达以及FN的分泌,呈时间、剂量依赖关系,己酮可可碱可能对糖尿病肾病的防治起到有益的作用.
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普罗布考对结缔组织生长因子在系膜细胞中表达的调节
结缔组织生长因子(CTGF)是一种相对分子质量为36 000~38 000的分泌多肽,在包括肾脏在内的多种不同器官中可致纤维化病变[1].CTGF可诱导人肾小球系膜细胞产生与糖尿病.肾病相关的病理变化,如增加细胞外基质积聚及诱导细胞周期停滞在G1晚期[1].CTGF在糖尿病肾病中的作用及如何调控CTGF表达为当前研究热点.普罗布考是一种降脂药物,并具有抗增殖活性,已初步应用于糖尿病的治疗[2].本研究旨在明确CTGF在高糖状态下系膜细胞中的表达变化以及普罗布考对CTGF表达的调控,并进一步探讨其分子机制.
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基因干扰对人肾小球系膜细胞megsin基因表达及α平滑肌肌动蛋白和转化生长因子β1生成的影响
megsin,即SERPINB7,是丝氨酸蛋白酶抑制剂进化单位B的第7位成员[1],为近年发现的特异性表达于肾脏的基因.
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高糖对人肾小球系膜细胞髓过氧化物酶、谷胱甘肽-硫转移酶活性和细胞间黏附分子1表达的影响及茶多酚的干预作用
在糖尿病肾病(DN)的发生、发展过程中,高血糖、活性氧、血管活性物质以及细胞因子都起着重要的作用.
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褐藻多糖硫酸酯对人肾小球系膜细胞增殖及纤连蛋白与转化生长因子分泌的影响
肾小球硬化是各种原因引起的肾小球损伤的晚期变化,是终末期肾衰的基本病变,而系膜细胞过度增殖和细胞外基质(ECM)的积聚在肾小球硬化的发生中起重要作用[1].褐藻多糖硫酸酯(FPS)作为一种新的海洋药物用于治疗慢性肾功能衰竭,在降低Scr和BUN、抗凝血等方面有非常确切的疗效[2].我们通过人肾小球系膜细胞(GMC)体外培养,研究FPS对其细胞增殖和分泌纤连蛋白(FN)、转化生长因子β1(TGF-β1)的影响,以期从细胞水平探讨FPS对慢性肾功能衰竭的防治机制.
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绞股蓝皂苷对 AGEs 诱导下肾小球系膜细胞中核因子-κB 表达的影响
目的:观察绞股蓝皂苷(GP)对晚期糖基化终末产物(AGEs)诱导下人肾小球系膜细胞(HMCs)中核因子-κB( NF-κB)表达的影响。方法将对数生长期的HMCs分为空白组、模型组、阳性组以及GP低、中、高剂组。空白组不给予任何诱导和干预,模型组、阳性组以及GP低、中、高剂量组均采用200 mg/L的AGEs诱导HMCs,GP低、中、高剂量组分别给予低、中、高剂量(25、75、150 mg/L)的GP干预,阳性组同时给予10-1 mmol/L的氨基胍盐酸盐( AG)干预,培养72 h。半定量Real-Time PCR法检测各组中NF-κB mRNA的表达;Western blot-ting法检测各组中NF-κB蛋白的表达。结果模型组中NF-κB表达量较空白组增加( P<0.01);GP干预后, HMCs中NF-κB表达量较模型组减少,且随着浓度增加,表达量逐渐减少( P<0.01)。结论 GP防治DN的机制可能与其呈剂量依赖性下调NF-κB的表达相关。
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氧化苦参碱对脂多糖诱导的人肾小球系膜细胞增殖P-STAT1/PIAS1信号分子的影响
JAK/STAT信号转导通路.
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β-连环素互作蛋白1参与PPARγ转录活性调控及在高糖诱导系膜细胞表型转化中的作用
目的 探讨β-连环素互作蛋白1(β-catenin-interacting protein 1,ICAT)在过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)转录活性调控中的作用及在高糖诱导系膜细胞表型转化中的意义.方法 将人肾小球系膜细胞分别用常规葡萄糖浓度(5.5 mmol/L,对照组)和高糖(30 mmol/L,高糖组)培养48 h,检测PPARγ、ICAT和β-catenin的mRNA及蛋白质表达变化.观察过表达ICAT和敲减ICAT及β-catenin对上述培养条件下系膜细胞PPARγ转录活性的影响.利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹技术检测不同分组中细胞表型转化标志物平滑肌动蛋白d(α-smooth muscular actin,α-SMA)表达水平.利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖水平.结果 与对照组比较,高糖培养可诱导系膜细胞表型标志蛋白α-SMA的表达上调以及系膜细胞增殖;高糖培养虽对系膜细胞PPARγ蛋白表达水平无影响(P>0.05),但可使PPARγ转录活性明显降低(P<0.01),同时,可抑制系膜细胞ICAT表达和促进β-catenin表达;过表达ICAT可部分升高高糖培养的系膜细胞PPARγ的转录活性(P<0.01);在常规糖浓度条件下,敲减ICAT可降低PPARγ的转录活性(P<0.01),敲减β-catenin表达,同样可降低PPARγ的转录活性(P<0.01);高糖培养条件下,过表达ICAT可抑制系膜细胞α-SMA的表达与细胞增殖.结论 ICAT可能是PPARγ转录活性的重要调控分子之一,并参与介导了高糖诱导系膜细胞表型转化.