模拟体内肿瘤微环境的乳腺癌细胞与脐静脉内皮细胞的体外共培养

为了更好地模拟体内肿瘤组织复杂的微环境特点,本研究采用间接共培养的方法,构建了乳腺癌细胞(human breast adenocarcinoma cells,MCF-7)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的体外共培养模型,以用于后续抗血管生成和诱导肿瘤凋亡的双重疗法的体外研究.分别以同期单独培养的MCF-7和HUVECs细胞为对照,对共培养的MCF-7和HUVECs细胞在培养过程中的细胞活性、形态、电阻、周期和血管内皮生长因子(VEGF)含量进行了考察.结果显示,与单独培养的MCF-7和HUVECs细胞相比,共培养的两种细胞活性更高,且发生了变形、结构变疏松的形貌改变,表现出更低的电阻值,细胞周期活跃、增殖明显(S和G2/M期比例较大),以及有更高的VEGF表达(约1.4～2倍).该模型很好地模拟了体内肿瘤细胞与肿瘤血管的相互作用关系,可作为设计肿瘤靶向释药系统的体外研究模型.

λ-卡拉胶寡糖体外对血管生成的抑制作用

为探讨λ-卡拉胶寡糖体外对血管生成的抑制作用,采用鸡胚尿囊膜模型(CAM)观察λ-卡拉胶寡糖对CAM血管发育的抑制,发现该寡糖可明显抑制CAM微血管生成,在200 μg·egg-1时,抑制率达54.90%.随后采用MTT法测定λ-卡拉胶寡糖对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响,发现该寡糖的细胞毒作用在不同的细胞间具有选择性,对HUVEC的抑制强,高浓度时(1 mg·mL-1)能明显抑制其增殖,但低浓度(＜250 μg·mL-1)对细胞几乎无毒.对寡糖的细胞迁移和侵袭抑制作用进行检测,并测定其对HUVEC表达基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的影响.结果表明,λ-卡拉胶寡糖能有效减缓HUVEC的迁移、侵袭能力,并具有抑制HUVEC中MMP-2表达的作用.该研究说明λ-卡拉胶寡糖通过抑制内皮细胞的增殖、细胞侵袭和迁移达到血管生成抑制的作用.

λ-卡拉胶寡糖对人脐静脉内皮细胞的增殖抑制作用及凋亡相关基因表达

为了探讨λ-卡拉胶寡糖(λ-carrageenan oligosaccharides,λ-CO)在体外抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖作用及其分子机制,采用MTT法检测λ-CO对HUVEC存活率的影响,通过流式细胞技术检测λ-CO对HUVEC增殖周期的影响,测定细胞凋亡率,检测用药前后活性半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的变化.同时采用半定量RT-PCR方法检测凋亡相关基因mRNA的表达情况.MTT检测结果显示,λ-CO在高浓度(1 mg·mL-1)能明显抑制细胞增殖.流式细胞仪检测到λ-CO作用HUVEC后,出现早期凋亡细胞,且凋亡呈浓度和时间依赖性;对细胞增殖周期的检测结果显示,与对照组相比,λ-CO作用后G1期细胞比例减少,S期比例增加,并出现凋亡峰;活化的caspase-3比例亦随用药浓度的加大而增加.RT-PCR检测发现0.3 mg·mL-1 λ-CO作用人脐静脉内皮细胞12、24和36 h后,细胞TNFα、p53、caspase-8、caspase-3的mRNA表达上调.表明λ-CO能剂量依赖性地诱导HUVEC胞凋亡,并引起HUVEC的S期阻滞,其机制可能与促进TNFα、p53、caspase-8、caspase-3等基因的转录,使细胞内活化的caspase-3水平增加有关.

碲化镉量子点抑制人脐静脉内皮细胞存活并损伤线粒体

目的 观察碲化镉量子点(CdTe QD)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)线粒体自噬的诱导作用,探讨CdTe QD对血管内皮细胞的毒理特性.方法 原代培养的HUVEC采用免疫荧光法鉴定后与CdTe QD(0.1～100 mg·L-1)共孵育24 h,MTT法检测细胞存活;Mitotracker标记、激光共聚焦显微术观察线粒体断裂情况;JC-1染色、流式细胞术检测CdTe QD对HUVEC线粒体膜电位的影响;Western蛋白印迹法检测线粒体自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3 Ⅰ/Ⅱ (LC3 Ⅰ/Ⅱ)、膜突蛋白样BCL2作用蛋白1(Beclin1)、同源性磷酸酶张力蛋白诱导的激酶1 (PINK1)和动力相关蛋白1(DRP1)水平的变化.结果 经鉴定,原代培养的HUVEC＞95％为血管内皮细胞.MTF结果显示,CdTe QD作用于HUVEC24h后,细胞存活率显著下降(P＜0.05,P＜0.01).激光共聚焦显微术检测发现,CdTe QD导致HUVEC胞内线粒体大量断裂.流式细胞术检测染色结果表明,CdTe QD 0.1,1和10 mg·L-1使HUVEC的线粒体膜电位下降,膜电位较高的HUVEC比例分别由正常对照组的(91.8±0.6)％下降至(90.2±1.1)％,(84.4±0.9)％和(78.1±1.3)％(P＜0.05,P＜O.01).Western蛋白印迹结果显示,CdTe QD 10 mg· L-1诱导自噬相关蛋白Beclin1,LC3 Ⅱ/LC3 l比值PINK1和DRP1的水平升高(P＜0.05,P＜0.01),CdTe QD 1 mg·L-1还造成线粒体自噬相关蛋白PINK1和DRP1表达显著上升(P＜0.05,P＜0.01).结论 CdTe QD可诱导HUVEC线粒体损伤并激活线粒体自噬.

小泛素相关修饰蛋白特异性蛋白酶1对脐静脉内皮细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的 探讨小泛素相关修饰蛋白特异性蛋白酶1(SENP1)对脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移及凋亡的影响.方法 用20个感染复数的pLKO.1-SENP1-小发夹RNA(shRNA)-绿色荧光蛋白(GFP)干涉慢病毒(SENP1干涉组)和pPIG-U6-随机序列(scramble)-GFP对照慢病毒(GFP-SC对照组)感染HUVEC.病毒感染HUVEC 48 h后,用流式细胞仪检测慢病毒的感染效率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western蛋白质印迹法检测HUVEC内SENP1基因和蛋白表达水平.用CCK8试剂盒检测细胞增殖能力,Transwell小室法检测细胞的迁移能力,流式细胞仪分析细胞凋亡率.结果 GFP-SC对照组和SENP1干涉组感染效率均＞97％.与GFP-SC对照组比较,SENP1干涉组HUVEC SENP1基因和蛋白表达水平显著降低(P＜0.01).CCK8法测定结果表明,SENP1干涉组HUVEC增殖能力较GFP-SC对照组明显降低(P＜0.01).SENP1干涉组细胞迁移过Transwell小室的细胞数量明显低于GFP-SC对照组(P＜0.01).用低浓度血清(含2％胎牛血清)培养基诱导细胞凋亡24 h,SENP1干涉组细胞凋亡率即已升高到GFP-SC对照组的2倍左右(P＜0.05);诱导凋亡至48 h,SENP1干涉组细胞凋亡率升高到对照组的3.2倍左右(P＜0.05).结论 HUVEC内SENP1表达水平的降低不仅可以显著抑制细胞增殖和迁移能力,亦可促进细胞凋亡.

以链球菌制剂OK432为佐剂的内皮细胞疫苗体内抗小鼠肝癌转移的作用

目的 评估OK432作为佐剂制备的内皮细胞疫苗体内抗肿瘤转移的作用.方法 以OK432为佐剂,体外混合人脐静脉内皮细胞(HUVEC),制备HUVEC-OK432疫苗.雄性健康BALB/c小鼠尾静脉注射肝癌细胞5×105建立肝癌肺转移模型,皮下注射HUVEC-OK432疫苗,分别在预防性和治疗性免疫中评价HUVEC-OK432疫苗抗肿瘤转移活性;皮内注射5×104肝癌细胞建立皮内肿瘤血管模型,皮下注射HUVEC-OK432疫苗,评价HUVEC-OK432疫苗抑制肿瘤新生血管的活性;采用ELISA的方法测定小鼠免疫血清中HUVEC抗体水平;采用细胞毒T淋巴细胞(CTL)实验考察HUVEC-OK432疫苗诱导的细胞免疫应答水平.结果 肺转移模型结果显示,在预防性和治疗性免疫中,HUVEC-OK432免疫均能有效降低小鼠肺上的肿瘤转移灶数目(P＜0.01);皮内肿瘤血管模型的结果显示,HUVEC-OK432免疫能显著降低肿瘤新生血管的数目(116.5±20.6 vs 45.0±8.9,P＜0.01);ELISA测定抗体的结果显示,HUVEC-OK432初次免疫后1周小鼠即产生了高滴度的特异性HUVEC抗体,随免疫次数的增加抗体水平不断升高,且该抗体在体外可以显著抑制HUVEC细胞的增殖;CTL实验的结果表明,HUVEC-OK432免疫组淋巴细胞体外有明显的特异性杀伤HUVEC的作用.结论 HUVEC-OK432疫苗免疫可以有效诱导小鼠产生靶向内皮细胞的免疫应答,从而有效抑制小鼠肝癌细胞转移.

清毒活血化痰复方抑制脐静脉内皮细胞株ECV304氧糖剥夺/复糖复氧模型中NF-κB和STAT3的表达

目的 探讨清毒活血化痰复方对脐静脉内皮细胞氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)损伤的保护作用及其作用机制.方法 SD大鼠连续5d每天灌胃清毒活血化痰复方(12 g/kg),正常对照组给予等量生理盐水,制备药物血清和正常血清.OGD/R损伤脐静脉内皮细胞株ECV304,复氧复糖过程中添加清毒活血化痰复方药物血清,并以正常血清为对照.正常对照组、缺氧缺糖后复氧复糖组(模型组)、清毒活血化痰复方药物血清组(中药组)分别于复氧复糖后4、24、48、72 h提取基因和蛋白用于检测.以MTT法检测细胞存活率,用RT-PCR检测NF-κB和STAT3的mRNA水平,Western blot检测NF-κB和STAT3的蛋白表达.结果 清毒活血化痰复方药物血清作用24 h即显现出明显的促ECV304增殖的作用,于48 h时作用明显.在各个时间段对NF-κB和STAT3的mRNA和蛋白表达均有抑制作用.结论 清毒活血化痰复方药物血清可以有效改善OGD/R对脐静脉内皮细胞的损伤,促进细胞增殖,其作用机制可能与抑制NF-κB和STAT3的表达相关.

p38信号通路在内皮细胞微粒诱导人脐静脉内皮细胞表达细胞间黏附分子-1中的作用

目的 观察p38信号通路(P38MAPK)在内皮细胞微粒(EMPs)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达细胞间黏附分子-1(ICAM-1)中的作用.方法 将体外培养的HUVECs随机分组:①EMPs不同时点观察组:用EMPs(终浓度105/ml)分别刺激细胞0、3、6、12、24 h；②EMPs不同剂量作用组:分别用终浓度为0、102、103、104、105/ml的EMPs刺激细胞24 h；③EMPs+p38MAPK特异性抑制剂SB203580组:在EMPs(终浓度105/ml)刺激前,与终浓度为5μmol/L的SB203580共同孵育30 min.用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定p38MAPK磷酸化表达,实时荧光定量PCR测定ICAM-1mRNA的表达.结果 EMPs可激活p38MAPK,使磷酸化p38MAPK蛋白表达量及ICAM-1 mRNA表达量增加,且呈剂量和时间依赖性.p38MAPK特异性拮抗剂SB203580可显著抑制EMPs的此作用.结论 p38信号通路可能部分参与了对EMPs诱导HUVECs表达ICAM-1的调控.

氟对体外培养的血管内皮细胞增殖的影响

目的 观察不同浓度的氟对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响.方法 利用二甲基噻唑二苯基四唑溴(MTT)比色法、流式细胞仪及免疫组织化学法观察不同浓度的(120、240、360、480、600、720、840、960 μmol/L)氟化钠染毒24 h对体外培养的人脐静脉血管内皮细胞增殖活性的影响.结果 氟化钠的浓度在120～240 μmol/L时,增殖细胞核抗原表达阳性率高于正常对照组(P＜0.01),240 μmol/L时的阳性率高约为80%;吸光度(A)值和细胞分裂增殖指数(PI)值也高于正常对照组(P＜0.05,P＜0.01);360～480 μmol/L氟化钠染毒组上述指标与正常对照组差异无统计学意义(P＞0.05);当氟化钠的浓度增加到600 μmol/L以上时,增殖细胞核抗原的表达、A值及PI值均低于正常对照组(P＜0.05,P＜0.01),以960μmol/L时增殖抗原表达阳性率低(约为20%),并且随着浓度增高上述指标呈下降趋势.结论 低浓度的氟化钠能促进脐静脉血管内皮细胞增殖活性,高浓度时抑制脐静脉血管内皮细胞的增殖活性,且随着氟浓度的增加,抑制作用逐渐增强.

降血压肽对人脐静脉内皮细胞eNOS、iNOS、ET-1mRNA表达的影响

目的和方法:采用RT-PCR技术分析降血压肽(ACEIP)对人脐静脉内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮素-1(ET-1)mRNA表达水平的影响,从而探讨降血压肽降血压的部分作用机制.结果:与对照组比较,不同剂量的降血压肽可降低ET-1、iNOS mRNA的表达;升高eNOS mRNA的表达,均以ACEIP中剂量组效果明显(P＜0.01).结论:降血压肽降低血压的机制可能与其降低人脐静脉内皮细胞ET-1、iNOS的基因表达;诱导eNOS基因表达有关.

琼胶寡糖抑制血管形成作用的研究

目的:探讨琼胶寡糖(AOS)对血管形成的抑制及其作用机制.方法:采用鸡胚尿囊膜模型(CAM)并结合组织化学方法观察AOS抑制血管发育的情况;以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为研究对象,采用MTT法测定AOS的细胞毒情况,并利用Hoechst染色及流式细胞术检测寡糖的促凋亡现象.结果:AOS可明显抑制鸡胚尿囊膜的微血管形成,呈量效关系,在200 μg/egg时,抑制率达50.98 %;AOS对各类细胞的细胞毒作用有差异,以HUVEC的敏感性较强,在125 μg/ml时增殖抑制率达39.66 %.AOS有明显的促进HUVEC细胞凋亡的作用,流式细胞仪检测发现AOS能将细胞周期阻滞在S期.结论:琼胶寡糖具有明显的抑制血管形成作用,且该作用主要是通过促进脐静脉内皮细胞凋亡并阻滞细胞周期于S期产生的.

腺苷对人脐静脉内皮细胞三维管状结构形成的影响

目的:探讨腺苷对脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)三维管状结构形成的影响.方法:建立上、下两层内皮细胞,中间为胶原凝胶的三维培养方式.设对照和试验各3孔.对照孔不加腺苷,实验孔内加入10-4mol/L腺苷.观察并记录特定视野下芽生的管状结构数目.结果:HUVEC可以在Ⅰ型胶原凝胶中形成三维网状结构,腺苷实验组细胞生长快,出芽快,管状结构粗大,甚可形成贯穿胶原的三维网状结构.血管芽生数与对照组比较在24 h、48 h、72 h、96 h均有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01).结论:腺苷对HUVEC三维网状结构的形成有促进作用.

山莨菪碱和蜕皮激素对内毒素致体外内皮细胞能量代谢的保护作用

目的:探讨山莨菪碱(6542)和蜕皮激素(EDS)对内毒素(LPS)致伤培养脐静脉内皮细胞(HUVECs)能量代谢的保护作用.方法:采用反相高效液相色谱分析法测定LPS损伤后培养HUVECs ATP、ADP、AMP及能量负荷(EC)的变化以及6542、EDS的保护作用.结果:LPS与内皮细胞孵育后低浓度、早期内皮细胞被激活,LPS同一浓度刺激后,随刺激时间延长,HUVECs EC降低,与正常比较,12小时后明显降低(P<0.01);而用6542和EDS治疗后,EC、ATP、ADP明显增加,其中EDS治疗后各指标接近正常.结论:LPS在无血清状态下刺激培养HUVECs,能量代谢出现紊乱,EC、ATP、ADP显著降低.EDS治疗后,EC、ATP、ADP均明显升高,且其效果优于6542.

姜烯酚类对人成神经细胞瘤细胞IMR32及脐静脉内皮细胞β-淀粉样损害的防护作用

高浓度葡萄糖对人脐静脉内皮细胞中ghrelin表达的影响

目的 探讨葡萄糖对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中ghrelin表达的影响.方法 体外培养HUVECs,经过12 h无糖培养后分别观察不同浓度葡萄糖和不同培养时间对ghrelin表达的影响.(1)细胞经0、5、10、15、20 mmol/L葡萄糖处理2 h,RT-PCR法测定ghrelin mRNA表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞裂解液及培养上清中ghrelin蛋白水平.(2)细胞以10 mmol/L葡萄糖处理0、0.5、1、2、6、12 h后,测定ghrelin mRNA及其蛋白表达情况.结果 (1)随着葡萄糖浓度的升高,ghrelin mRNA及蛋白表达水平出现下降,但当葡萄糖浓度大于15 mmol/L时,继续增加葡萄糖浓度对ghrelin mRNA及蛋白表达无明显影响.(2)在10 mmol/L葡萄糖作用下,随着培养时间的延长,ghrelin mRNA及蛋白表达水平出现下降,当超过6 h后,继续增加作用时间对ghrelin mRNA及蛋白表达无明显影响.结论 高浓度葡萄糖可抑制ghrelin的表达,可能是发生动脉粥样硬化的机制之一.

椎管内神经阻滞对妊高征孕妇分娩前后血浆一氧化氮水平的影响

Pinto等[1]于1991年首次证实妊高征孕妇脐静脉内皮细胞产生的一氧化氮(NO)含量明显低于正常孕妇,近年来的动物实验及临床研究资料表明NO减少是妊高征发病的关键环节.

血管内皮细胞生长抑制因子研究进展

血管内皮细胞抑制因子(vascular endothelial cell growth inhibitor,VEGI)是近发现的一种新型血管生成抑制因子,主要由血管内皮细胞合成,1997年Jan等[1]首先从人脐静脉内皮细胞(HVVEC)cDNA文库中筛选到的一个TNF超家族新成员.基因点位于染色体9q32当时命名为TL-1,其完整的VEGI成熟蛋白质由174个氨基酸组成,分子量是22 kDa.VEGI属于TNF家族成员,与TNF家族其它成员的氨基酸同源性为20%～30%,是Ⅱ型跨膜蛋白质.

结缔组织生长因子与狼疮肾炎

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是即刻早期基因中的CCN家族成员之一[1],初是由Bradham在人体脐静脉内皮细胞的条件培养基中发现[2].CTGF可由成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、癌细胞及平滑肌细胞合成分泌,人体许多组织如心脏、脑、胎盘、肺、肝、肌肉、肾及胰腺中均有表达,尤其在肾脏中含量较高.

尼古丁对脐静脉内皮细胞释放IL-6及PAI-1的影响

目的:探讨尼古丁干预人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后,白介素-6(IL-6)和纤溶酶原激活物抑制物-I(PAI-1)抗原的表达变化,并分析其相关性.方法:将4-6代HUVECs接种于24孔培养板.随机分为对照组与不同浓度尼古丁组.尼古丁浓度分别为0.1μmol/L、1.0μmol/L、10μmol/L与100μmol/L.12h后收集各组细胞上清液.采用酶联免疫吸附双抗体夹心分析法(ELISA)定各组细胞上清液中IL-6、PAI-1抗原浓度.结果:各浓度尼古丁组HUVECs释放IL-6抗原呈浓度依赖性增高,各尼古丁组IL-6含量与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).100μmol/L尼古丁组PAI-1含量与对照组比较升高(P<0.05).HUVECs释放PAI-1与IL-6呈正相关(P<0.05).结论在体外,尼古丁可诱导HUVECs释放IL-6、PAI-1增多,参与内皮损伤、炎症与纤溶活性紊乱.

ICAP-1对脐静脉内皮细胞PI3K表达及细胞增殖的影响

目的 研究整合素胞浆结构域关联蛋白-1(ICAP-1)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖及PI3K信号通路表达的影响,以进一步研究其生物学作用及其在血管形成中的作用机制.方法 通过构建PCDNA3.1-ICAP-1质粒并转染HUVEC,采用MTT法测定HUVEC增殖化,Western Blot检测ICAP-1及PI3K表达.结果 PCDNA3.1-ICAP-1转染组ICAP-1和PI3K表达明显增加,PCDNA3.1-ICAP-1转染组与正常对照组、PCDNA3.1-GFP转染组比较表达差异有统计学意义(P<0.05).PCDNA3.1-ICAP-1转染组较PCDNA3.1-GFP转染组和正常对照组细胞增殖能力增强,差异有统计学意义(P<0.05).结论 ICAP-1具有促进内皮细胞增殖的作用,ICAP-1可能通过上调PI3K表达,促进内皮细胞增殖达到促进血管新生的作用.