氯吡格雷对人脐静脉内皮细胞全基因表达谱的影响及生物信息学分析

本研究探讨氯吡格雷对体外培养人脐静脉内皮细胞( EA.hy926)基因表达谱的影响及作用的分子机制.将10 μmol/L氯吡格雷与人脐静脉内皮细胞株共培养48 h,运用Affymetrix U133 plus2.0全基因组表达芯片检测氯吡格雷对人脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响,应用分子注释系统MAS3.0软件进行聚类分析,实时定量RT-PCR验证基因表达谱结果.结果表明:氯吡格雷作用内皮细胞48 h后,基因芯片分析筛选出差异表达大于1.5倍的基因508个,其中上调基因139个,下调基因369个,包括蛋白结合、转录因子活性、锌离子结合、DNA依赖的转录的调节、转录、RNA剪接等相关基因,RT-PCR验证结果与基因芯片结果一致.结论:氯吡格雷在基因水平通过多条通路调节内皮功能.

利用基因芯片技术研究造血生长因子在脐静脉内皮细胞中的表达

为探讨利用基因芯片技术研究脐静脉内皮细胞中造血生长因子基因的表达情况,将体外培养的人脐静脉内皮细胞(ECV304)分为血管内皮生长因子(VEGF)处理组(添加50 ng/ml的rhVEGF165)和正常对照组;培养24小时后收获细胞,提取总RNA,制备Cy3-dUTP标记的对照组cDNA探针和Cy5-dUTP标记的VEGF组cDNA探针,并与表达谱芯片杂交.杂交信号经荧光共聚焦显微镜扫描后,计算机分析基因表达情况.结果显示,两组细胞均表达多种造血生长因子及受体如Epo/R、GM-CSF/R、G-CSF/R、LIF、IL-3、TPO、Flt-3和SCF;同时也表达多种生长因子(VEGF、IGF2、PDGFA、PDGFB、TGFβ1)和生长因子受体(神经纤维黏蛋白-1,神经纤维黏蛋白-2,TGFβ-R1);此外,共有24个基因存在差异表达.结论:利用基因芯片技术能够在短时间内迅速而准确地分析脐静脉内皮细胞众多造血生长因子及其受体的表达情况,为进一步研究内皮细胞的生物学特性提供了有效手段.

低氧诱导肺动脉内皮细胞间质细胞衍生因子-1的表达及其调控机制

肺血管重塑(PVR)是低氧性肺动脉高压持续且难以逆转的主要原因,其主要病变表现为肺动脉壁细胞增多,但其来源和机制仍不清楚.研究表明骨髓和外周血中存在血管壁细胞的祖细胞,并且参与了PVR的形成[1-3].间质细胞衍生因子-1(SDF-1)是特异性介导干细胞归巢至骨髓,介导祖细胞归巢至损伤或缺血组织的关键因子,SDF-1表达在这些部位的血管内皮细胞,而低氧是这些部位的微环境特征,也是诱导SDF-1表达的主要原因[4-5].低氧诱导因子-1α(HIF-1α)是特异性介导细胞低氧反应的关键因子,直接调控脐静脉内皮细胞SDF-1基因的表达[6].我们旨在探讨低氧对肺动脉内皮细胞SDF-1表达的影响及HIF-1α对其表达的调控作用.

人脐静脉内皮细胞对流感病毒血凝素的免疫应答研究

目的 探讨流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)重组蛋白接种人脐静脉内皮细胞后,细胞固有免疫反应机制.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC),以H3N2、H9N2株重组HA和灭活H9N2病毒分别接种HUVEC,24h后检测HUVEC细胞因子的表达.结果 HA(H3和H9亚型)接种HUVEC后24 h,干扰素IFN-β的mRNA和蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(H3亚型接种组IFN-β mRNA和蛋白表达水平,P=0.051、0.839;H9亚型接种组IFN-β mRNA和蛋白表达水平,P=0.127、0.561),干扰素诱导基因IFITM3和CCL5表达水平与对照组比较差异无统计学意义(H3和H9亚型接种组IFITM3 mRNA表达量,P=0.530、0.269;H3和H9亚型接种组CCL5 mRNA表达量,P=0.314、0.429).接种灭活H9 N2病毒组细胞IFN-β的mRNA和蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P=0.061、0.567),但是干扰素诱导基因IFlTM3和CCL5的mRNA的表达水平与对照组比较差异显著升高(P=0.047、0.022).结论 流感病毒HA蛋白单独接种内皮细胞不能有效启动细胞固有免疫应答,需要完整病毒颗粒才能有效激活内皮细胞免疫应答反应.

HCMV感染致培养脐静脉内皮细胞活化和氧化应激的作用

目的 初步探讨人巨细胞病毒(HCMV)感染致内皮细胞损伤的机制.方法 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),以HCMV AD169株感染HUVEC,24 h后通过实时定量PCR方法检测细胞粘附分子VCAM-1 mRNA的表达.通过硝酸还原酶法检测细胞培养基中一氧化氮(N0)含量的变化.结果 HUVEC感染HCMV后24 h,VCAM-1 mRNA的表达水平较对照组明显增加,两组间差异具有统计学意义(P＜0.05).感染HCMV后0～36 h的不同时间点,感染组细胞培养上清中NO含量均较对照组增加,呈现时间依赖性,各时间点两组间差异均具有统计学意义(P＜0.01).结论 HCMV感染可增强内皮细胞氧化应激活动,可能在血管内皮细胞活化损伤过程中起重要作用..

人巨细胞病毒感染对脐静脉内皮细胞粘附分子和核转录因子表达的影响

目的研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)体外感染对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表面细胞间粘附分子-1(ICAM-1)mRNA和核转录因子kappa B(NF-κB)表达的影响,探讨NF-κB活化与ICAM-1 mRNA表达的关系. 方法用RT-PCR方法检测ICAM-1 mRNA的表达,用凝胶电泳迁移率改变试验(EMSA)检测NF-κB活性. 结果 HUVEC感染HCMV后1h,NF-κB活性增加(P＜0.05),感染后2h,ICAM-1 mRNA表达增加(P＜0.05),二者均于8h达高峰,至24h时仍维持较高表达(P＜0.01);加入NF-κB活性抑制剂四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯(PDTC)后,NF-κB活性明显减弱,同时ICAM-1 mRNA的表达也明显降低(P＜0.01). 结论 HCMV感染可激活NF-κB,使ICAM-1 mRNA的表达增加,从而引导炎症反应至感染部位,并有利于病毒感染在细胞间扩散.NF-κB参与ICAM-1转录的调控,其活性变化影响ICAM-1 mRNA的表达.

高糖对脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子mRNA表达的影响

目的 观察高糖对脐静脉血管内皮细胞生长因子(VEGF)信使核糖核酸(mRNA)表达的影响.方法 胰酶消化法制备人脐静脉内皮细胞并传代培养,取生长良好的第2、3代细胞进行实验.用不同浓度葡萄糖(0 mmol/L、5.5mmol/L、11 mmol/L、22 mmol/L、44 mmol/L)作用48 h,并选取22 mmol/L葡萄糖分别作用0 h、24 h、48 h、72 h、96 h,观察VEGF mRNA的变化.结果 脐静脉VEGF mRNA的表达随高糖浓度的增加也逐渐增加(P＜0.05),至22 mmol/L达到高峰,44 mmol/L时下降;在22 mmol/L葡萄糖作用下,随着作用时间的延长,VEGF mRNA水平逐渐增加(P＜0.01),但当作用72 h时VEGF mRNA水平不再升高.结论 高血糖本身可引起脐静脉内皮细胞VEGF mRNA表达的增加,且在一定范围内呈时间和剂量依赖性.

瑞舒伐他汀钙抑制尼古丁诱导的人脐静脉内皮细胞基质金属蛋白酶2的表达

目的 探讨瑞舒伐他汀钙对尼古丁诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响.方法 取健康剖腹产孕妇的HUVEC进行培养,选择2～4代细胞进行实验(n=5).分别采用不同浓度(0、1、10、100μmol/L)尼古丁进行24 h处理以及采用100 μmol/L尼古丁进行不同时间(0、6、12、24、48 h)处理,处理后细胞进行半定量RT-PCR,Western blot检测MMP-2 mRNA及蛋白的表达(n=5);内皮细胞首先用系列浓度(2,4,7,10 μg/L)瑞舒伐他汀钙进行预孵育12 h,然后对药物干预后细胞进行100 μmol/L尼古丁处理24 h(n=50).结果 尼古丁呈浓度及时间依赖性诱导HUVEC中MMP-2表达:MMP-2表达随尼古丁浓度增加而升高;尼古丁诱导MMP-2表达随时间延长而增加.瑞舒伐他汀钙可浓度依赖性地抑制尼古丁诱导的MMP 2的表达[mRNA水平:2、4、7、10 μg/L抑制率分别为8.6％、42.5％、66.9％、80.3％,均P＜0.05;蛋白水平:2、4、7、10 μg/L抑制率分别为10.6％ 、37.6％ 、74.1％、88.2％,均P＜0.05].结论 尼古丁是诱导HUVEC中MMP表达的重要因素;瑞舒伐他汀钙能够抑制该进程,且具有剂量依赖性.

重组C反应蛋白促进脐静脉内皮细胞表达基质金属蛋白酶2

目的 观察重组C反应蛋白(CRP)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响.方法 采用逆转录聚合酶链反应及蛋白质免疫印迹分析检测MMP-2 mRNA转录和蛋白水平表达,观察不同浓度CRP及不同孵育时间对HUVEC MMP-2表达的影响.结果 CRP呈浓度和时间依赖性增加培养HUVEC的MMP-2 mRNA转录和蛋白水平的表达.结论 CRP可上调HUVEC MMP-2表达.

阿司匹林抑制肿瘤坏死因子α诱导的人脐静脉内皮细胞分形趋化因子表达

背景 分形趋化因子通过介导炎症细胞的趋化与血管内皮损伤相关,阿司匹林具有抗炎作用,抑制多种细胞因子表达,其对分形趋化因子的影响尚无报道.目的 探讨阿司匹林对肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分形趋化因子表达的影响和作用机制.方法 将HUVEC随机分为:空白组(无TNF-α刺激和药物干预),TNF-α刺激组,TNF-α+PDTC干预组(PDTC系核因子κB的特异性活性抑制剂),TNF-α+NS398干预组(NS398是COX-2的特异性活性抑制剂).TNF-α+阿司匹林0 02 mol/L干预组,TNF-α+阿司匹林0 2 mol/L干预组,TNF-α+阿司匹林1 mol/L干预组,TNF-α+阿司匹林5 mol/L干预组,共8组,每组3例.分别用RT-PCR法和Western blot法检测各组细胞分形趋化因子(分形素)和核因子κB p65(NF-κB p65)的mRNA水平和蛋白表达.结果 1)4 μg/L TNF-α使HUVEC的分形趋化因子mRNA水平和蛋白表达明显增加(P<0 01).2)阿司匹林浓度依赖性抑制TNF-α诱导的HUVEC分形趋化因子mRNA水平和蛋白表达(P<0 01);阿司匹林浓度依赖性地抑制HUVEC的NF-κB p65 mRNA水平和蛋白表达(P<0 01).3)PDTC抑制TNF-α诱导的HUVEC分形趋化因子mRNA水平和蛋白表达(均P<0 01).结论 阿司匹林通过NF-κB p65途径抑制TNF-α诱导的HUVEC 分形趋化因子mRNA水平和蛋白表达,并可能借此发挥抗动脉粥样硬化作用.

抵抗素对内皮细胞NO生成的影响及Akt信号机制

目的 探讨抵抗素对内皮细胞NO生成的影响及其可能的信号机制.方法 分离、培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),以不同浓度抵抗素(15、50、100 ng/ml)干预.荧光显微镜检测各组细胞中NO的生成,RT-PCR检测eNOS mRNA表达水平,Western blot检测Akt和eNOS磷酸化水平. 结果 15、50、100ng/ml抵抗素干预HUVECs 24h后,胰岛素刺激的内皮NO生成显著降低(三组分别为4.01±0.69、3.76±0.71、3.73±0.45,vs 对照组P均＜0.05),同时伴有内皮Akt和eNOS磷酸化水平的降低(vs 对照组P均＜0.05),而eNOS mRNA表达无显著改变. 结论 抵抗素可通过PI3K/Akt途径影响HUVECs eNOS磷酸化水平,进而调节内皮细胞NO生成,但该影响并非Akt依赖性.

探讨血管紧张素Ⅱ对人脐静脉内皮细胞产生超氧阴离子和1型纤溶酶原激活物抑制剂的作用机制

目的:探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)产生超氧阴离子(O-2)和1型纤溶酶原激活物抑制剂( PAI-1)的作用机制及0-2与PAI-1产生之间的关系.方法:第一部分实验:观察血管紧张素Ⅱ不同浓度及不同作用时间对HUVEcs产生0-2和PAI-1的作用.分为对照组,AngⅡ10-8～10-5 moL/L不同浓度组,AngⅡ10-6mol/L作用不同时间(0、6、12、24和48h).第二部分实验:观察不同浓度的缬沙坦对AngⅡ诱导HUVECs产生O-2和PAI-1的作用.分为对照组,缬沙坦(10-6 mol/L)组,AngⅡ(10-6mo/L)组,AngⅡ(10-6mol/L)+不同浓度缬沙坦(10-8～ 10-5mol/L)组.第三部分实验:观察缬沙坦、二甲苯基碘、超氧化物歧化酶对AngⅡ使HUVECs产生O-2和PAI-1的作用.分为对照组,AngⅡ(10-6 mol/L)组,AngⅡ(10-6 mol/L)+缬沙坦(10-6mol/L)组,AngⅡ(10-6mol/L)+二甲苯基碘(10μmol/L)组,AngⅡ(10-6mol/L)+超氧化物歧化酶(2μl)组.用酶消化法收集并培养HUVECs,采用氯化硝基四氮唑蓝还原法测定上清液O-2浓度,用酶联免疫吸附法测定上清液PAI-1浓度.结果:①AngⅡ在10-8～10-5mol/L范围内呈浓度依赖性地使HUVECs产生O-2和PAI-1增加.②缬沙坦在10-8～10-5mol/L范围内呈浓度依赖性地降低AngⅡ促HUVECs产生O-2和P1AI-1的作用.③二甲苯基碘和超氧化物歧化酶可显著抑制AngⅡ刺激HUVECs产生0-2及PAI-1.结论:①AngⅡ通过作用于AngⅡ受体1(AT1)激活还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶途径呈浓度和时间依赖性地使HUVECs产生O-2和PAI-1增加.②AngⅡ通过增加O-2产生而致PAI-1产生增加,提示抗氧化治疗有助于预防血栓性疾病的发生.

尾加压素Ⅱ对人类脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

细胞膜微粒对内皮细胞凋亡影响的研究

目的 探讨体外内皮细胞膜微粒(endothelial microparticle,EMPs)对血管内皮细胞凋亡功能的影响.方法 将内皮细胞自身产生的膜微粒与内皮细胞共培养,评估共培养下内皮细胞凋亡的变化.结果 7.66×104,7.66×103,7.66×102个/ml浓度的EMPs组(简称高、中、低浓度组)其内皮细胞caspase-3活性、磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)活性表达均高于0个/ml浓度EMPs的对照组(P＜0.05).PCR检测凋亡基因变化后,发现高、中浓度EMPs组APAF-I(apoptotic protease activating factor-1)基因表达较对照增高(P=0.003、P=0.000),低浓度组没有明显差异(P=0.272),AIF(apoptosis-inducing factor)基因方面,以Realtime-PCR方法测定,RQ值代表的是各组/对照组的基因表达量,则提示高中浓度EMPs组AIF表达较对照增高(RQ=1.836、RQ=1.324),低浓度组则呈现下降(RQ=0.569).结论 内皮细胞膜微粒在体外可促进血管内皮细胞凋亡发生.7.66×104、7.66×103、7.66×102个/ml浓度EMPs可促进细胞Caspase-3、PS表达活性增强,7.66×104、7.66×103个/ml浓度EMPs可促进APAF-1、AIF凋亡基因表达,7.66×102个/ml浓度无明显促进作用.

结缔组织生长因子在皮肤纤维化疾病中的作用

1991年Bradham等[1]在应用血小板源生长因子抗体筛选人类脐静脉内皮细胞cDNA文库时,首次发现了人类结缔组织生长因子(connective tissuegrowth factor,CTGF).研究表明CTGF广泛表达于人类多种组织器官中,其过度表达与某些增生性或纤维化性疾病的发生、发展密切相关,如硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤维化、动脉粥样硬化等.

组织因子基因沉默对胎盘早剥人脐静脉内皮细胞的影响

目的 利用RNA干扰技术对胎盘早剥(placental abruption,PA)和正常出生的新生儿脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVECs)组织因子(tissue factor,TF)的表达进行干预.方法 收集2008年11月至2010年2月胎盘早剥(placental abruption,PA)产妇分娩胎儿(足月或早产不限)6例的脐带(PA组)及6例同期正常产妇分娩胎儿的脐带(正常对照组).构建RNA干扰TF基因表达载体及RNA 干扰沉默PA胎儿HUVECs TF基因表达.两组分别进行以下处理:(1)空白未干扰对照;(2)假干扰对照;(3) RNA干扰TF基因表达.观察处理后HUVECs在基因沉默前后的mRNA表达、TF蛋白水平免疫荧光检测的变化.结果 将构建的pENTRTM/U6-TF-shRNA转染到正常对照组和PA组,正常对照组HUVECs在转染后TF mRNA水平较空白对照的0.657±0.097下降至0.220±0.030; PA组则由1.323±0.323下降至0.207±0.150.与正常对照组比较,TF mRNA表达在PA组空白对照处理(1.323±0.323 vs0.657±0.097,P=0.023)、假干扰处理(1.057 ±0.178 vs 0.540±0.079,P =0.01)后差异均有统计学意义,而RNA干扰处理后正常对照组和PA组之间TFmRNA的表达差异无统计学意义(0.220 ±0.030 vs 0.207 ±0.150,P＞0.05).在正常对照组及PA组内,各处理间差异均有统计学意义(F=27.657,P=0.001;F=19.299,p=0.002).结论 构建的pENTRTM/U6-TF-shRNA成功转染到HUVECs,显著抑制PA 产妇胎儿HUVECs中TF的表达.

密蒙花方对缺氧状态下脐静脉内皮细胞增殖及HIF-1а表达的影响

目的 研究密蒙花方对缺氧状态下人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial.HUVEC)增殖及缺氧诱导因子1а(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1а)表达的影响.方法 应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测密蒙花方对缺氧状态下HUVEC增殖的影响.应用免疫细胞化学法检测密蒙花方对缺氧状态下细胞中HIF-1а表达的影响.结果 在缺氧状态下,HUVEC增殖明显且细胞中HIF-1а表达增高(P<0.01),密蒙花方能有效的抑制细胞增殖及HIF-1а表达,并呈浓度依赖关系.结论 密蒙花方可能通过抑制HIF-1а的表达而抑制血管内皮细胞的增殖,从而对新生血管的形成起到一定的抑制作用.

不同浓度同型半胱氨酸对培养的人脐静脉内皮细胞分泌一氧化氮及内皮素的影响

目的研究不同浓度的同型半胱氨酸(Hcy)对内皮细胞分泌一氧化氮(NO)、内皮素(ET)的影响.方法收集人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行细胞培养,传至第三代后,将其与不同浓度的Hcy共同培养24h,分别在4、6、8、24h检测培养液中NO、ET的含量.结果 HUVEC与不同浓度的Hcy培养24h后,其NO呈剂量依赖性下降(P＜0.01),ET也呈剂量依赖性降低(P＜0.05),但ET/NO却较对照组明显升高(P＜0.05).结论 Hcy可以导致血管内皮细胞释放活性因子NO、ET减少.

二甲双胍下调ROS-PKCβ2通路对高糖波动加重的人内皮细胞损伤的干预作用

目的 观察波动性高糖与持续性高糖对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)mRNA表达的影响,探讨活性氧(ROS)和蛋白激酶Cβ2(PKCβ2)在其中的作用及二甲双弧的干预作用.方法 将培养的HUVECs分为7组:①正常糖(NG,5mmol/L D-葡萄糖)组,②正常糖空载体转染组(NN,NG+Ad5-null)组,③持续性高糖(SHG,15mmol/L D-葡萄糖)组,④波动性高糖(IHG,5mmol/L D-葡萄糖与25mmol/L D-葡萄糖每24h更换一次)组,⑤波动性高糖+PKCβ2转染(IHGB,IHG+Ad5-PKCβ2)组,⑥波动性高糖+二甲双胍(IHGM,IHG+20/μmol/L二甲双胍)组,⑦波动性高糖+选择性的PKCβ2抑制剂CGP53353(IHGI,IHG+00μmol/L CGP53353)组或波动高糖+α-硫辛酸(ALA)(IHGA,IHG+62.5.μmol/L ALA)组.RT-PCR法检测细胞VEGF、VCAM-1 mRNA表达水平,荧光酶标仪测定细胞ROS水平,激光共聚焦显微镜下检测PKCβ2蛋白表达和转位情况.结果 与NG组比较,NN组的空载体转染对细胞无明显生物学意义(P＞0.05).SHG组和IHG组VEGF、VCAM-1mRNA表达及ROS水平增加,分别为NG组的2.16倍、2.30倍、1.75倍和2.57倍、3.32倍、3.20倍,且IHG组增加更明显(P＜0.05).SHG组和IHG组PKCβ2核转位激活,定量分析显示胞质/胞核荧光强度比值较NG组分别下降了21%和26%,且IHG组下降更加明显(P＜0.05);IHGB组PKCβ2核转位较IHG组更显著,胞质/胞核荧光强度比值为IHG组的75%,同时IHGB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达以及ROS水平亦显著增高,分别为IHG组的1.38倍、1.45倍和1.25倍(P＜0.05).IHGM组VEGF、VCAM-1mRNA表达及ROS水平均较IHG组明显降低,为IHG组的44%、53%和39%;IHGM组PKCβ2核转位亦较IHG组减少,胞质/胞核荧光强度比值为IHG组的1.20倍(P＜0.05).结论 波动高糖较持续高糖更易损伤HUVECs,该作用与ROS-PKCβ2活化密切相关;二甲双胍可通过抑制PKCβ2激活,减轻波动性高糖诱导的HUVECs损伤.

血管内皮细胞生长因子对内皮细胞放射损伤的保护作用

目的探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)对原代脐静脉内皮细胞放射损伤的保护作用.方法采用HE染色及MTT法观察6 Gy和12 Gy辐射对内皮细胞形态及增殖活性的影响,同时观察VEGF对内皮细胞放射损伤的保护作用.结果放射损伤组在细胞大小和形态方面发生明显改变,6 Gy能引起内皮细胞增殖活性增强,而12 Gy则导致活性下降;VEGF明显促进内皮细胞增殖,并能改善12 Gy所引起的损伤.结论 VEGF可作为放射损伤的拮抗剂,在创面修复中具有很好的应用前景.