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人硫氧还蛋白1在大肠杆菌中的重组表达及其对高糖导致的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用
目的 克隆人硫氧还蛋白1(hTRX1)基因并构建其原核表达载体,获得重组人硫氧还蛋白1(rhTRX1),评价rhTRX1对高糖导致的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的保护作用.方法 采用逆转录PCR方法扩增hTRX1基因片段,插入pET22b(+)质粒并转化大肠杆菌Rosetta-gami(2),获得工程菌Rosetta-gami(2)-pET22ab(+)/hTRX1.用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定重组蛋白的正确性,用镍亲和层析纯化重组蛋白.采用高糖制备HUVEC损伤模型,MTT比色法检测HUVEC的存活率,生化方法测定HUVEC中乳酸脱氢酶(LDH)的外漏率以及细胞上清液中一氧化氮(NO)的水平.结果 构建的工程菌及其产生的重组蛋白rhTRX1正确.与正常对照组比较,高糖损伤组HUVEC的存活率降低、LDH外漏率明显升高,NO的水平明显地降低.不同剂量rhTRX1处理组HUVEC的存活率升高、LDH的外漏率明显降低,NO的水平明显地升高.结论 成功克隆并在大肠杆菌中表达rhTRX1、获得结构正确的rhTRX1,rhTRX1对高糖诱导的HUVEC损伤具有保护作用.
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炙甘草汤及相应细胞培养上清对脐血BFU-E形成的影响
目的:探讨炙甘草汤及相应细胞培养上清对脐血单个核细胞BFU-E形成的影响.方法:新鲜脐血经淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,实验采用炙甘草汤与右归饮两个中药方剂,单个核细胞设空白对照组、炙甘草汤组、右归饮组、混合组及相应细胞培养上清组,每组分别加入中药液或细胞培养上清,甲基纤维素半固体培养基培养10 d后观察集落形成情况.结果:细胞培养上清组均能刺激细胞集落形成,其中尤以炙甘草汤组为明显,其次是混合组与右归饮组.炙甘草汤培养上清组与混合培养上清组两组与空白培养上清组相比,刺激效果明显.结论:炙甘草汤细胞培养上清能明显刺激脐血单个核细胞集落形成,对脐血细胞扩增有明显效果.
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DM/PM中核因子-κB的表达及作用机制探讨
目的 通过研究NF-κB在DM/PM患者骨骼肌的表达情况,以及DM患者血清体外对脐静脉内皮细胞(HUVEC)NF-κB表达的影响,初步探讨NF-κB在DM/PM中的相关作用的机制.方法 采用免疫组织化法对25例DM/PM患者骨骼肌中的NF-κB(P65)进行检测,取16例DM患者治疗前和6例治疗后的血清加入体外培养的HUVEC中,用细胞免疫组织化法检测HUVEC株NF-κB(P65)的表达.结果 NF-κB(P65)在DM/PM患者骨骼肌内的微血管内皮细胞和肌纤维中表达上调,与正常对照组相比差异有显著性(P＜0.05),正常对照组无表达；DM患者治疗前血清体外作用HUVEC 6h后,(11.126±1.920)％细胞表达阳性,24h后细胞的阳性率上升到(17.048±1.140)％,差异有统计学意义(P＜0.01)；治疗后血清对脐静脉内皮细胞(HU-VEC)的NF-KB(P65)阳性表达率分别为(6.797±0.609)％(6h)和(11.273±0.643)％ (24h),二者均低于相应的治疗前表达率(P＜0.01).结论 NF-κB在DM/PM肌肉微血管肌纤维的炎症性反应过程中发挥重要作用,其在DM患者血清中可能有激活NF-κB的成分.
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原代脐静脉内皮细胞NFKB1基因启动子区缺失型较插入型P50蛋白表达降低
目的 探讨核因子κB1基因(NFKB1)启动子区-94位点插入/缺失ATTG碱基(-94ins/del ATTG)多态性在氧化应激中对人原代脐静脉内皮细胞(HUVEC) NF-κB信号通路中P50、P65水平的影响.方法 分离并培养HUVEC,采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)法将HUVEC分为插入型(Ⅱ型)、缺失型(DD型)以及杂合子型(ID型),并依据其基因型分型在空白组及H2O2诱导组中分为Ⅱ型、ID型、DD型3个亚组;H2 O2建立HUVEC氧化应激模型,采用CCK-8法检测细胞增殖活性选取适宜的H2 O2诱导浓度及时间;Western blot法检测各组HUVEC总蛋白及核蛋白P50、P65蛋白水平.结果 共收集23例HUVEC,其中Ⅱ型8例、ID型9例、DD型6例;CCK-8试剂盒确定H2O2诱导浓度为200 μnol/L,诱导时间为12 h;在空白组及H2O2诱导组中纯合子DD型P50蛋白水平均较Ⅱ型显著降低.结论 NFKB1 (rs28362491)基因多态性对P50蛋白表达影响显著.
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红景天抑制人脐静脉内皮细胞生长的初步研究
目的: 利用体外培养人脐静脉内皮细胞,观察中药红景天对细胞生长的影响,初步探讨急、慢性高原病患者服用中药红景天防治高原病及改善症状等的作用机制.方法: 培养人脐静脉内皮细胞EVC-304,设对照组与加药组,加药组分别加入不同浓度的红景天,培养3 d后计数.加药组及对照组细胞用瑞氏染料染色并拍照.收集细胞以流式细胞术检测细胞周期.结果: 对照组细胞形态正常,成梭形,排列紧密,分散均匀.加药组细胞数量明显减少,细胞皱缩,聚集成团,形态各异.流式细胞术检测显示加药组G1期细胞含量增多,S期细胞减少.结论: 红景天具有抑制血管内皮细胞生长的作用,可能是通过抑制细胞的增殖来抑制内皮细胞生长.抑制血管内皮细胞生长对于阻止血管内膜增生,防止形成肺动脉高压,降低慢性高原病发病率具有实际应用意义.
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TNF-α对血栓调节蛋白表达活性的影响及其作用机制的探讨
目的 观察肿瘤坏死因子(TNF)-α对血栓调节蛋白(TM)在原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的表达和活性的影响,并初步探讨其作用机制.方法 体外培养HUVECs,实验分为3组:①对照组:加入与TNF-α等体积的PBS培养细胞6h;②TNF-α组:TNF-α终浓度为10 ng/ml孵育细胞6h;③BAY11-7082抑制组:BAY11-7082终浓度2 μg/ml孵育细胞1h阻断NF-κB通路后再用10 ng/ml的TNF-α干预细胞6h.分别采用流式细胞技术、荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和酶标仪检测TM蛋白、mRNA表达及活性强度.结果 TNF-α组相比与对照组和BAY 11-7082抑制组在TM的蛋白、mRNA水平上均明显降低(P＜0.05),TM活性也明显减弱(P＜0.05).而BAY11-7082抑制组相比与对照组在TM蛋白水平和活性均无差异,在mRNA水平上升高(P＜0.05).结论 TNF-α可明显降低TM表达,并抑制其活性,NF-κB通路参与了这一过程.
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ERK1/2信号通路在内皮微粒诱导人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达中的作用
目的:探讨细胞外信号调节激酶1/2( ERK1/2)信号通路在内皮微粒(EMPs)诱导人脐静脉内皮细胞(HU-VECs)表达细胞间黏附分子-1(ICAM-1)中的作用.方法:体外培养HUVECs,选取生长良好的第4～5代细胞,分为EMPs不同浓度作用组、EMPs不同时间作用组及ERK1/2特异性抑制剂组.应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测ICAM-1和磷酸化ERK1/2蛋白的表达.用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ICAM-1 mRNA的表达.结果:EMPs作用HUVECs后,ICAM-1 mRNA和其蛋白以及磷酸化ERK1/2蛋白的表达显著高于对照组,且呈浓度和时间依赖性的关系(均P＜0.01)；而ERK1/2特异性抑制剂PD98059对ICAM-1 mRNA和其蛋白以及磷酸化ERK1/2蛋白的表达,均有明显的抑制作用(均P＜0.01).结论:EMPs可诱导HUVECs中ICAM-1表达,其机制可能与激活ERK1/2信号通路有关.
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芪丹通脉片保护缺氧内皮细胞的实验研究
目的 观察芪丹通脉片(QDTMT)对缺氧内皮细胞的保护机制.方法 原代培养、鉴定人脐静脉内皮细胞(HuVECs).制备含QDTMT的血清并干预传代的HuVECs.将HuVECs根据不同处理因素随机分为3组:空白对照组、生理盐水组和QDTMT组,用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率.用免疫荧光染色法检测生理盐水组和QDTMT组细胞上血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的表达.结果 培养的HuVECs中具有特征性的短棒状细胞器Weible-Palade小体.流式细胞仪检测结果显示,与空白对照组相比,缺氧培养的HuVECs的凋亡率增加,但QDTMT组内皮细胞的凋亡率明显低于生理盐水组(P<0.05).免疫荧光染色检测可见QDTMT组内皮细胞VEG-FR2的表达强于生理盐水组.结论 QDTMT抗缺氧的HuVECs凋亡的作用可能与其促进VEGFR2的表达有关.
关键词： 芪丹通脉片 凋亡 脐静脉内皮细胞 血管内皮生长因子受体2 缺氧 -
应用免疫沉淀-质谱法筛选肿瘤血管靶向肽CGNSNPKSC的结合受体
目的:筛选和鉴定肿瘤血管靶向肽GX1(CGNSNPKSC)的结合受体.方法:化学合成生物素标记的GX1,培养内皮细胞并收集细胞膜蛋白;利用免疫沉淀的方法进行免疫磁珠分离,富集能与血管特异性短肽GX1结合的蛋白质;利用生物素-亲和素系统进行western blot免疫检测,筛选出能和GX1结合的目的条带;利用液相色谱-二级质谱(LC-MS/MS)埘能与血管特异性短肽GX1结合的蛋白质进行测序鉴定.结果:利用免疫沉淀和western blot的方法,获得了能与GX1结合的蛋白条带,其分子量为13KDa.利用LC-MS/MS及生物信息学分析,获得了8个候选蛋白:cDNA FLJ40018fis,clone STOMA2006398,cytochromeP450 19A1,probable histone-lysine N-methyltmnsferaseASH1L,adenylyl cyclase-associated protein 2(CAP2),similar to ankyrin repeat domain 20A,diacylglycerol kinase iota(DGKI),isoform2 of Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1,similar to annexinA2 isoforml.结论:利用免疫沉淀-质谱法获得了8个GX1结合受体的候选蛋白,为进一步寻找血管抑制治疗的靶标奠定了一定的实验基础.
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EGFL7和FAK在婴幼儿血管瘤组织中的表达及其相关性
目的 探讨表皮生长因子样结构域(EGFL7)和黏着斑激酶(FAK)在婴幼儿血管瘤组织中的表达及相关性.方法 采用免疫组织化学(SP法)方法检测婴幼儿血管瘤和正常皮肤组织中EGFL7和FAK的表达水平;培养脐静脉内皮细胞(HU-VEC),用Western-blot方法,检测在不同重组人EGFL7浓度下,EGFL7和FAK蛋白的表达情况.结果 婴幼儿血管瘤增生期组织中EGFL7和FAK的表达明显高于消退期和正常皮肤组织(P＜0.05),而消退期组和正常皮肤组比较差异无统计学意义(P ＞0.05),EGFL7和FAK蛋白的表达与脐静脉内皮细胞(HUVEC)中重组EGFL7的浓度呈正相关.结论 EGFL7和FAK可能通过影响血管形成参与了婴幼儿血管瘤的发展,EGFL7蛋白可能成为预测婴幼儿血管瘤的病情发展及指导临床治疗的标志物之一.
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不同浓度Hcy对培养的人脐静脉内皮细胞NO及eNOS转录水平的影响
目的: 通过培养的人脐静脉内皮细胞(human umblilical vein endothelial cell, HUVEC),研究不同浓度的同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)对内皮细胞分泌一氧化氮(NO)以及对内皮源性一氧化氮合酶(eNOS)转录水平的影响. 方法: 收集HUVEC,然后进行细胞培养,传至第3代后,将其与不同浓度的Hcy(生理浓度0.01 mmol*L-1、病理生理浓度0.5 mmol*L-1、非毒性药理浓度2.0 mmol*L-1、毒性药理浓度5.0 mmol*L-1)共同培养24 h,分别在4, 6, 8和24 h检测培养液中NO的含量. 24 h后,收集HUVEC,提取总的RNA,利用eNOS特异性引物进行逆转录,从而探讨Hcy对eNOS mRNA水平的影响. 结果: HUVEC与不同浓度的Hcy培养24 h后,其NO呈现剂量依赖性的下降(24 h时,各浓度Hcy的培养液中的NO的含量分别为19.71±3.88 μmmol*L-1, 14.08±4.46 μmmol*L-1, 8.71±6.63 μmmol*L-1, 7.01±3.63 μmmol*L-1, 2.37±0.77 μmmol*L-1, P<0.01),但24 h后,eNOS的RT-PCR结果显示各组间的产物电泳带无明显的差异. 结论: Hcy可以导致内皮细胞释放NO减少,但对eNOS的转录却没有明显的影响.
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同型半胱氨酸对体外人脐静脉内皮细胞ET的影响
1 实验资料无菌条件下,从健康产妇新生胎儿脐带收集人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行培养,传至第3代,使用完全培养液调细胞浓度于1×108 mL-1, 加入生理浓度、病理生理浓度0.5 mmol*L-1、非毒性药理浓度和毒性药理浓度分别为0.01, 0.85, 2.00和5.0mmol*L-1的同型半胱氨酸(Hcy)以及不含Hcy的空白对照液继续培养,每组做6个样本,分别于4, 6, 8, 24 h吸取培养液约2 mL,测定ET的含量. ET的检测应用南京建成生物工程研究所的试剂盒. 所有计量资料均用±s表示,统计方法采用多因素方差分析.
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巨细胞病毒感染诱导移植排斥反应的机制研究
目的 以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)ECV304株作为研究对象,探讨巨细胞病毒(CMV)感染诱发排斥反应的机制.方法 体外培养ECV304,施加不同干预因素,分为正常对照组、灭活病毒作用组、病毒作用组、病毒上清液作用组及病毒与更昔洛韦组.运用免疫组化技术检测不同组别内皮细胞表面细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达.结果 正常对照组内皮细胞ICAM-1的表达呈弱阳性,加入灭活的病毒及病毒上清液后,ICAM-1的表达仍为弱阳性(P＞0.05);加入有活力的病毒后,内皮细胞ICAM-1的表达呈强阳性,积分指数显著高于上述3组(P＜0.01);在CMV感染内皮细胞的同时加入更昔洛韦,细胞表面ICAM-1表达强度较病毒组并无减低(P＞0.05).结论 CMV感染的内皮细胞表面ICAM-1的表达明显增加.通过诱导内皮细胞表面ICAM-1表达上调可能是CMV诱发排斥反应的机制之一.
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小肠黏膜下层促血管内皮细胞体外增殖及成血管化作用
目的 探讨体外共培养条件下小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)对脐静脉内皮细胞(umbilical vein endothelial cells,UVECs)增殖及成血管化功能的影响.方法 采用胶原酶消化法原代培养获取UVECs并进行细胞形态学及免疫荧光鉴定.组织工程学方法制备SIS,免疫组化及酶联免疫吸附(ELISA)法检测SIS中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b-FGF)等.建立UVECs与SIS体外共培养体系,设UVECs单独培养为对照组,比较两组UVECs的增殖状况及成血管化作用.结果 通过原代培养成功获得UVECs.免疫组化检测制备的SIS主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白等细胞外基质成分组成;ELISA检测SIS孵育液中VEGF、b-FGF质量浓度分别为(48.83±5.67)、(72.36±8.71)ng/mL.体外共培养时,UVECs单独培养组无血管样结构形成,UVECs和SIS共培养组较UVECs单独培养组UVECs生长相对致密,且有血管样结构形成;UVECs生长曲线于UVECs和SIS共培养组上移,在对数生长期的第4、5天,UVECs和SIS共培养组UVECs细胞数分别为(7.91±0.42)×104、(9.15±0.48)×104,大于UVECs单独培养组的(4.26±0.27)×104、(6.71±0.31)×104(P<0.01),计算UVECs和SIS共培养组UVECs群体倍增时间短于UVECs单独培养组(P<0.01).结论 SIS和UVECs体外共培养时,SIS可通过其Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白等细胞外基质成分及所含的血管内皮细胞各生长因子等促进UVECs增殖及成血管化.
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心肌营养素-1对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移、管腔形成及VEGF表达的影响
目的 探讨心肌营养素1(cardiotrophin-1,CT-1)基因对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein cells,HUVECs)迁移、管腔形成及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响.方法 利用LipofectamineTM2000将质粒pEGFP-N1-CTF1-GFP及pEGFP-N1瞬时转染至HUVECs;实验分成3组:①HUVECs 组:正常对照组;②GFP组:转染质粒pEGFP N1;③CT-1组:转染质粒pEGFP-N1-CTF1-GFP;MTT法检测HUVECs增殖能力的变化,Transwell法检测HUVECs迁移的变化,体外血管腔形成实验检测血管腔形成能力;Western blot 检测CT-1及VEGF蛋白表达的变化.结果 Western blot结果显示,质粒pEGFP-N1-CTF1-GFP转染48 h为CT-1蛋白表达高峰;MTT法、Transwell法和血管腔形成实验分别显示,高表达CT-1的内皮细胞的增殖率、迁移指数和血管腔形成数目明显明显高于正常对照组与GFP组(P＜0.05),Western blot结果显示,质粒转染48 h,CT-1组VEGF的表达明显高于正常对照组与GFP组(P＜0.05).结论 高表达CT-1能明显促进HUVECs增殖、迁移及管腔形成,CT-1可能具有促进血管新生的能力;CT-1促进血管新生的能力可能与其上调VEGF的表达有关.
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蜕皮甾酮对内毒素所致培养脐静脉内皮细胞凋亡和坏死的影响
目的 研究蜕皮甾酮(ecdysterone EDS)对内毒素（LPS）所导致的脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡和坏死的保护作用。 方法 采用体外培养HUVECs为模型，LPS作为致伤因素，EDS作为保护因素，应用流式细胞仪和荧光显微镜观测培养HUVECs凋亡和坏死的变化。 结果 正常培养的血管内皮细胞凋亡和坏死较少，LPS刺激后细胞凋亡和坏死同时增加，凋亡增加幅度大于坏死，EDS处理后凋亡和坏死同时减少。 结论 提示EDS对LPS导致的HUVECs凋亡、坏死有一定的调节作用。
