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携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体构建、转染及活性鉴定
目的 构建携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体并转染人脐静脉内皮细胞,鉴定所表达蛋白活性.方法 从pMD18-T-PRKCB1质粒中,扩增出人PRKCB1并与带有增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pReceiver-M29酶切后连接、转化,所获重组体酶切鉴定及测序.按优化的转染参数,将pReceiver-M29-PRKCB1转染人脐静脉内皮细胞,观察荧光蛋白表达,随机视野下计数转染效率.测定激光共聚焦显微镜下胞膜与胞质的荧光强度比值,鉴定其活化转位.结果 构建的真核表达质粒测序与GenBank公布的序列一致.转染后48 h,荧光蛋白表达佳,转染率为18.6%±1.6%.从胞膜与胞质的荧光强度比值,观察到蛋白的活化转位.结论 成功构建真核表达质粒并转染人脐静脉内皮细胞,观察到绿色荧光蛋白表达及蛋白的转位,为筛选稳定表达人蛋白激酶Cβ2的内皮细胞株,及其蛋白复合体分离提供分子工具.
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二甲双胍下调ROS-PKCβ2通路对高糖波动加重的人内皮细胞损伤的干预作用
目的 观察波动性高糖与持续性高糖对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)mRNA表达的影响,探讨活性氧(ROS)和蛋白激酶Cβ2(PKCβ2)在其中的作用及二甲双弧的干预作用.方法 将培养的HUVECs分为7组:①正常糖(NG,5mmol/L D-葡萄糖)组,②正常糖空载体转染组(NN,NG+Ad5-null)组,③持续性高糖(SHG,15mmol/L D-葡萄糖)组,④波动性高糖(IHG,5mmol/L D-葡萄糖与25mmol/L D-葡萄糖每24h更换一次)组,⑤波动性高糖+PKCβ2转染(IHGB,IHG+Ad5-PKCβ2)组,⑥波动性高糖+二甲双胍(IHGM,IHG+20/μmol/L二甲双胍)组,⑦波动性高糖+选择性的PKCβ2抑制剂CGP53353(IHGI,IHG+00μmol/L CGP53353)组或波动高糖+α-硫辛酸(ALA)(IHGA,IHG+62.5.μmol/L ALA)组.RT-PCR法检测细胞VEGF、VCAM-1 mRNA表达水平,荧光酶标仪测定细胞ROS水平,激光共聚焦显微镜下检测PKCβ2蛋白表达和转位情况.结果 与NG组比较,NN组的空载体转染对细胞无明显生物学意义(P＞0.05).SHG组和IHG组VEGF、VCAM-1mRNA表达及ROS水平增加,分别为NG组的2.16倍、2.30倍、1.75倍和2.57倍、3.32倍、3.20倍,且IHG组增加更明显(P＜0.05).SHG组和IHG组PKCβ2核转位激活,定量分析显示胞质/胞核荧光强度比值较NG组分别下降了21%和26%,且IHG组下降更加明显(P＜0.05);IHGB组PKCβ2核转位较IHG组更显著,胞质/胞核荧光强度比值为IHG组的75%,同时IHGB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达以及ROS水平亦显著增高,分别为IHG组的1.38倍、1.45倍和1.25倍(P＜0.05).IHGM组VEGF、VCAM-1mRNA表达及ROS水平均较IHG组明显降低,为IHG组的44%、53%和39%;IHGM组PKCβ2核转位亦较IHG组减少,胞质/胞核荧光强度比值为IHG组的1.20倍(P＜0.05).结论 波动高糖较持续高糖更易损伤HUVECs,该作用与ROS-PKCβ2活化密切相关;二甲双胍可通过抑制PKCβ2激活,减轻波动性高糖诱导的HUVECs损伤.
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p300介导高糖和甲基乙二醛糖化终产物致人系膜细胞氧化应激及纤维连接蛋白表达
目的 观察转录共激活子p300和蛋白激酶C(PKC) β2在高糖及甲基乙二醛糖化终产物(AGEs)诱导人系膜细胞(HMCs)活性氧(ROS)产生和纤维连接蛋白(FN)蛋白表达中的作用及相互关系.方法 将培养的HMCs分为以下几组:①正糖组(NG)、高糖组(HG)、渗透压组(LG)、正糖+血清白蛋白组(BSA)、正糖+糖化终产物组(AGEs)；②高糖+空载体组(HN)、高糖+ PKCβ2转染组(P0)、高糖+PKCβ2抑制剂CGP53353组(PI)、糖化终产物+空载体组(AN)、糖化终产物+PKCβ2转染组(APO)、糖化终产物+PKCβ2抑制剂CGP53353组(API)；③正糖+p300抑制剂组(NG+Gar)、高糖+p300抑制剂组(HG+ Gar)、血清白蛋白+p300抑制剂组(BSA+ Gar)、糖化终产物+p300抑制剂组(AGEs+ Gar),以上各组细胞均培养2d.荧光显微镜及荧光酶标仪检测细胞内ROS水平；Western blot法检测各组细胞p300、PKCβ2及FN蛋白表达.结果 HG组及AGEs组p300、PKCβ2蛋白表达及ROS水平增加,分别较NG组及BSA组增加了1.04倍、1.26倍、0.78倍和1.45倍、1.07倍、0.71倍(P＜0.05).同HG组及AGEs组相比,HG+ Gar组及AGEs+ Gar组ROS水平显著降低,分别为HG组及AGEs组的43％和39％ (P ＜0.05).PO组及APO组分别较HG组和AGEs组p300、PKCβ2蛋白表达进一步上调,分别为HG组及AGEs组的1.19倍、1.73倍和1.23倍、1.69倍(P＜0.05)；PI组和API组p300、PKCβ2蛋白表达显著下调(P＜0.05)；HN组和AN组p300、PKCβ2蛋白表达分别较HG组及AGEs组差异无统计学意义；HG+ Gar组及AGEs+ Gar组p300、FN蛋白表达显著下降,分别为HG组及AGEs组的31％、43％和37％、29％ (P ＜0.05).结论 高糖及MGO-糖化终产物通过诱导HMCs转录共激活子p300激活参与系膜细胞氧化应激水平上调及FN蛋白表达.
