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通脉大生片对肾虚排卵障碍型不孕大鼠卵巢颗粒细胞超微结构的影响
目的 在前期实验的基础上探讨通脉大生片对肾虚排卵障碍型不孕大鼠(ASR)卵巢颗粒细胞超微结构的影响.方法 选取9日龄SD大鼠,通过颈背部皮下注射丙酸睾酮,建立肾虚排卵障碍型不孕大鼠(ASR)模型,根据大鼠阴道脱落细胞涂片表现,筛选出造模成功的大鼠并进行分组.于大鼠第80日龄,分别给予相应药物干预,连续5周后股动脉取血处死动物,迅速剥离大鼠两侧卵巢,制成电镜标本,应用透射电镜观察卵巢颗粒细胞的超微结构.结果 (1)正常组卵巢颗粒细胞超微结构表现为:多层卵巢颗粒细胞分布,核圆形,线粒体丰富,可见大量粗面内质网;(2)模型组与正常组、给药各组大鼠卵巢颗粒细胞超微结构有明显差异,表现为细胞核团块状,核糖体丢失,可见凋亡小体,线粒体肿胀,且嵴肿胀.(3)通脉大生片各剂量组中,通高组、通中组与正常组大鼠卵巢颗粒细胞结构较相近,主要表现为成熟卵泡颗粒细胞丰富,多层分布,细胞核呈圆形,核内染色质分布均匀,胞浆内可见丰富的线粒体、粗面内质网,且结构正常,可见丰富的脂滴,细胞膜表面有微绒毛突起;通低组可见卵巢颗粒细胞结构尚可,胞浆内线粒体轻度肿胀,可见少量粗面内质网及少量脂滴.(4)左归丸及来曲唑组卵巢颗粒细胞超微结构表现相似且与正常组结构相近,可见卵巢颗粒细胞,核染色质均匀,胞浆内可见大量线粒体、高尔基复合体,结构良好.结论 (1)通脉大生片能恢复肾虚排卵障碍型不孕大鼠卵巢颗粒细胞的超微结构.(2)通脉大生片可通过对卵巢颗粒细胞细胞器结构及数目的影响,从而影响卵泡的发育和成熟,发挥促排卵作用.(3)中医补肾调冲法治疗肾虚排卵障碍型不孕有其现实意义.
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通脉大生片对肾虚排卵障碍型不孕大鼠卵巢Smad4表达的影响
目的 观察通脉大生片对大鼠卵巢形态学改变及信号蛋白Smad4在TGF-β/smads通路中的表达变化及意义.方法 建立大鼠肾虚排卵障碍不孕(ASR)模型,通过阴道涂片筛选造模成功大鼠后分组用药5周后,处死大鼠,HE染色观察形态学变化;蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测大鼠卵巢中Smad4蛋白的表达量.结果 ①各用药组从卵巢形态学上明显恢复的趋势,镜下可见成熟卵泡和黄体.②与模型组相比,通脉大生片高、中、低剂量组及阳性对照组大鼠卵巢Smad4的表达水平升高(P＜0.05),以高剂量组及来曲唑组明显.结论 通脉大生片可用于治疗肾虚排卵障碍型不孕,而其促排卵作用可能部分是通过调节Smad4的表达,进而调控卵巢TGF-β/smads信号通路的激活来实现的.
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TGF-β1R在通脉大生片作用下的大鼠卵巢颗粒细胞中的表达
目的 探索TGF-β1R在通脉大生片作用下的离体大鼠卵巢颗粒细胞中的表达.方法 将培养的原代大鼠卵巢颗粒细胞,随机分为自然生长对照组、通脉大生片高剂量组、通脉大生片中剂量组、通脉大生片低剂量组、FSH组,分别在细胞生长对数期给药,取给药后的细胞培养上清液,用酶联免疫法检测上清液中TGF-β1R的表达量.结果 自然生长组各时间点的TGF-β1R的表达量无明显变化,通高组、通中组、通低组于给药12 h时TGF-β1R的表达量达高峰,48 h降到低,FSH组于给药2h后TGF-β1R的表达量达高峰,48 h降到低.结论 通脉大生片可增加TGF-β1R的表达量,进而揭示通脉大生片通过可能通过TGF-β/smad信号通路来调节卵泡的发育和排卵.
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哈蟆油对大鼠卵巢颗粒细胞增殖与分泌的影响
目的 建立卵巢颗粒细胞的原代培养体系,探讨哈蟆油含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞增殖及分泌的影响,并分析和选择哈蟆油含药血清对颗粒细胞的佳作用浓度,为进一步体外实验奠定基础.方法 采用SD雌性大鼠,皮下注射孕马血清促性腺激素,剖取双侧卵巢,采用机械分离方法释放卵巢颗粒细胞,分离培养.将体积分数为15％,30％,60％,120％,240％(大鼠灌胃浓度4.5 g/kg)的含药血清5个终浓度分别加入培养体系中,通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测细胞增殖情况及药物的大无毒浓度(TD0),观察其对卵巢颗粒细胞生长的影响.采用电化学发光法测定培养基中雌二醇(E2)的含量,分析哈蟆油合药血清对颗粒细胞雌激素分泌的影响.运用流式细胞术检测活细胞及凋亡细胞所占的比率.结果 含药血清作用颗粒细胞后,呈现出不同程度的促增殖作用,含药血清佳的作用浓度体积分数为15％ ～30％(大鼠灌胃哈蟆油剂量为4.5 g/kg)之间；哈蟆油含药血清可促进卵巢颗粒细胞分泌雌二醇,雌二醇含量分析显示雌二醇的分泌与细胞增殖情况存在正相关关系(Person r=0.406,P=0.01)；流式细胞结果显示与空白含药血清比较,哈蟆油含药血清均能显著增加活细胞数目,抑制细胞无血清饥饿引发的凋亡(P值均小于0.01),起到细胞保护作用,其中体积分数为25％的含药血清作用效果更佳(P＜0.01).结论 哈蟆油含药血清对离体培养的卵巢颗粒细胞增殖具有显著的促进作用,并存在一个佳作用浓度范围,其调节机体性激素生成作用与促进卵巢颗粒细胞生长效应相关.
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Smad3在通脉大生片作用后的大鼠卵巢颗粒细胞中的表达
目的 研究Smad3在通脉大生片作用后的大鼠卵巢颗粒细胞中的表达.方法 将培养的原代大鼠卵巢颗粒细胞爬片后,随机分为自然生长对照组、通脉大生片高剂量组、通脉大生片中剂量组、通脉大生片低剂量组、FSH组,分别在细胞生长对数期给药,取给药后的细胞爬片,用免疫组化法检测细胞爬片中Smad3的表达量.结果 自然生长对照组各时间点的Smad3的表达量无明显变化,通高组、通中组、通低组给药12h时Smad3核阳性率明显高于给药6h和24h(P＜0.05)；通中组给药12h时Smad3核阳性率明显高于通高组和通低组12h时Smad3核阳性率,有统计学意义(P＜0.05)；FSH组给药后1h、2h时Smad3核阳性率明显高于正常组,有统计学意义(P＜0.05),FSH组给药后2h时Smad3核阳性率明显高于给药后lh时Smad3核阳性率,有统计学意义(P＜0.05).结论 通脉大生片可能是通过增加Smad3的表达量来促进卵泡发育,以达到治疗排卵障碍性不孕的目的.
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补肾调冲含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞体外分泌功能的影响
目的探讨补肾调冲方对大鼠离体卵巢颗粒细胞分泌功能的影响.方法采用血清药理学的方法,以不同含药量的大鼠血清,与体外培养的颗粒细胞共同孵育24 h,用放免法测定培养液中E2,P,IGF-I,TNF-α的浓度.结果补肾调冲含药血清可升调颗粒细胞E2及IGF-I的分泌量.降调P,TNF-α的分泌量.结论补肾调冲方可通过调节卵巢颗粒细胞的分泌功能,进而改善卵巢功能.
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班氏促卵助孕煎剂含药血清对体外培养人卵巢颗粒细胞增殖的影响
目的 运用血清药理学方法观察班氏促卵助孕煎剂对人卵巢颗粒细胞增殖的影响.方法 向预培养24h的人卵巢颗粒细胞中分别加入10％空白血清(对照组)、班氏促卵助孕煎剂含药血清(高、中、低剂量组),应用噻唑蓝(MTT)法分别检测0,12,24,36,48,60,72 h的颗粒细胞增殖情况.结果 24h前班氏促卵助孕煎剂对细胞增殖的作用不大(P＞0.05)；36,48,60和72 h显示低、中、高三组班氏促卵助孕煎剂含药血清吸光度均明显高于空白血清组,差异有统计学意义(P＜0.01),与低浓度组相比,高、中浓度组均差异有统计学意义(P＜0.01),但高浓度组和中浓度组之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 班氏促卵助孕煎剂含药血清能明显促进体外培养人卵巢颗粒细胞的增殖,且呈剂量相关性.
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卵巢颗粒细胞凋亡率的比较
通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记发(TUNEL)检测了卵巢颗粒细胞凋亡率.结果显示,妊娠组卵巢颗粒细胞凋亡率为0.17±0.02,显著低于非妊娠组0.36±0.03,P<0.05.
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免疫斑点法检测不孕者抗卵巢抗体的临床应用
抗卵巢抗体(antiovaeian antividies,AoAb)引起不妥症是近年来引入关注的问题,抗卵巢抗体是一种靶抗原在卵巢颗粒细胞、卵母细胞、黄体细胞和间质细胞内的自身抗体.AoAb的检测方法有免疫荧光抗体法、放免法和ELISA法.我们在人卵巢抗体的基础上,建立免疫斑点法(IDA)检测不孕和流产患者血清中AoAb.
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卵巢颗粒细胞类固醇激素合成、凋亡中的钙信号
钙信号参与促性腺激素FSH,LH刺激下的卵巢颗粒细胞的类固醇合成;类固醇激素生物学效应的发挥也部分通过钙信号通路,表现为类固醇激素的非基因性作用;在颗粒细胞凋亡过程中,Ca2+的首要作用是作为第二信使诱发凋亡,其次也可作为第一信使通过Ca2+敏感受体(CaR)促进细胞生存.
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MiR-184通过MAPK信号通路促进多囊卵巢综合征卵巢颗粒细胞的增殖
目的:研究microRNA-184(miR-184)在多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)中的作用,并初步探讨其潜在的作用机制.方法:采用qRT-PCR检测24例PCOS卵巢组织标本、20例正常卵巢组织标本及人卵巢颗粒细胞KGN和人正常卵巢上皮细胞IOSE80中miR-184的表达情况.通过细胞转染法抑制KGN细胞中miR-184的表达,MTT法检测细胞增殖能力,平板克隆实验检测细胞克隆形成能力,Western印迹法检测细胞中p-p38 MAPK和p-ERK1/2蛋白表达水平.以终浓度为20μmol/L的MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580处理下调miR-184的KGN细胞,按照上述方法检测对细胞增殖的影响.结果:PCOS卵巢组织和KGN细胞中miR-184的表达显著上调.在KGN细胞中转染miR-184抑制剂可显著抑制miR-184的表达.下调miR-184的表达后,KGN细胞增殖和细胞克隆形成能力显著降低,细胞中p-p38 MAPK和p-ERK1/2蛋白表达水平显著下降,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05).抑制剂SB203580处理下调miR-184的KGN细胞,细胞增殖和细胞克隆形成能力显著降低,与单纯下调miR-184的细胞相比,差异有统计学意义(P<0.05).结论:MiR-184能够促进卵巢颗粒细胞的增殖,其作用机制与MAPK信号通路的激活有关,可为PCOS的治疗提供潜在的作用靶点.
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补肾化瘀方对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450表达的影响
目的 现察补肾化疼方对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞CYP450蛋白表达的影响.方法 运用补肾化瘀方对PCOS模型大鼠进行干预后,采用免疫组化法观察卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达.结果 模型组与正常组比较,卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达在表达面积及表达强度上均低于正常组,差异具有统计学意义(P＜0.01);补肾化瘀方中、高、低剂量组及妈富隆组用药后,卵巢颗粒细胞的GYP450的蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05);其中补肾化瘀方中荆量对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达效果佳.结论 补肾化瘀方能增强PCOS大鼠卵巢颗粒细胞CYP450的蛋白表达,调节卵巢内分泌失调,改善PCOS高雄血症,逆转卵泡的发育异常,使排卵成功.
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HMGB1介导NF-kB通路促进多囊卵巢综合征胰岛素抵抗细胞模型的凋亡
目的 探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)对胰岛素抵抗的大鼠卵巢颗粒细胞IkB/NF-kB信号通路的影响.方法 体外培养正常大鼠卵巢颗粒细胞,设对照组、不同浓度胰岛素干预组,不同浓度HMGB1干预组,胰岛素抵抗+si-HMGB1干预组等,用酶联免疫吸附法 (ELISA) 测定葡萄糖、HMGB1、雄激素、TNF-α、磷酸化NF-kB p65的含量;免疫印迹检测IkBa、pIkBa、Caspase3和Cleaved Caspase3的蛋白表达.结果 与对照组比较,胰岛素过高导致大鼠卵巢细胞的葡萄糖含量明显降低(P<0.05);雄激素及相关炎症因子HMGB1、TNF-α明显升高(P<0.01),并激活转录因子NF-kB p65并使其磷酸化程度明显升高 (P<0.05).随着HMGB1浓度升高,雄激素、磷酸化IkBa、磷酸化NF-kB p65和TNF-α的表达量较对照组均明显升高(P<0.05 or P<0.01);而当胰岛素抵抗的卵巢颗粒细胞中加入HMGB1的干扰小分子,则发现胰岛素抵抗带来的副作用得到缓解,较胰岛素抵抗对照组雄激素、Cleaved Cas-pase3、TNF-α、磷酸化IkBa和磷酸化NF-kB p65的表达量均显著性下降 (P<0.05 or P<0.01).结论 HMGB1在多囊卵巢综合征(PCOS)胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞模型中促使炎症因子升高,可能介导了NF-kB信号通路的激活,促进胰岛素抵抗卵巢颗粒细胞凋亡,参与了PCOS的发病.
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铅对大鼠原代卵巢颗粒细胞分泌雌激素能力的影响
目的 检测铅对大鼠卵巢颗粒细胞分泌功能的影响.方法 分别以250、50、10 mg/L终浓度的醋酸铅对体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞进行24 h染毒,测定细胞活性和细胞分泌产物(雌二醇和孕酮)含量.结果 各染毒组与对照组比较,细胞活性未受影响,而雌二醇和孕酮水平均有所降低,高、中剂量组与对照组比较差异有显著性(P＜0.01).雌二醇含量与醋酸铅剂量的相关系数为-0.900(P＜0.01);孕酮含量与醋酸铅剂量的相关系数为-0.908(P＜0.01),提示在实验剂量下产生剂量-效应关系.结论 铅对大鼠卵巢颗粒细胞分泌功能有抑制作用.
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Foxo3a基因调控大鼠卵巢颗粒细胞体外发育及预防顺铂对卵巢的毒性作用
目的：研究Foxo3a基因对大鼠卵巢颗粒细胞体外发育的调控及其预防顺铂卵巢毒性作用。方法大鼠原代颗粒细胞体外培养，利用HE染色法及免疫荧光法进行原代颗粒细胞鉴定；构建携带Foxo3a基因的重组腺病毒AD-rFoxo3a，利用RT-PCR及Western-blot法检测Foxo3a表达；实验分为3组：实验组（AD-rFoxo3a组）、阴性对照组（rAD组）及空白对照组（Control组），分别绘制各组细胞生长曲线，Western-blot法检测各组cyclin D1、p27、Bax、Bim蛋白表达，利用流式细胞术、Hoechst33342/PI法分别检测细胞周期及细胞凋亡情况，流式细胞术检测各组细胞加入适浓度顺铂后细胞凋亡情况。结果（1）体外分离培养大鼠原代卵巢颗粒细胞存活率>90%，细胞纯度>95%；（2）重组腺病毒AD-rFoxo3a感染颗粒细胞36 h后Foxo3a基因在mRNA水平高表达，感染48 h后在蛋白水平高表达；（3）实验组细胞增殖受到抑制，G1期细胞比例及细胞凋亡率较空白对照组及实验对照组增加（P<0.01），后两组差异无统计学意义；（3）实验组Bim、p27、cyclin D1蛋白较对照组高表达，而各组Bax蛋白表达无明显差异；（4）加入顺铂24 h后实验组细胞凋亡率高于空白对照组及实验对照组（P<0.01），后两组细胞凋亡率差异无统计学意义。结论过表达Foxo3a基因在体外可能通过促进cyclin D1和p27蛋白表达诱导大鼠卵巢颗粒细胞静止在G1期，通过增加Bim蛋白表达诱导颗粒细胞凋亡；同时过表达Foxo3a基因在体外不能逆转顺铂导致的颗粒细胞凋亡，其对于卵泡发育的调控及预防顺铂对卵巢的毒性作用还有待体内实验进一步研究。
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miR-21对化疗药物诱导卵巢颗粒细胞凋亡的影响及其机制
目的 探讨慢病毒介导miR-21对化疗诱导卵巢颗粒细胞凋亡的影响及其机制.方法 采用分子生物学方法构建miR-21慢病毒表达载体(LV-miR-21),分离培养大鼠卵巢颗粒细胞.分为正常组、磷酰胺氮芥(PM)组、miR-21组.正常组卵巢颗粒细胞培养基中不加PM,PM组加入30μmol/L的PM诱导卵巢颗粒细胞凋亡,miR-21组卵巢颗粒细胞培养基中加PM诱导凋亡24 h,随后转染LV-miR-21.48 h后采用流式细胞仪检测法检测3组卵巢颗粒细胞凋亡率,用荧光定量PCR及Western blot法检测同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)、程序性死亡蛋白4(PDCD4)的mRNA及蛋白质表达水平.结果 正常组、PM组、miR-21组的凋亡率差异有统计学意义(F=78.00,P=0.00),miR-21组凋亡率低于PM组(P<0.05),但仍高于正常组(P<0.05).3组的miR-21表达水平差异有统计学意义(F=1226.35,P=0.00),miR-21组的miR-21表达水平显著高于正常组及PM组(P<0.05).3组PTEN的mRNA和蛋白质表达水平差异均有统计学意义(F=90.37,P=0.00;F=44.34,P=0.00),miR-21组的表达水平显著低于PM组(P<0.05).3组PDCD4的mRNA和蛋白表达水平差异均有统计学意义(F=198.59,P=0.00;F=60.25,P=0.00),miR-21组的表达水平显著低于PM组(P<0.05).结论 miR-21通过下调靶基因PTEN、PDCD4的表达,抑制化疗药物诱导的卵巢颗粒细胞凋亡.
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人卵巢颗粒细胞原代培养方法的比较
目的 对比5种不同方法分离人卵巢颗粒细胞的效果,并选择出高效、稳定的分离纯化、体外培养的有效方法.方法 收集不孕症患者行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)穿卵时的卵泡液,采用裂解法、裂解+胰酶法、密度梯度离心法(包括Precoll+胰酶、Precoll+Ⅰ型胶原酶、Precoll+透明质酸酶)分离颗粒细胞后进行活细胞计数,卵泡生成素免疫组化染色鉴定,MTT法检测细胞增殖能力,检测颗粒细胞体外分泌雌激素含量.结果 在使用不同方法分离颗粒细胞时,Precoll+胰酶、Precoll+Ⅰ型胶原酶、Precoll+透明质酸酶3种方法得到细胞数量多于裂解法及裂解+胰酶法(P<0.05).各种分离方法的细胞生长趋势并无明显差异.裂解法、裂解+胰酶法雌激素含量高于Precoll+胰酶、Precoll+Ⅰ型胶原酶、Precoll+透明质酸酶(P<0.05).结论 5种方法均成功分离得到颗粒细胞,但每种方法各有优缺点,根据实验目的不同需选择不同的方法.
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分离培养人卵泡液中颗粒细胞两种方法的比较
目的 探讨简便可行分离卵巢颗粒细胞的方法以供化疗保护卵巢功能的体外实验研究.方法 分别采用密度梯度离心法和低渗透性溶解法分离及原代培养16例卵泡液中的颗粒细胞.结果 低渗透性溶解法与密度梯度离心法分离及原代培养的细胞其细胞活率和雌激素的分泌量大体相当,差异无统计学意义(P＞0.05);但低渗透性溶解法耗时明显比密度梯度离心法低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 低渗透性溶解法并不降低颗粒细胞的活率及其激素的分泌,反而较密度梯度离心法省时,简便高效.
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干细胞因子在女性生殖系统疾病诊疗中的研究进展
干细胞因子（SCF）是一种广泛分布于骨髓、肾、卵巢等器官的多功能细胞因子，通过与Ⅲ型酪氨酸激酶受体c－kit结合，激活下游信号传导途径，影响细胞增殖、分化、迁移、凋亡等系列活动［1］。初因发现SCF可刺激干细胞分化成不同谱系的血细胞而成为重要的造血细胞调节因子［2］。
SCF 参与卵巢颗粒细胞、泡膜细胞、间质细胞、子宫内膜上皮细胞、胚胎滋养细胞增殖、分化、存活，卵母细胞发育、成熟及胚胎种植等过程［3］，其在子宫内膜异位症（EMS）、多囊卵巢综合征（PCOS）、卵巢上皮性肿瘤等多种女性生殖系统疾病中表达异常，并可应用于辅助生殖技术预测卵巢反应性、卵泡质量，协同外源性促性腺激素作用等。本文就近年SCF在女性生殖系统疾病应用的研究进行总结。 -
抗苗勒氏管激素的研究新进展及对IVF-ET的意义
抗苗勒氏管激素(anti-müllerianhormone,AMH)是一种有两个72kDa的二聚体单体通过二硫键连接组成糖蛋白[1],它属于转化生长因子-β家族.在男性,AMH是由睾丸的支持细胞分泌直至青春期后期缓慢下降至低水平,参与精子的生成.在女性,AMH在出生后少量由卵巢颗粒细胞产生,直到绝经期后检测不到.AMH具有调节细胞发育及分化、促进苗勒氏管退化等重要作用.近年随着辅助生殖技术(ART)为越来越多不孕妇女解决了生育问题,而AMH有助于指导生殖医生制定合理的促排卵用药方案和IVF-ET的成功率及其预后,生殖领域对其研究也日渐深入.
