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卵巢颗粒细胞体外培养体系的建立及DEHP、MEHP对其增殖功能的影响
目的:建立卵巢颗粒细胞的原代培养体系,探讨邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)及其活性中间产物邻苯二甲酸单(2 乙基)己酯(MEHP)对原代培养的卵巢颗粒细胞增殖作用的影响.方法:选用21～25 日龄未成年雌性Wistar大鼠,皮下注射孕马血清(PMSG),48h后断头处死,收集卵巢颗粒细胞,在DMEM F12培养液中培养.卵巢颗粒细胞原代培养体系建立成功后分别将不同剂量的DEHP(1μM、5μM 、25μM、50μM、100μM)和MEHP(1μM、5μM 、25μM、50μM、100μM)作用细胞24h及48h,以CCK 8法检测细胞增殖情况.结果:DEHP作用卵巢颗粒细胞24h时,1μM DEHP 和100μM DEHP均能明显抑制卵巢颗粒细胞增殖,差异有统计学意义(P＜0.05).DEHP作用卵巢颗粒细胞48h时,1μMDEHP 和100μMDEHP均能明显促进卵巢颗粒细胞增殖,差异有统计学意义(P＜0.05).而MEHP作用卵巢颗粒细胞24h及48h,MEHP各染毒剂量组均无统计学差异(P＞0.05).结论:DEHP能促进卵巢颗粒细胞增殖,并且和作用时间长短有关.MEHP在观察剂量下,尚未显示有促进卵巢颗粒细胞增殖的作用.
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多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞中雄激素相关microRNA的表达
目的 探讨多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢颗粒细胞中雄激素相关microRNA的表达.方法 将86例PCOS患者根据临床症状及血总睾酮浓度分为高雄激素PCOS组(47例)及非高雄激素PCOS组(39例),将同期50例因男方因素或者输卵管因素不孕者作为对照组.收集所有研究对象卵子,进行实时荧光定量PCR,分析数据并筛选差异表达的miRNAs,比较3组患者卵巢颗粒细胞中雄激素相关microRNA的表达差异.结果 高雄激素PCOS组卵巢颗粒细胞中雄激素相关microRNA表达与非高雄激素PCOS组相比,多种microRNA的表达发生了变化.其中变化倍数在两倍以上的有17种microRNA(5种上调,12种下调).与其他两组比较,hsa-miR-205、hsa-miR-30c两种上调microRNA及hsa-miR-7、hsa-miR-181a、hsa-miR-25、hsa-miR-943、hsa-miR-21、hsa-miR-668六种下调microRNA在高雄激素PCOS组卵巢颗粒细胞中变化显著(P＜0.05).结论 PCOS患者卵巢颗粒细胞中hsa-miR-205、hsa-miR-7、hsa-miR-25等多种雄激素相关microRNA在其发病过程中发挥重要作用,为后续的临床治疗提供了靶点.
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功血颗粒对卵巢颗粒细胞增殖和分泌作用的影响
目的:观察研究功血颗粒对卵巢颗粒细胞增殖和分泌的影响.方法:体外培养大鼠卵巢颗粒细胞,培养24 h后,加入大鼠含药血清,采用.MTT法测定OD值和放免法测定上清液中雌二醇和孕激素的含量;体外培养大鼠卵巢颗粒细胞,采用氯化镉造成损伤模型,采用MIT法观察功血颗粒含药血清对损伤的卵巢颗粒细胞的保护作用,放免法观察上清液中雌二醇和孕激素的变化.结果:功血颗粒含药血清各剂量含药血清细胞生长明显提高(P<0.01),促进卵巢颗粒细胞的增值,促进GC分泌雌二醇和孕酮,此外,功血颗粒含药血清对Cd-C12致卵巢颗粒细胞损伤具有一定的保护作用,并促进雌二醇和孕酮分泌.结论:功血颗粒含药血清能促进正常卵巢颗粒细胞.的增值和分泌,抑制氯化镉对大鼠卵巢颗粒细胞的算上,具有保护细胞的作用.
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卵巢早衰实验研究进展
卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)又称原发性卵巢功能不全,是指卵巢功能低下导致40岁之前即闭经的现象,其特点是原发或继发闭经伴随血促性腺激素水平升高和雌激素水平降低,并伴有不同程度的低雌激素症状如:潮热多汗、性欲低下等.近些年本病有逐渐增加的趋势,已成为严重影响妇女生殖健康及身心健康的常见疾病.许多科研工作者针对此病做了大量实验研究.
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MSCs上清可减轻雷公藤甲素对KGN细胞的损伤作用
目的：探讨MSCs上清对雷公藤甲素损害卵巢颗粒细胞的缓解作用及机制。方法：用CCK-8法分析了雷公藤甲素对KGN活力的影响；用混合酶消化法分离脐带来源的MSCs，并用流式细胞术对其表型进行了鉴定；收集MSCs上清，用CCK-8法及PI法检测MSCs上清对雷公藤甲素损伤的KGN活力及周期的影响；用Real-time PCR 法对周期调节相关基因CDKN1A的表达进行检测。结果：雷公藤甲素能够通过抑制KGN活力及阻滞KGN在S期抑制其生长；MSCs上清不影响正常KGN的增殖和周期，但可提高雷公藤甲素损伤的KGN细胞的活力，缓解雷公藤甲素引起的S期阻滞，抑制雷公藤甲素对KGN的CDKN1A表达的异常上调。结论：MSCs上清可能减轻雷公藤甲素对KGN细胞的损伤作用。
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补肾活血方对多囊卵巢综合征伴不孕症患者卵巢颗粒细胞IGF-1R m RNA的影响
目的 探讨补肾活血方对多囊卵巢综合征伴不孕症患者卵巢颗粒细胞IGF-1R m RNA的影响.方法 选取2010年3月-2014年3月静宁县人民医院诊治多囊卵巢综合征伴不孕症患者70例,随机分为观察组和对照组,每组各35例.对照组患者给予常规促排卵治疗,观察组患者在对照组治疗的基础上给予补肾活血方治疗,疗程为6个月经周期.观察并记录两组患者在相应方法干预后血清雌二醇(E2)、睾酮(T)、黄体生成素/卵泡雌激素(LH/FSH)和中医症候积分的变化情况;测定取卵日卵巢颗粒细胞IGF-1R m RNA的表达情况.结果 治疗前,两组患者的上述观察指标相比,差异无统计学意义(P＞0.05);治疗后,两组患者的E2升高,T、LH/FSH和中医症候积分下降,其中观察组患者的改善程度优于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);观察组患者卵巢颗粒细胞IGF-1R m RNA的表达显著高于对照组,差异有统计学意义(t=3.938,P=0.000).结论 对多囊卵巢综合征伴不孕症患者给予补肾活血方治疗,可以提高IGF-1R m RNA的表达水平,促进卵泡发育,调节机体的黄体功能,提高治疗效果,值得临床推广.
关键词： 补肾活血方 多囊卵巢综合征 卵巢颗粒细胞 IGF-1R m RNA -
左归丸含药血清对大鼠卵巢颗粒细胞Smad4及周期蛋白Cyclin A表达的影响
目的:探讨Smad4蛋白对大鼠卵巢颗粒细胞细胞周期蛋白cyclin A的影响以及左归丸的干预作用.方法:以不同剂量的左归丸含药血清作用于体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞,用MTS法检测各组颗粒细胞24、48、72 h增殖情况以及用Western bolt法检测卵巢颗粒细胞Smad4和cyclin A蛋白表达.结果:左归丸舍药血清对大鼠卵巢颗粒细胞的增殖有促进作用,在作用48 h,2.5％左归丸含药血清组作用为显著(P＜0.05);同时Smad4和cyclin A蛋白也达到大表达(P＜0.05).结论:左归丸含药血清对卵巢颗粒细胞增殖的促进作用与增加Smad4信号通路细胞周期蛋白cyclin A表达,抑制细胞分裂有关.
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中药提取液对离体大鼠卵巢颗粒细胞雌二醇(E2)分泌的影响
近年来研究发现,在不育夫妇中,免疫性不育引起越来越广泛的关注.中药消抗安胎提取液治疗免疫性不育经多年临床应用,疗效较好.患者抗体阳性转阴率达82.2%[1].但对其作用机制了解甚少.本实验采用离体实验孵育大鼠卵巢颗粒细胞模型,观察消抗安胎提取液对颗粒细胞雌二醇分泌的影响.
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二仙汤、二至丸和地黄煎对小鼠脾细胞和卵巢颗粒细胞的调节作用
目的 探讨二仙汤、二至丸和地黄煎对小鼠脾细胞和卵巢颗粒细胞的调节作用.方法 取小鼠脾脏和卵巢分别制备脾单个核细胞和卵巢颗粒细胞,于24孔板中培养,分别加入二仙汤、二至丸以及地黄煎的水提物和醇提物,以香菇多糖水溶剂为阳性对照药物,运用MTT法观察细胞增殖情况;酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞上清液中IL-1、IFN-γ及E2的浓度.结果 二仙汤、二至丸、地黄煎各组对脾单个核细胞及卵巢颗粒细胞均具有较好的增殖作用(P＜0.05,P＜0.01);三方均可提高小鼠脾单个核细胞培养上清液中IL-1、IFN-y的含量(P＜0.05,P＜0.01),但与阳性对照组相比,三方均无差异(P＞0.05);三方均可提高小鼠卵巢颗粒细胞上清液中的E2水平(P＜0.01,P＜0.05);与阳性对照组相比,三方均无差异(P＞0.05).结论 二仙汤、二至丸、地黄煎对小鼠脾细胞和卵巢颗粒细胞均有较好的调节作用.
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体外阻断卵巢颗粒细胞转化生长因子β信号转导通路模型的建立
本实验以选取转化生长因子βⅡ受体（transforming growth factor-βreceptor typeⅡ,TGF-βRⅡ)抗体的不同剂量和不同孵育时间,对原代培养的大鼠卵巢颗粒细胞表面TGF-βRⅡ进行中和,从而达到建立体外阻断TGF-β信号转导通路模型的目的.为研究与TGF-β信号转导通路相关的各种调节因素提供了体外研究的新模型.
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考尔-爱克斯诺小体在卵泡发育中的分布
考尔-爱克斯诺小体(Call-Exner body)存在于一定物种范围的卵巢卵泡中,包括人和兔,牛的腔前卵泡和小腔卵泡中也有类似结构[1].研究显示考尔-爱克斯诺小体出现于卵泡正常发育的早期阶段,卵泡发育越晚,考尔-爱克斯诺小体越多[2].其也存在于人的卵巢肿瘤中[3-4],认为卵巢颗粒细胞肿瘤与考尔-爱克斯诺小体的分化有关,同时,考尔-爱克斯诺小体也是检测颗粒细胞肿瘤的发展,估计预后的因素之一[5].狗的颗粒细胞肿瘤中也可见考尔-爱克斯诺小体[6].小鼠腔前卵泡常被用作体外成熟的模型,但在其发育过程中对考尔-爱克斯诺小体的观察较少,扫描电镜观察未见报道.
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诱导性多潜能干细胞向卵巢颗粒细胞定向分化的体外研究
目的 体外研究诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSCs)向卵巢颗粒细胞(Granulosa cell,GC)定向分化.方法 利用transwell间接共培养体系诱导iPSCs向GC定向分化.倒置荧光显微镜观察诱导后细胞形态特征;酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测共培养上清E2水平;RT-PCR鉴定诱导后细胞颗粒细胞相关基因表达;细胞免疫化学鉴定诱导后细胞FSHR表达.结果 诱导后细胞成角形或梭形,与颗粒细胞形态相似;共培养第1、3、5和7天的E2值依次为(35.46±5.68) pg/mL、(44.58±4.10) pg/mL、(50.08土8.20)pg/mL和(63.49±7.04)pg/mL,呈递增趋势,差异具有统计学意义(P＜0.05);诱导后细胞FSHR、LHR、AMHR2、FOXL2和CYP 19A1基因表达均上调,与iPSCs组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);诱导后细胞FSHR表达阳性.结论 iPSCs与GC共培养可分化为具有颗粒细胞功能的颗粒样细胞.
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维生素E拮抗双酚A对卵巢颗粒细胞性激素分泌的抑制作用
目的·研究维生素E能否对双酚A (BPA)的雌性性激素干扰效应起拮抗作用,探索拮抗作用的适宜浓度.方法·提取大鼠卵巢原代颗粒细胞.不同浓度BPA(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)孵育48 h后,收集并用ELISA法测定细胞培养基中的雌二醇(E2)及孕酮(P4)浓度.采用健康女性卵泡液中的平均浓度(简称“人体平均浓度”,5 μmol/L)或高浓度(25 μmol/L)维生素E(α-生育酚)单独孵育或与BPA(10、100 μmol/L)共同孵育颗粒细胞48 h后,测定培养液中性激素浓度.结果·10 μmol/L及100 μmol/LBPA可使大鼠原代卵巢颗粒细胞分泌性激素水平呈浓度依赖性降低(P＜0.05).25 μmol/L维生素E单独孵育时可分别使E2和P4浓度显著升高(44.89±15.18)％和(43.33±8.82)％(P＜005);维生素E(5 μmol/L或25 μmol/L)和BPA共同孵育时,性激素浓度恢复正常,与阴性对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论·人体平均浓度及高浓度维生素E均可拮抗BPA导致的性激素降低效应,而高浓度维生素E的改善效果相对显著.
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蔡氏育肾培元方对卵巢低反应患者卵巢颗粒细胞基因表达及分泌功能的影响
目的:探讨蔡氏育肾培元方对卵巢低反应(POR)患者卵巢颗粒细胞基因表达及分泌功能的影响.方法:选取检测合格的6例样本,随机分为治疗组与对照组,每组各3例.治疗组服用育肾培元方,对照组不用任何药物.于干预前及干预3个月后拮抗剂方案超促排卵,取两次取卵的卵巢颗粒细胞进行RNA-seq测序,并对相关差异基因进行qPCR和免疫印迹验证;同时对颗粒细胞进行分离培养,检测两组颗粒细胞的生长及分泌功能.结果:①RNA-seq测序显示,治疗组患者的颗粒细胞在药物治疗后表达上调的相关基因主要富集于免疫应答、细胞活化和细胞黏附等功能,且治疗组第二次取卵时上调的免疫应激基因的数量显著降低;通过进一步的基因富集分析表明,治疗组治疗3个月后卵巢颗粒细胞的卵泡发育相关基因及卵巢相关基因均较对照组上调.②通过对部分上调基因(PTPN6、CYBA、FOS、ITGB7等)以及一些下调基因(IL1B,TNFAIP3)的qPCR验证显示,这些基因的表达模式与RNA测序结果较为一致;另外,在表达上调基因中发现,部分基因与卵巢功能密切相关,如FOS和PTPN6基因.③免疫印迹结果显示,育肾培元方可改善PTPN6、CYBA、ITGB7及IL1B基因在颗粒细胞中的表达模式.④细胞实验证实,对照组颗粒细胞在体外培养过程中细胞贴壁能力较差,细胞活力较低,细胞突触不发达;而治疗组颗粒细胞在体外培养过程中细胞贴壁能力较强,细胞突触发达且细胞增殖速度较快.⑤对颗粒细胞体外分泌功能测定显示,治疗组的颗粒细胞分泌的雌二醇(E2)和孕酮(P)都显著高于对照组(P＜0.05).结论:育肾培元方可以降低POR患者的免疫应激反应,改善卵巢颗粒细胞卵巢及卵泡发育相关基因的表达模式,增强卵巢细胞的生长活性及分泌功能,从而改善了POR患者超促排治疗的卵巢反应性.
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黄芩素对雷公藤甲素诱导的大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用
目的:探讨黄芩素对雷公藤甲素诱导的大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用.方法:收集大鼠卵巢颗粒细胞,经原代培养24h后,用雷公藤甲素损伤大鼠卵巢颗粒细胞;干预组添加终浓度分别为50、100、200 μmol/L的黄芩素,对照组添加相同体积的二甲基亚砜(DMSO)溶液,继续培养24h(或以上).采用MTT法测定卵巢颗粒细胞活力,流式细胞术Annexin V/PI双染色检测细胞凋亡,Western blot法检测与细胞凋亡相关蛋白的表达情况;测定各组卵巢颗粒细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及丙二醛(MDA)含量,评价抗氧化能力.结果:雷公藤甲素可显著降低大鼠卵巢颗粒细胞活力,诱导细胞凋亡,并使SOD和GSH-Px活性降低,MDA含量增加;雷公藤甲素处理细胞的同时添加黄芩素干预后,卵巢颗粒细胞相对活力增加,细胞凋亡减弱,胞内SOD和GSH-Px活性升高,MDA含量降低.Westernblot结果显示,经过雷公藤甲素处理,卵巢颗粒细胞中促凋亡蛋白Bax表达量显著上升,抗凋亡蛋白Bcl-2表达量明显降低;黄芩素干预后可以显著下调Bax表达量,上调Bcl-2表达量.结论:黄芩素可明显改变卵巢颗粒细胞的抗凋亡及抗氧化能力,对雷公藤甲素诱导的细胞凋亡起保护作用.
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和颜坤泰胶囊对小鼠卵巢颗粒细胞的毒性保护作用
目的:评价和颜坤泰胶囊(HYKT)对体外小鼠卵巢颗粒细胞的毒性保护作用.方法:取原代培养的小鼠颗粒细胞,分别予不同浓度的多柔比星(DOXO)和去氧乙烯环己烯(VCD)诱发细胞毒性;设定高、中、低剂量(分别为16.7、8.35、4.18 mg/ml)坤泰胶囊组及空白对照组,药物干预后用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)测定各组小鼠卵巢颗粒细胞的存活率.结果:空白组显示,DOXO及VCD作用下小鼠卵巢颗粒细胞的存活率分别为55％、33％左右;HYKT干预后,高、中、低剂量组小鼠卵巢颗粒细胞存活率均较空白组明显提高(P＜0.05或P＜0.01),其中对DOXO的保护作用呈剂量依存性,而对VCD无明显的剂量依存性.结论:和颜坤泰胶囊对DOXO和VCD所诱发的生殖毒性均有明显的保护作用.
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CYP19基因与子宫内膜癌关系的研究进展
细胞色素P450(CYP)是微粒体混合功能氧化酶中重要的一族,在生物体内分布广泛.CYP19基因编码芳香化酶(P450 arom),后者是雌激素合成的后一步限速酶,分布于人体的多种组织中,如胎盘、卵巢颗粒细胞、黄体细胞、脂肪组织、睾丸和肾上腺组织中.芳香化酶在雌激素依赖性疾病子宫内膜癌(EC)、乳腺癌、子宫内膜异位症(EMs)和子宫平滑肌瘤等的病理组织中均有表达,其过度表达与这些疾病的发生、发展有关.现就CYP19基因与子宫内膜癌关系的研究进展综述如下.
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香附四物汤对大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响及活性部位成分分析
目的 评价香附四物汤及其不同分离部位对大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响,并对活性部位成分进行分析.方法 体外培养大鼠卵巢颗粒细胞,将香附四物汤的不同分离方法 所得提取物以2、20、200μg/mL 3个终浓度分别加入培养体系中,通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞增殖情况,观察其对卵巢颗粒细胞生长的影响.采用超高效液相-四级杆串联飞行时间-质谱(UPLC-QTOF-MS)分析鉴定活性部位的成分.结果 香附四物汤挥发油、水煎液、醇沉沉淀、醇沉上清液及醇沉分子量大于5万的部位对卵巢颗粒细胞均具有明显的促进增殖作用,并呈现剂量依赖性.其中水提物大孔树脂醇洗脱部位在200μg/mL剂量下30%及40%部位表现出显著的促进增殖作用.从醇沉上清液中分析鉴定了16种化合物.结论 香附四物汤对离体培养的卵巢颗粒细胞增殖具有明显的促进作用,其调节机体性激素生成作用可能与促进卵巢颗粒细胞生长效应相关;活性部位醇沉上清液的化学组分主要为萜类、有机酸类和生物碱类成分.
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雄激素对卵巢颗粒细胞性激素结合球蛋白表达的调节
目的 雄激素信号通路参与调控卵泡早期生长发育以及卵泡闭锁过程,而性激素结合球蛋白是调控卵巢局部雄激素水平的重要因素.文中探讨雄激素对卵巢颗粒细胞中性激素结合球蛋白(SHBG)表达的影响. 方法 ①培养人卵巢颗粒癌细胞株(KGN),分别给予含0nmol/L DHT,500nmol/L DHT,500nmol/L DHT+60μmol/L flutamide的细胞培养液,提取细胞蛋白.用Western blot、免疫荧光等方法检测SHBG的表达.②脱氢表雄酮(DHEA)诱导高雄激素血症模型,12只雌性SD大鼠随机数字表法分为HA组和对照组,每组6只.HA组每只皮下注射DHEA 6mg/(100g·d)溶于0.2mL实验级大豆油,对照组给予等体积的大豆油.连续注射35d后腹腔注射5%水合氯醛麻醉各组大鼠,下腔静脉取各组大鼠血液,ELISA方法检测各组血清中SHBG的水平;剪切各组大鼠卵巢和部分肝,免疫组化方法检测卵巢颗粒细胞中SHBG的表达,Western blot方法检测肝雄激素受体(AR)及SHBG表达情况. 结果 与0nmol/L DHT处理24h AR表达(1.06±0.03)相比,300、400、500nmol/L DHT处理后(1.06±0.02、1.61±0.11、2.38±0.14)均升高(P<0.05);SHBG与AR表达变化一致,随DHT浓度梯度增加表达升高,但在500nmol/L DHT处理24h后SHBG表达升高显著(P<0.01).与0nmol/L DHT比较,500nmol/L DHT处理后AR蛋白、SHBG蛋白表达均升高(P<0.01);与500nmol/L DHT比较,500nmol/L DHT+60μmol/L flutamide处理后AR蛋白、SHBG蛋白表达均降低(P<0.05).免疫荧光结果表明,与0nmol/L DHT相比,DHT促进AR的表达,同时加入flutamide可明显抑制AR的表达.SHBG的表达与AR相一致.卵巢组织HE染色结果表明HA组与对照组相比卵巢形态发生改变,表现为多囊卵巢;卵巢免疫组化结果表明SHBG在HA组中表达高于对照组.HA组血清SHBG表达低于对照组[(2.41±0.14) vs (4.80±0.35),P<0.01].HA组中肝SHBG表达表达低于对照组,而AR蛋白表达高于对照组(P<0.05). 结论 雄激素信号通路激活后SHBG在卵巢颗粒细胞癌细胞以及大鼠卵巢颗粒细胞中表达升高.
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DNAJB11促进卵巢颗粒细胞中FOXL2诱导的雌激素合成
目的 转录因子FOXL2是颗粒细胞雌激素合成与颗粒细胞功能维持的关键调控分子,但目前尚不清楚FOXL2蛋白的表达及功能调控机制.文章旨在鉴定调控FOXL2蛋白功能的新分子.方法 通过分离小鼠卵巢组织进行免疫组化染色检测DNAJB11的表达定位情况,含有全长DNAJB11基因cDNA序列(Ad-DNAJB11-Flag和Ad-Flag-DNAJB11)的腺病毒载体按AdMax系统(Microbix)方法进行病毒颗粒的包装.按NE-PERTM Nuclear and Cytoplasmic抽提试剂盒所述方法进行细胞核质蛋白的分离.KGN细胞感染不同浓度腺病毒(Ad-DNAJB11和Ad-LacZ),测量波长450 nm的吸光度值,进行细胞增殖检测.采用Access Immunoassay System 2化学发光自动检测系统(Beckman Coulter)检测细胞培养上清中雌二醇的浓度.采用PCR方法扩增含有人FOXL2和人DNAJB 11基因的全长cDNA序列,并分别亚克隆至pCS2-6XMT载体(Myc-FOXL2)和pFLAG-CMV2载体(Flag-DNAJB11)中.采用Lipofectamine 2000转染试剂将Myc-FOXL2和Flag-DNAJB11表达质粒瞬时转染至细胞HEK-293细胞中.收集HEK-293细胞或FSH处理的KGN细胞的裂解液,进行FOXL2和DNAJB11的免疫共沉淀实验.通过细胞免疫荧光染色和荧光素酶报告基因等实验检测内质网Hsp40/DnaJ家族成员DNAJB11调控颗粒细胞的雌激素水平.结果 Western blot表明DNAJB11蛋白在人卵癌颗粒细胞KGN、小鼠原代卵巢颗粒细胞mGC以及小鼠卵巢中高表达,免疫组化染色结果亦证实DNAJB11蛋白表达于小鼠卵巢的卵母细胞质中,并在窦前卵泡、排卵前卵泡的颗粒细胞中持续表达.免疫荧光染色和Western blot分析亦表明外源性激素FSH可以诱导KGN细胞中内源性DNAJB11蛋白从内质网转移到细胞核中.腺病毒介导的DNAJB11-Flag过表达定位于细胞内质网中,但当Flag标签阻断DNAJB11信号肽功能时,外源Flag-DNAJB11过表达则定位于颗粒细胞的细胞核,内质网中DNAJB11-Flag蛋白高表达以浓度依赖的方式减少KGN细胞中雌二醇的合成,与Ad-LacZ(MOI=50)比较,Ad-DNAJB11-Flag(MOI=50)减少,KGN细胞中雌二醇的合成[(10749.0±801.7)pg/mL vs(79030.±409.5)pg/mL,P<0.01],而细胞核中高表达Flag-DNAJB11后则刺激KGN细胞中雌二醇的生成,与Ad-LacZ(MOI=50)比较,Ad-DNAJB11-Flag(MOI=50)刺激雌二醇的生成[(10749.0±801.7)pg/mL vs(14217.0±1218.0)pg/mL,P<0.01].免疫共沉淀实验表明当Myc-tagged FOXL2与Flag-tagged DNAJB11分别共转染HEK 293细胞,FOXL2与DNAJB11可以相互免疫共沉淀对方,荧光素酶报告基因实验进一步表明细胞核中表达的DNAJB11显著增强FOXL2介导的Cyp19A1启动子活性和Cyp19A1蛋白表达.结论 DNAJB11是转录因子FOXL2新的结合分子并调控FOXL2蛋白的稳定性与转录活性.
