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经后增殖方对超排卵大鼠卵巢颗粒细胞Fas通路的影响
目的 研究经后增殖方对超排卵大鼠卵巢颗粒细胞Fas凋亡通路的影响,探讨中药改善卵母细胞质量的作用机制.方法 建立超排卵大鼠模型,30只大鼠随机分为空白组、阳性组和中药组.实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测大鼠卵巢组织中Fas、Fasl、Caspase-8、Caspase-3基因及蛋白的表达.结果 阳性组各基因及蛋白表达均增高,与空白组比较差异具有显著性(P<0.05).中药组各基因及蛋白表达均低于阳性组,其中Fas、Fasl、Caspase-8表达水平与阳性组相比差异具有统计学意义(P<0.05),而Caspase-3表达水平与阳性组无统计学差异(P>0.05).中药组与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05).结论 经后增殖方能抑制超排卵大鼠卵巢组织Fas、Fasl、Caspase-8、Caspase-3的表达,抑制颗粒细胞凋亡,推测Fas通路可能是经后增殖方改善卵母细胞质量的作用机制之一.
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PGRMC1介导孕酮抑制卵泡发育的作用及机制研究
目的 探讨孕酮膜受体(PGRMC1)在孕激素抑制卵泡发育及颗粒细胞分化中的作用及作用机制.方法 将10只21 d的SD大鼠按随机数表法分为两组(n=5),其中一组注射孕马血清促性腺激素(PMSG)(20 IU/mL)48 h后取卵巢,另外一组注射PMSG 24 h后注射孕酮(30μg/只),再经过24 h后取卵巢,通过测量卵巢大小、HE染色研究孕酮对卵泡发育的影响.PMSG(20 IU/mL)促排卵48 h后取卵巢,后通过免疫组化观察PGRMC1受体分布情况.用PMSG促排卵48 h后分离卵泡颗粒细胞,加入孕酮(100 ng/mL、250 ng/mL)和PGRMC1抑制剂AG205(10μmol/L)后,采用Western blot检测卵巢颗粒细胞甾体激素生成相关的细胞外信号调节酶(ERK1/2)、甾体激素快速调节蛋白(StAR)、细胞色素P450胆固醇侧链切割酶(P450scc)的表达情况,采用ELISA试剂盒检测培养上清中的孕烯醇酮分泌情况.结果 PMSG处理组卵巢大小为(8.6±0.93)mm,明显大于PMSG联合孕酮处理组的(5.2±0.58)mm,差异有统计学意义(P<0.05);PMSG联合孕酮处理组始基卵泡数明显高于PMSG处理组[(62±8.6)vs(39±2.9)],而有腔卵泡及成熟卵泡显著低于PMSG处理组[(3.8±1.0)vs(8.0±1.2)、(3.7±0.4)vs(8.1±0.6)],差异均有统计学意义(P<0.05);孕酮(100 ng/mL、250 ng/mL)抑制甾体激素生成相关的pERK1/2、StAR、p450scc的表达,进而抑制甾体激素的前体孕烯醇酮的合成[(2.9±0.23)ng/mL vs(5.3±0.18)ng/mL、[(3.0±0.67)ng/mL vs(5.3±0.18)ng/mL],差异均有统计学意义(P<0.05);然而PGRMC1抑制剂AG205(10μM)逆转孕酮的这种抑制作用升高pERK1/2、StAR、p450scc的表达,差异均具有统计学意义(P<0.05);AG205逆转孕酮(100 ng/mL、250 ng/mL)对孕烯醇酮合成的抑制作用[(9.6±0.67)ng/mL vs(2.9±0.18)ng/mL、(9.8±0.91)ng/mL vs(3.0±0.67)ng/mL]差异均具有统计学意义(P<0.05).结论 孕酮抑制卵泡的发育,孕酮的这种抑制作用主要体现在对窦前卵泡的抑制作用.孕酮对卵巢颗粒细胞甾体激素的合成有抑制作用,PGRMC1的抑制剂AG205可以逆转孕酮的抑制作用,提示孕酮抑制卵泡发育,抑制颗粒细胞分化作用部分依赖于PGRMC1.
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SF-1和LRH-1在子宫内膜异位症卵巢颗粒细胞中的表达
目的 分析类固醇生成因子-1(SF-1)、肝受体类似物-1(LRH-1)在子宫内膜异位症卵巢颗粒细胞中的表达.方法 选取该院2016年2月至2017年2月收治的65例子宫内膜异位症患者作为观察组,另选同期65例女性健康体检者为对照组,对两组卵巢颗粒细胞中SF-1 mRNA和LRH-1 mRNA 进行检测和比较.结果 观察组SF-1 mRNA和LRH-1 mRNA表达水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组内不同分期患者SF-1 mRNA和LRH-1 mRNA表达水平存在差异,Ⅰ期+ Ⅱ期> Ⅲ期> Ⅳ期,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 子宫内膜异位症卵巢颗粒细胞中SF-1和LRH-1明显低于正常水平,分期越高,其水平越低,二者可能与子宫内膜异位症卵巢功能异常的病理机制相关.
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Ghrelin基因在多囊卵巢综合征患者卵巢颗粒细胞中的表达
目的:探讨Ghrelin基因在卵巢颗粒细胞中的表达及其与多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)的关系.方法:选择47例在重庆医科大学辅助生育中心接受体外受精-胚胎移植治疗的不孕妇女,其中PCOS组11例,对照(Non-PCOS)组36例,采用real-time PCR及免疫印迹法分别测定2组妇女卵巢颗粒细胞中Ghrelin mRNA和蛋白的表达水平.结果:PCOS妇女颗粒细胞中Ghrelin mRNA和蛋白的表达均低于Non-PCOS妇女(0.926±0.206 vs.1.137±0.105,t=2.73,P=0.015;0.647±0.052 vs.0.937±0.038,t=7.82,P=0.001).结论:PCOS妇女卵巢颗粒细胞的Ghrelin mRNA和蛋白表达水平明显低于Non-PCOS妇女,可能与卵泡发育障碍相关.
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apelin对大鼠卵巢颗粒增殖与凋亡的影响
目的 探讨apelin对大鼠卵巢颗粒细胞增殖与凋亡的影响.方法 用apelin 10-8 mol/L培育SD大鼠卵巢原代颗粒细胞,小RNA干扰技术(siRNA)抑制颗粒细胞APJ表达,联合PI3K/Akt信号转导阻断剂LY294002和HIMO干预,MTT法及流式细胞术观察细胞增殖与凋亡情况；Western blot检测细胞凋亡相关信号蛋白表达.结果 MTT检测APJ-siRNA组、LY294002组、HIMO组细胞增殖率,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)；与对照组比较,APJ-siRNA组、LY294002组、HIMO组颗粒细胞Bad、Bax、Foxo3a蛋白表达明显上调(P＜0.05)；与对照组比较,APJ-siRNA组、LY294002组、HIMO组Bc1-2蛋白表达明显下调(P＜0.05).结论 apelin通过APJ/PI3K/Akt信号通路促颗粒细胞增殖抗其凋亡.
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足月妊娠合并巨大卵巢颗粒细胞瘤破裂1例
1 临床资料患者,21岁,农民.因妊娠9个月余,腹部胀痛1d,于2006年1月24日入院.LMP2005年4月13日,停经1+月时查尿HCG阳性,确定为早孕.早期及中期妊娠期间无异常.8个月孕时曾出现右侧中上腹胀痛,产检及B超检查未见异常,腹痛持续1+d自行缓解.1d前无诱因出现腹部胀痛,右侧为甚,站立时呈持续性,卧床时呈阵发性,无阴道流血流液,无发热、恶心、呕吐及腹泻.既往健康,无月经紊乱.
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大鼠卵巢颗粒细胞体外培养及哈蟆油对其增殖功能的影响
目的 采用CCK-8法研究哈蟆油对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响,对比分析哈蟆油含药血清对颗粒细胞的佳作用浓度和时间,为进一步体外试验奠定基础.方法 选用25日龄未成年雌性SD大鼠,腹腔注射孕马血清,48 h后脱颈处死,收集卵巢颗粒细胞,在DMEM-F12培养液中培养,并通过HE染色和免疫荧光技术对颗粒细胞进行鉴定.25只SD大鼠分为正常对照组、阳性药对照组、哈蟆油低、中、高剂量组,灌胃给药7d后采血并分离血清.将体积分数为10％,20％,40％,80％各组不同浓度的含药血清加入体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞体系中,采用CCK-8法检测各组24、48 h和72 h细胞增殖情况.结果 哈蟆油显著提高了颗粒细胞的增殖能力,有一定的量效和时效关系,随着哈蟆油浓度的增加,其促增殖能力逐渐增强,在作用48 h后,20％浓度体积分数的哈蟆油含药血清组为显著(P＜0.05).结论 体外建立大鼠卵巢颗粒细胞的培养方法,有助于深入研究哈蟆油等中药对卵巢的作用和机制.
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乌头碱对大鼠卵巢颗粒细胞毒性研究
[目的]研究乌头碱对体外培养的大鼠卵巢颗粒细胞的毒性.[方法]对25～29日龄雌性SD大鼠皮下注射孕马血清促性腺激素(PMSG),无菌制备卵巢颗粒细胞悬液,采用透射电镜观察管嵴状线粒体进行细胞鉴定.试验设4个乌头碱浓度组(0、5×101、5×102、5×103、5×104 μg·L-1)和1个溶剂对照组(二甲亚砜).选用MTT法(四唑盐比色法)测定乌头碱对大鼠卵巢颗粒细胞活力的影响,用雌二醇和孕酮的放免分析药盒测定乌头碱对颗粒细胞激素分泌功能的影响,用丙二醛和超氧化物歧化酶试剂盒测定乌头碱对大鼠题粒细胞的氧化损伤作用.[结果]与溶剂对照组相比,乌头碱作用24 h后,高浓度和次高浓度组(5×103、5×104 μg·L-1)可明显抑制大鼠颗粒细胞的增殖,差异有统计学意义(P＜0.01);高剂量组(5×104 μg·L-1)丙二醛含量明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).[结论]在本实验室条件下,乌头碱浓度高于5×103 μg·L-1时,对雌性大鼠卵巢颗粒细胞有毒性作用,主要表现为抑制颗粒细胞的增殖及对细胞的氧化损伤作用.
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右归丸水提液对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素、孕酮分泌的影响及机制
目的:观察右归丸水提液对卵巢颗粒细胞分泌雌激素、孕酮功能的影响.方法:首先运用体外培养技术进行小鼠卵巢颗粒细胞体外培养,采用直接给药法,观察右归丸水提液对小鼠卵巢颗粒细胞雌激素、孕酮的分泌量(放射免疫测定法),并用检测卵巢颗粒细胞内cAMP水平(ELISA法).结果:右归丸水提液高剂量组(0.18g/ml)可明显增加颗粒细胞雌激素、孕酮分泌量(P＜0.01),同时显著增加颗粒细胞内cAMP的浓度(P＜0.01).结论:右归丸温补肾阳的作用可能与直接促进颗粒细胞的分泌功能有关,同时,其作用途径可能是通过激活颗粒细胞内酰苷酸环化酶而实现.
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大鼠卵巢颗粒细胞体外培养方法探讨
目的 建立体外培养大鼠卵巢颗粒细胞分离、体外培养的有效方法.方法 收集注射孕马血清促腺激素(PMSG)48h后的大鼠卵泡液,用胰蛋白酶消化法分离纯化颗粒细胞并用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基进行培养.结果 得到的卵巢颗粒细胞纯度高,有较好的后续生长增殖能力,可用于后续实验.结论 建立大鼠卵巢颗粒细胞体外培养的稳定模型,为颗粒细胞的体外研究提供实验基础.
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乌头碱对大鼠卵巢黄体细胞的毒性研究
目的 研究乌头碱对体外培养的卵巢黄体细胞的毒性.方法 无菌下制备25～29日龄雌性SD大鼠的卵巢黄体细胞,并通过透射电镜观察管嵴状线粒体来鉴定细胞.用MTT法检测0、0.05、0.5、5、50μg·mL-1的乌头碱对大鼠卵巢黄体细胞活力、激素分泌功能的影响,及对大鼠黄体细胞的氧化损伤作用.结果 与溶剂对照组比较,作用24h后,50μg·mL-1乌头碱可明显抑制大鼠黄体细胞的增殖,差异有统计学意义(P<0.01);0.5、5、50μg·mL-1乌头碱对孕酮的分泌明显低于对照组(P<0.05).结论 乌头碱浓度高于5×102ng·mL-1时,对雌性大鼠卵巢黄体细胞有毒性作用,主要表现为抑制黄体细胞的增殖及抑制激素的分泌.
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超声诊断卵巢颗粒细胞-卵泡膜细胞瘤1例
患者，女，33岁，因月经紊乱2年，发现盆腔包块1年入院。两年前出现月经紊乱，表现为月经周期、经期时间不等，经量不一，1年前B超检查发现盆腔包块，随访中包块逐渐长大。入院检查：一般情况好，生命体征平稳，心肺无异常，肝脾未扪及。妇科检查：外阴发育正常，已婚生育型，阴道通畅，宫颈光滑，子宫前位，正常大小。右附件区扪及一个约7cm×5cm×3cm包块，活动，质稍硬。入院诊断：右卵巢肿瘤。 超声检查：于右附件区探及一个实质性椭圆形低回声包块，边界清楚，规则，大小约6cm×5.3cm×3cm，内部可见多个散在的低回声区(图1)，约图1 超声检查可见多个散在低回声区0.4cm。子宫及左附件未见异常。彩色血流显像(CDFI)包块内部可见稀疏星点状血流，周边血流丰富，以包块右侧明显，可见粗大条形血管(图2)。超声诊断：右卵巢良性实质性包块。
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益胃汤对初老雌性大鼠卵巢颗粒细胞超微结构的影响
目的:研究补益阳明津气方药益胃汤对初老雌性大鼠卵巢机能影响的作用机理.方法:电镜观察了益胃汤高,中,低剂量组对初老雌性大鼠卵巢颗粒细胞超微结构的影响,并与西药已烯雌酚作比较.结果:益胃汤可丰富卵巢颗粒细胞内线粒体和滑面内质网,胞质内有大量脂滴,凋亡小体少见.结论:实验研究提示补益阳明津气方药能够有效延缓初老雌性大鼠卵巢颗粒细胞衰老,改善卵巢内分泌功能.
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冬虫夏草对VDR沉默大鼠卵巢颗粒细胞CYP19表达的影响
目的:探讨冬虫夏草对Vitamin D Receptor (VDR)沉默大鼠卵巢颗粒细胞中CYP19mRNA表达的影响.方法:将大鼠卵巢颗粒细胞随机分为6个组:1为空白对照组,2为基因沉默阴性对照组,3为VDR沉默组,4为VDR沉默+已烯雌酚组,5为VDR沉默+维生素D组,6为VDR沉默+虫草含药血清处理组.采用荧光定量PCR检测法检测各组大鼠卵巢颗粒细胞中CYP19mRNA表达.结果:与对照组、基因沉默阴性对照组相比,VDR沉默组CYP19mRNA表达明显下调(P＜0.05),VDR沉默+己烯雌酚组、VDR沉默+VD组、VDR沉默+冬虫夏草含药血清组与VDR沉默组比较,CYP19mRNA表达明显上调(P＜0.05).结论:冬虫夏草可以通过调节CYP19产生类维生素D样作用,对大鼠的卵巢颗粒细胞分泌功能产生影响,同时通过调节维生素D轴对大鼠的卵巢产生保护作用.
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山茱萸总萜调控伴胰岛素抵抗的PCOS大鼠及其卵巢颗粒细胞分泌作用的机制
目的 研究山茱萸总萜调控伴胰岛素抵抗的PCOS大鼠及其卵巢颗粒细胞分泌作用的机制.方法 22日龄雌性SD大鼠皮下注射硫酸普拉睾酮钠9 mg· 100g-1·d-1共20 d,伴高脂饮食喂养60 d建立伴IR的PCOS大鼠模型,将PCOS大鼠随机分为模型组和治疗组.治疗组以山茱萸总萜、氯米芬和罗格列酮干预.葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG).放射免疫法测定空腹胰岛素(Fins)、睾酮(T)、雌二醇(E2)、促卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)的含量.同时,随机取各组大鼠2只皮下注射PMSG 10 IU/kg,48 h后颈椎脱臼法处死.在无菌条件下迅速剖取卵巢,刺破卵泡,获取卵巢颗粒细胞.光镜观察卵巢形态及颗粒细胞分布,用不同浓度山茱萸总萜、氯米芬和罗格列酮干预培养,检测颗粒细胞对葡萄糖的摄取量和分泌孕激素(P)的量.结果 与模型组比较,治疗组大鼠Fins浓度均显著降低(P＜0.01),ISI显著升高(P＜0.01),T和E2浓度均显著降低(P＜0.01),FSH浓度显著升高(P＜0.01),大鼠卵巢卵泡内颗粒细胞层数明显增加,孕激素分泌增加(P＜0.05),葡萄糖摄取能力增加(P＜0.05).与氯米芬和罗格列酮双阳性对照组相比,无明显区别(P＞0.05,P＞0.05).结论 山茱萸总萜可改善胰岛素抵抗,细胞葡萄糖摄取,并增加其雌激素和孕酮的分泌.
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育泡饮对大鼠卵巢颗粒细胞EG FR表达的影响
目的：观察中药育泡饮对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞EGFR表达的影响。方法：颗粒细胞预培养48h后，随机分组加入促卵泡激素FS H （50ng/m L ）和不同剂量的育泡饮，并设立空白对照组，继续培养48h ，Western-Blot法检测各组颗粒细胞EGFR的表达。结果：育泡饮水提醇沉液呈剂量依赖性促进颗粒细胞EGFR表达。在低剂量作用下颗粒细胞EGFR表达开始增强，与空白对照组比较具有明显差异（P＜0．05），高剂量组的促进作用为显著（P＜0．05）。与FSH组比较，低剂量组促颗粒细胞EGFR表达的能力明显降低（P＜0．05）。而高剂量组与FSH的作用相比较无统计学差异（P＞0．05）。结论：育泡饮通过调节EGFR的表达量，可能是育泡饮促卵泡发育的内在机制之一。
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α-硫辛酸对小鼠卵巢颗粒细胞氧化应激损伤和凋亡的影响
目的 探讨α-硫辛酸对小鼠颗粒细胞培养过程中抗氧化水平和抗凋亡水平的影响.方法 收集经PMSG处理的小鼠卵巢颗粒细胞,经原代培养24 h后,添加终浓度为100μmol/L的α-硫辛酸继续培养24 h,测定氧化水平SOD、MDA和GSH-Px参数,评价抗氧化能力,采用Trizol法提取各组细胞的RNA,进行RT-PCR法检测α-硫辛酸对caspase-3和caspase-9基因的表达情况的影响,同时利用细胞免疫荧光和ELISA法检测caspase-3和caspase-9蛋白表达,并分析α-硫辛酸降低细胞凋亡的作用.结果 分离培养的小鼠卵巢颗粒细胞α-硫辛酸添加后,SOD和GSH-Px活性升高,MDA含量降低(P＜0.05);经过RT-PCR扩增技术获得长度为180 bp的特异性caspase-3产物,获得长度为152 bp的特异性caspase-9产物,α-硫辛酸添加可显著性降低caspase-3和caspase-9 mRNA的表达(P＜0.05);免疫荧光细胞化学染色显示颗粒细胞caspase-3和caspase-9蛋白阳性染色定位于细胞胞质,分别呈现绿色荧光和红色荧光,细胞核呈蓝色荧光;ELISA结果显示α-硫辛酸添加后caspase-3和caspase-9酶活性显著下调(P＜0.05).结论 小鼠颗粒细胞培养过程中添加α-硫辛酸可明显改变细胞抗氧化能力,对卵巢颗粒细胞培养过程中的氧化应激诱导的细胞凋亡起到一定的保护作用.
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莱克多巴胺对人卵巢颗粒细胞类固醇激素合成急性调节蛋白表达的影响
目的 探讨 β2肾上腺素受体(adrenergic receptor,AR)激动剂莱克多巴胺(ractopamine,RAC)对人卵巢颗粒细胞类固醇激素合成的效应.方法 在人卵巢颗粒细胞体外培养系统中,添加高(50μmol/L)、中(5μmol/L)、低(0.5μmol/L)3种剂量的RAC,并设置空白对照(对照组)、50μmol/L克伦特罗(clenbuterol,CLB)和50μmol/L普萘洛尔组,在0h、4h、12h、24h和48h回收细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测颗粒细胞类固醇激素合成急性调节蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,StAR)mRNA和蛋白表达水平的变化.结果 各实验组颗粒细胞StAR mRNA的表达与其蛋白表达的变化趋势基本一致.对照组颗粒细胞各时间点StAR的表达水平差异无统计学意义(P>0.05).CLB和RAC可升高StAR表达,普萘洛尔可抑制其表达.与0h相比,StAR的表达水平在RAC作用后4h达到高峰(P=0.000);12h后,StAR的表达从峰值急剧下降(P=0.003);24h后,基本恢复至基础水平(P>0.05).不同剂量RAC与颗粒细胞共培养4h后,StAR表达水平从高到低的顺序为:RAC低剂量组>RAC中剂组>RAC高剂量组,组间差异有统计学意义(P=0.000).结论 RAC可升高颗粒细胞StAR的表达水平,影响卵巢类固醇激素合成功能,其后果可能引起女性生殖内分泌紊乱.
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两种人卵巢颗粒细胞分离提纯方法的比较研究
目的:比较2种人卵巢颗粒细胞分离提纯方法的效果.方法:收集体外受精-胚胎移植(IVF-ET)穿刺取卵后的卵泡液,分别用2种方法分离提取颗粒细胞.A法用红细胞裂解液去除混杂红细胞、酶消化卵泡液中黏液团、Percoll分离液与细胞悬液等体积叠加后离心;B法省略红细胞裂解步骤、舍弃黏液团、增加Percoll分离液用量.比较2种方法获取的颗粒细胞数量、活性、纯度以及实验耗时.结果:2种方法获取的颗粒细胞存活率均＞90％,差异无统计学意义(P＞0.05).A法获取的颗粒细胞数量多于B法(P＜0.05),但混杂较多细胞碎片,体外培养细胞生长状态欠佳；B法获取的颗粒细胞纯度高,体外培养生长状态良好,且实验耗时较A法短(P＜0.05).结论:2种方法对颗粒细胞存活率无明显影响.B法更为省时高效,有助于建立稳定的颗粒细胞体外培养体系.
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TRAIL及其受体在PCOS病人卵巢颗粒细胞表达
目的 探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)及其受体死亡受体4(DR4)和诱骗受体1(DcR1)在多囊卵巢综合征(PCOS)病人卵巢颗粒细胞的表达及其与PCOS发病的关系.方法 收集PCOS病人30例及卵巢正常者(对照组)30例的卵巢颗粒细胞,RT-PCR方法分析两组TRA IL及其受体DR4、DcR1 mRNA表达情况,Western blot法检测两组TRAIL及其受体DR4、DcR1蛋白表达情况.结果 PCOS组TRA IL mRNA及蛋白表达较对照组明显增加(t=2.641、2.891,P<0.01),DcR1 mRNA和蛋白表达较对照组明显降低(t=2.039、3.079,P<0.01),两组DR4 mRNA和蛋白表达比较差异无显著性(P>0.05).结论 PCOS病人卵巢颗粒细胞TRAIL及其受体异常表达,可能通过参与卵巢颗粒细胞凋亡调控导致PCOS发病.
