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高效液相色谱-质谱联用测定大鼠不同脑区的游离型神经甾体
目的建立大鼠不同脑区3种游离型神经甾体的测定方法.方法甾体分两步萃取,首先用乙酸乙酯-正己烷(90:10)提取甾体,然后经固相萃取纯化.游离型甾体进行衍生化后应用高效液相色谱-质谱分离测定,选择甲基睾丸酮作为内标.结果去氢表雄酮的线性范围为0.030-2.00μg·L-1,孕烯醇酮和别孕烯醇酮的线性范围为0.025-2.00μg·L-1.正常雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠不同脑区甾体去氢表雄酮(DHEA),孕烯醇酮(PREG)和别孕烯醇酮(AP)的含量分别为额叶皮质(0.70±0.23),(4.8±1.9),(1.1±0.6)ng·g-1,海马(0.57±0.28),(6±3),(0.5±0.3)ng·g-1,杏仁核(1.5±1.0),(9±5),(1.4±0.9)ng·g-1,纹状体(0.52±0.14),(7.7±2.8),(0.5±0.6)ng·g-1,伏隔核(2.9±1.6),(18±9),(1.6±1.3)ng·g-1,垂体(4.0±2.0),(27±12),(0.8±0.5)ng·g-1,下丘脑(1.7±1.2),(16±10),(0.8±0.7)ng·g-1.结论 3种神经甾体都有良好的线性关系和准确度,本方法可满足大鼠不同脑区内游离型甾体的分离测定.
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神经甾体的研究进展
神经甾体是指存在于中枢和外周神经系统,不需依赖内分泌腺体的甾体激素,包括孕烯醇酮、孕酮、别孕烯醇酮、脱氢表雄酮等,由胆固醇或其前体在相应酶的作用下在神经系统内合成.神经甾体通过作用于γ-氨基丁酸受体,尤其是γ-氨基丁酸受体而发挥作用.神经甾体的研究对记忆、睡眠、惊厥、细胞兴奋性毒性等产生相应的作用,为某些疾病的治疗指明方向.
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脑类固醇的合成及其临床意义
除肾上腺、性腺和胎盘组织之外,神经组织本身也具有合成、分泌多种类固醇激素的能力.脑组织拥有类固醇合成所需要的酶,其分布具有组织特异性和细胞特异性.脑内的类固醇通过细胞内受体和细胞膜受体两条途径发挥调节作用,参与学习、记忆和应激反应活动,发挥抗焦虑、抑郁和惊厥,保护神经和促进神经再生等作用.
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东莨菪碱致学习记忆损伤大鼠不同脑区PREG含量的变化
目的:观察东莨菪碱致记忆损伤大鼠不同脑区孕烯醇酮(PREG)含量的变化.方法:东莨菪碱腹腔注射制备大鼠学习记忆损伤模型,Morris水迷宫检测大鼠的习记忆能力,高效液相色谱-质谱法检测大鼠额叶皮质及海马PREG的含量.结果:模型大鼠的学习记忆能力显著下降；与对照组大鼠比较,模型组大鼠额叶皮质PREG的含量显著下降(P＜0.05),海马PREG的含量无明显变化.结论:东莨菪碱致记忆损伤模型大鼠额叶皮质PREG的含量显著降低,提示东莨菪碱可能通过影响PREG的合成损伤大鼠的学习记忆能力.
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具有吡唑啉结构甾体芳杂环化合物的合成及抗肿瘤活性
以孕烯醇酮为原料,通过17-位甲基酮与不同的芳香醛反应生成α,β-不饱和酮,再与水合肼反应得到具有吡唑啉结构的甾体芳杂环化合物;采用MTT法测试目标物对3种肿瘤细胞株的体外抗肿瘤活性.结果表明,4个目标物对人体结肠癌细胞HT-29、宫颈癌细胞HeLa和胃癌细胞SGC-7901均表现出很好的生长抑制活性,而且对宫颈癌细胞HeLa的抑制活性优于阳性对照药顺铂.
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孕烯醇酮对老年大鼠胆碱能系统的影响
目的 通过试剂盒检测ChAT、AchE和PREG的表达,探讨PREG与老年大鼠胆碱能系统的关系及其机制.方法 24月龄雄性SD大鼠40只随机分为4组,空白对照组,溶剂对照组(隔日腹腔注射等体积DMSO),小剂量组(按照0.5 mg/kg隔日腹腔注射PREG).大剂量组(按照2.0 mg/kg隔日腹腔注射PREG).采用试剂盒检测大鼠额叶、颞叶、海马组织ChAT、AchE活性以及血象PREG含量,然后运用Stata软件处理检测结果.结果 大剂量PREG明显增加老年大鼠ChAT、PREG表达,降低AchE的表达(P＜0.05),而小剂量PREG仅仅提高了血浆PREG含量.结论 大剂量PREG能提高胆碱能系统的表达,可能提高记忆功能.
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孕烯醇酮对老年SD大鼠海马区突触素蛋白1表达的影响
目的 观察孕烯醇酮(PREG)慢性干预对老年大鼠海马区突触素蛋白1(SYP1)表达的变化.方法 24月龄雄性SD大鼠40只,随机分为空白对照组、溶剂对照组、小剂量PREG(0.5 mg/kg)干预组、大剂量PR EG(2.0 mg/kg)干预组,隔日腹腔注射干预1个月,通过Western Blot技术和免疫组化技术检测分别检测各组大鼠海马区蛋白表达情况.结果 与对照组相比,免疫组化显示大剂量PREG干预组大鼠海马区SYP1表达明显增加,Western Blot定量检测发现大鼠海马区SYP1表达也显著升高(P＜0.05);而小剂量组SYP1表达无明显增加(P＞0.05).结论 大剂量PREG干预可以显著增加老年大鼠记忆相关的海马区SYP1表达,SYP1表达增加可能明显改善大鼠海马区突触结构可塑性与突触功能,进而有助于改善老年大鼠的学习记忆功能.
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非那雄胺合成路线图解
非那雄胺(非那甾胺，finasteride,MK-906,1)化学名为N-叔丁基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄甾-1-烯-17β-酰胺，其5 mg片剂由Merck & Co.以商品名Proscar(保列治)于1992年首次在英国上市。由于它对5α还原酶具有良好的抑制作用，故应用于良性前列腺增生的临床治疗［1～4］。1997年12月，其1 mg片剂被美国FDA批准用于治疗男性型脱发症［5，6］，商品名为Propecia，已先后在墨西哥、新西兰及美国等国上市。用于防治前列腺癌的研究正在进行［7］。 在早期的文献中，以孕烯醇酮为初始原料合成1一般须经过十步化学反应，见图1。 路线(1)：孕烯醇酮(2)经碘化、季铵化、醇解、Oppenauer氧化得到3-氧代-4-雄甾烯-17β-甲酸甲酯(5)［1］，5水解生成3-氧代-4-雄甾烯-17β-甲酸(6)［1］，氧化切断4位双键后氨解［2～4］，得到3-氧代-4-氮杂-5-雄甾烯-17β-甲酸(8)［2～4］。再以醋酸为介质，铂催化选择性加氢，得到3-氧代-4-氮杂-5α-雄甾烷-17β-甲酸(9)［2～4］。为使后续的酰胺化反应更容易进行，先用2，2′-二硫吡啶对9进行酯化，生成3-氧代-4-氮杂-5α-雄甾烷-17β-甲硫羟酸(2-吡啶基)酯(10)［2～4］。再于THF中与叔丁胺进行酰胺化反应，得到N-叔丁基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄甾烷-17β-甲酰胺(11)［2～4］。后用苯亚硒酸酐氧化脱去1，2位的氢得到1［2～4］。 路线(2)：即图示5→12→13→14→15→1的过程，先以合成9类似的方法或由9酯化合成14，再经Δ1脱氢、水解、酯化、酰胺化，得到1［2～4］。 近期的文献［8～11］对路线(2)进行了一些改进，有些避免了昂贵的2，2′-二硫吡啶的使用，有些还减少了反应步骤。 如16→→1的过程可由16先与二氯亚砜在催化量DMF的存在下进行酰氯化，再与叔丁胺反应制得1［8］。DMF的存在抑制了A环4位N上可能发生的副反应，并避免了2，2′-二硫吡啶的使用。 脱氢时可采用DDQ与N，N-二(三甲硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)的反应产物作为脱氢试剂［9］。 另一重大改进是在得到3-氧代-4-氮杂-5α-雄甾-1-烯-17β-甲酸甲酯(15)后，在乙基溴化镁的存在下，与叔丁胺反应制得1［10］。这是经典的Bodroux反应［11］应用的又一实例。 此外，中国药科大学廖清江等对1及其类似物的合成也做了大量的研究工作［12，13］，并在降低合成成本方面取得了进展，如以溴仿反应取代吡啶的季铵盐反应［14］；以及先制备17β-酰胺，再改造A环［15］，这一颇具启发性的方法可概括为路线(3)。 路线(3)：在得到化合物6之后，先把17位的羟基转化为酰胺，再改造A环，A-4位引入氮杂原子制得N-叔丁基-3-氧代-4-氮杂-5α-雄甾烷-17β-甲酰胺(21)后，再以苯亚硒酸酐脱氢制得1［15］。由于把使用昂贵原料的脱氢反应放在后一步，使得合成成本显著降低。 本图解文献查阅截止至CA1996年126卷；Delphion Intellectual Property Network 2000-09；NIH期刊数据库MedLine 2000-10。
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孕烯醇酮唾液酸苷对β-淀粉样蛋白致神经元损伤的保护
阿尔茨海默病（AD）是一种老年神经系统退行性疾病。有学者认为：β-淀粉样蛋白（A β）形成聚集，产生聚集依赖的（aggregation-dependent）神经元毒性作用是产生AD的关 键步骤［1］。Aβ的一个片段Aβ25-35可产生自由基和氧化应激,增加神经元 对NMDA的敏感性，造成神经元内Ca2+常态水平的不稳定，使胞内［Ca2+］升高 ，从而产生神经元细胞膜的损伤和神经变性,因此实验研究中常以Aβ25-35作为损伤 物质，造成对神经元等的损伤。 唾液酸是细胞表面的一个九碳糖，与糖蛋白和糖脂结合，参与维持细胞完整性、神经营养和 细胞轴束生长作用，但它不易透过血-脑屏障。孕烯醇酮硫酸酯是神经甾体的一种。有研究 表明它能降低细胞对兴奋性氨基酸毒性的敏感性，使细胞内［Ca2+］减少，从而 产生细胞保护作用；另外能通过调节GABAA受体和谷氨酸而影响神经细胞兴奋性；还有报 道认为：神经甾体具有修复神经损伤的作用［2］。将唾液酸与孕烯醇酮结合形成的 新化合物孕烯醇酮唾液酸苷，可能克服唾液酸穿过血-脑屏障的困难，又能很好发挥两种化 合物上述有利作用或产生新的作用。因此本研究观察了孕烯醇酮唾液酸苷对Aβ25-35 致培养海马神经元损伤的保护作用。
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神经甾体的合成和代谢及其对神经系统作用
神经甾体是指存在于中枢和外周神经系统,不需依赖于内分泌腺体的甾体激素,包括孕烯醇酮、孕酮、别孕烯醇酮、脱氢表雄酮等,由胆固醇或其前体在相应酶的作用下在神经系统合成.神经甾体可以通过作用于GABAA受体、NMDA受体和σ受体发挥作用.它们对记忆、睡眠、惊厥、细胞兴奋性毒性等产生相应的作用,为某些疾病的治疗指明方向.
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HPLC法测定养血注射液中孕烯醇酮的含量
养血注射液由四物汤等组成,具有降低血液黏度的功效,对中老年人心脑血管疾病有良好的防治作用.2010版中国药典一部是用高效液相色谱法测定四物汤中芍药苷的含量作为四物汤质量控制的指标[1].
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雌性大鼠血清和海马雌二醇水平及海马孕烯醇酮水平的动态变化
目的: 建立检测大鼠海马组织中雌二醇(E2)水平和孕烯醇酮(PREG)水平的方法,观察正常雌性大鼠血清及海马E2水平和海马PREG水平的动态变化.方法: 24只健康成年雌性SD大鼠分为发情前期组、发情期组、发情后期组和发情间期组各6只;取血清及海马组织,用有机溶剂(乙酸乙酯/正己烷＝3/2)萃取甾体激素后,评估高效液相色谱(HPLC)分离、纯化E2和PREG的性能指标(包括分离效果、日内/日间变异率、回收率和总回收率),采用HPLC分离、纯化萃取物中的E2和PREG;应用放射免疫法(RIA)检测E2,应用酶联免疫吸附分析(ELISA) 检测PREG. 结果: HPLC分离E2和PREG的保留时间日内变异率分别为0.3%和0.4%,日间变异率分别为0.6%和0.4%;不同浓度的E2和PREG的回收率与总回收率差异无统计学意义(P>0.05).雌性大鼠血清和海马E2水平分别在发情前期和发情期高,与其它各期相比差异有统计学意义(P＜0.05),各期大鼠海马E2水平(1.3～1.9 fmoL.mg-1)均高于血清E2峰值水平(0.69 fmoL.mg-1)(P＜0.001).各期大鼠海马PREG水平差异无统计学意义(P>0.05).结论:本实验检测脑内E2和PREG的方法灵敏且可靠.正常雌性大鼠海马组织中的E2可能主要由自身局部合成,并且有可能是通过芳香化酶的作用由睾酮直接转化而来.
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致痫后雌性大鼠血清及海马雌二醇和孕烯醇酮水平的动态变化
目的 观察致病后雌性大鼠血清及海马雌二醇(E2)和孕烯醇酮(PREG)水平的动态变化,研究海马E2水平与癫痫发作严重程度的关系. 方法 选择动情期雌性大鼠制备海人藻酸(KA)经杏仁核点燃的癫痫模型,观察大鼠癫痫发作的行为学表现.应用放射免疫法和酶联免疫吸附分析分别检测癫痫发作后0、1、2、3、4、5、6、12和24 h的大鼠以及经杏仁核注射生理盐水后相应时间的大鼠血清及海马组织E2和PREG水平.对检测结果进行统计学分析. 结果 杏仁核注入KA后5～10min大鼠均出现痫样发作,3 h达峰值,随后呈下降趋势.致痫后的大鼠血清E2水平无明显变化,但海马E2水平在癫痫发作后1 h开始上升,4 h达峰值,随后呈下降趋势,12 h恢复至对照水平,1～12 h相邻时间点E2水平差异均有统计学意义(P,0.05).此外,随着大鼠的癫痫发作程度的加重,海马E2水平逐渐升高,进行相关性检验后发现.海乌E2水平与癫痫发作严重程度呈正相关(R~2=0.646,P<0.05).致痫前及致痫后24 h内不同时间点各组大鼠海马的PREG水平没有明显变化. 结论 癫痫发作后大鼠海马E2水平的动态变化与癫痫发作程度相关.癫痫发作可以诱导大鼠海马局部E2的合成.
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一种新型酯类甾体化合物的设计合成及其抗炎生物活性的研究
目的:设计合成一种具有抗炎活性的新型酯类甾体化合物.方法:以孕烯醇酮为基本母核的取代醛和酮通过Clasien-SchmidL合反应合成查尔酮衍生物后和反式肉桂酸反应合成具有酯类结构的甾体化合物;其结构通过核磁氢谱、质谱、红外图谱确证;以RAW 264.7巨噬细胞为实验细胞株,通过硝酸还原酶法检测NO的浓度来评估其抗炎活性.结果:共设计合成3个新型酯类甾体化合物(b1～3),其中b2的抗炎效果佳(IC50=3.40 μmol/L),其抑制脂多糖(LPS)诱导RAW 264.7巨噬细胞产生NO的效果随浓度的增大而增强;b2在体外抑制LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞生成NO的效果与地塞米松相当.结论:新型酯类甾体化合物具有抑制炎症介质NO增长的作用,新型酯类甾体化合物b2具有良好的抗炎效果.
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一种新型含氮杂环甾体化合物的设计合成及其抗炎生物活性的研究
目的:设计合成一种具有抗炎活性的含氮杂环新型甾体化合物.方法:以孕烯醇酮为基本母核的取代醛和酮通过Clasien-Schmidt缩合反应合成查尔酮衍生物后和氨基硫脲反应环合成具有吡唑啉结构的甾体化合物;其结构通过核磁氢谱、质谱、红外图谱确证;以RAW 264.7巨噬细胞为实验细胞株,通过用硝酸还原酶法检测NO的浓度来评估其抗炎活性.结果:共设计合成3个含氮杂环甾体化合物(b1～3),在3个新型含氮杂环甾体化合物中b1抗炎效果佳(IC50=3.17μmol/L),其抑制LPS(脂多糖)诱导RAW 264.7巨噬细胞产生的NO的效果随浓度的增强而增强;b1在体外抑制LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞生成NO的效果与地塞米松相当.结论:新型含氮杂环甾体化合物具有抑制炎症介质NO增长的作用;新型含氮杂环甾体化合物b1具有良好的抗炎效果.
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雄激素缺乏对心血管功能的影响
1 引言雄激素-睾酮主要由睾丸间质细胞合成,极少量雄激素-脱氢表雄酮由肾上腺网状带分泌.正常男子睾丸每日合成4～9 mg睾酮.睾酮由孕烯醇酮经17羟化并脱去侧链形成,在5α还原酶作用下转变为5α双氢睾酮,与特异性受体结合后发挥作用.
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PGRMC1介导孕酮抑制卵泡发育的作用及机制研究
目的 探讨孕酮膜受体(PGRMC1)在孕激素抑制卵泡发育及颗粒细胞分化中的作用及作用机制.方法 将10只21 d的SD大鼠按随机数表法分为两组(n=5),其中一组注射孕马血清促性腺激素(PMSG)(20 IU/mL)48 h后取卵巢,另外一组注射PMSG 24 h后注射孕酮(30μg/只),再经过24 h后取卵巢,通过测量卵巢大小、HE染色研究孕酮对卵泡发育的影响.PMSG(20 IU/mL)促排卵48 h后取卵巢,后通过免疫组化观察PGRMC1受体分布情况.用PMSG促排卵48 h后分离卵泡颗粒细胞,加入孕酮(100 ng/mL、250 ng/mL)和PGRMC1抑制剂AG205(10μmol/L)后,采用Western blot检测卵巢颗粒细胞甾体激素生成相关的细胞外信号调节酶(ERK1/2)、甾体激素快速调节蛋白(StAR)、细胞色素P450胆固醇侧链切割酶(P450scc)的表达情况,采用ELISA试剂盒检测培养上清中的孕烯醇酮分泌情况.结果 PMSG处理组卵巢大小为(8.6±0.93)mm,明显大于PMSG联合孕酮处理组的(5.2±0.58)mm,差异有统计学意义(P<0.05);PMSG联合孕酮处理组始基卵泡数明显高于PMSG处理组[(62±8.6)vs(39±2.9)],而有腔卵泡及成熟卵泡显著低于PMSG处理组[(3.8±1.0)vs(8.0±1.2)、(3.7±0.4)vs(8.1±0.6)],差异均有统计学意义(P<0.05);孕酮(100 ng/mL、250 ng/mL)抑制甾体激素生成相关的pERK1/2、StAR、p450scc的表达,进而抑制甾体激素的前体孕烯醇酮的合成[(2.9±0.23)ng/mL vs(5.3±0.18)ng/mL、[(3.0±0.67)ng/mL vs(5.3±0.18)ng/mL],差异均有统计学意义(P<0.05);然而PGRMC1抑制剂AG205(10μM)逆转孕酮的这种抑制作用升高pERK1/2、StAR、p450scc的表达,差异均具有统计学意义(P<0.05);AG205逆转孕酮(100 ng/mL、250 ng/mL)对孕烯醇酮合成的抑制作用[(9.6±0.67)ng/mL vs(2.9±0.18)ng/mL、(9.8±0.91)ng/mL vs(3.0±0.67)ng/mL]差异均具有统计学意义(P<0.05).结论 孕酮抑制卵泡的发育,孕酮的这种抑制作用主要体现在对窦前卵泡的抑制作用.孕酮对卵巢颗粒细胞甾体激素的合成有抑制作用,PGRMC1的抑制剂AG205可以逆转孕酮的抑制作用,提示孕酮抑制卵泡发育,抑制颗粒细胞分化作用部分依赖于PGRMC1.
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高效液相色谱法测定川芎中孕烯醇酮的含量
目的:建立川芎药材中孕烯醇酮的高效液相色谱法(HPLC)含量测定方法,并对10批川芎药材进行了含量测定.方法:采用HPLC法,色谱柱:Diamonsil(r) (钻石)C18(25cm×4.6mm,5μm),流动相:乙腈-水(48:2),流速:1 mL/min,测定波长:204 nm.结果:孕烯醇酮在0.4016～2.008μg(r=0.9996)范围内,峰面积与进样量呈良好的线性关系;平均加样回收率为98.97%;RSD为1.97%.结论:该方法简便、准确、快速、重复性好,可作为川芎质量评价标准之一.
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孕烯醇酮对大鼠空间学习记忆能力和ChAT蛋白表达的影响
目的:研究孕烯醇酮(Pregnenolone,PREG)干预对老年雄性SD大鼠空间学习记忆能力的影响,探讨PREG的潜在神经保护作用及其机制.方法:24月龄雄性SD大鼠40只,随机分为对照组(A组)、溶剂对照组(B组)、低剂量PREG(0.5mg/kg)干预组(C组)、高剂量PREG(2.0mg/kg)干预组(D组),隔日腹腔注射一个月,利用Y迷宫训练评估PREG对实验大鼠空间学习记忆能力的影响,运用免疫荧光技术和Western Blot检测分析大鼠记忆相关脑区ChAT蛋白表达的变化.结果:Y迷宫训练结果显示D组大鼠平均连续正确反应次数为7.5±1.35,明显多于其他各组;免疫荧光检测结果显示D组大鼠前额叶、颞叶、海马内ChAT免疫阳性的细胞数量相应是26.8±2.6、19.8±2.6、25.8±2.4,明显多于其他处理组;Western Blot检测显示D组大鼠前额叶、颞叶、海马皮层组织ChAT蛋白的表达明显高于其他各组(P＜0.05).结论:PREG有助于改善老年雄性SD大鼠空间学习记忆能力,其作用机制可能是促进了大鼠记忆相关脑区ChAT的表达上调,提高了胆碱能神经元细胞的功能活性.
