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"慢性肾衰基本方"含药血清对人肾小管上皮细胞转分化的影响
目的:观察经验方"慢性肾衰基本方"对转化生长因子β1(TGF-β1)所诱导的肾小管上皮细胞(TECs)转分化及细胞外基质分泌的影响,以进一步证实并初步探讨其延缓慢性肾衰竭肾小管-间质纤维化的作用机制.方法:给予家兔中药灌胃3 d后制备"慢性肾衰基本方"含药兔血清,应用不同浓度含药血清处理经TGF-β1诱导活化的HK-2细胞,然后应用免疫细胞化学方法、流式细胞技术测定HK-2细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达率;应用酶联免疫吸附检测法(ELISA)测定培养上清纤维连结蛋白(FN)及Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)水平,并进而计算单个细胞FN及Col-Ⅳ分泌水平.结果:含药兔血清呈剂量依赖方式逆转TGF-β1诱导的HK-2细胞α-SMA的表达,并呈剂量依赖方式抑制单个细胞FN及Col-Ⅳ的分泌.结论:"慢性肾衰基本方"至少部分是通过抑制肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质的过度分泌而对防治肾小管-间质纤维化发挥作用.
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松弛素对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化及分泌细胞外基质的影响
目的:观察人松弛素(Relaxin)对高糖培养人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化、分泌细胞外基质的影响.方法:实验分组:正常糖组:含5.5 mmol/L葡萄糖;高糖组:含30 mmol/L葡萄糖;高渗组(甘露醇组);高糖+松弛素干预组;ELISA法检测细胞上清中TGF-β1、细胞胶原(ColⅠ)、纤连蛋白(FN)的表达.免疫印迹技术(Western blot)检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达,确定肾小管上皮细胞表型转化情况.结果:与正常糖组相比,高糖组肾小管上皮细胞分泌ColⅠ、FN 、TGF-β1显著增加,在高糖培养基中加入人松弛素干预后可显著抑制由高糖诱导的ColⅠ、FN、TGF-β1的高表达,降低α-SMA表达,抑制肾小管上皮细胞转分化.结论:松弛素能抑制高糖诱导HK-2细胞分泌细胞外基质,抑制HK-2细胞转分化,具有抗纤维化作用.
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毛蕊异黄酮对高糖诱导内皮细胞转分化的影响及机制初探
目的:探讨毛蕊异黄酮对高糖作用下人脐静脉内皮细胞转分化及转化生长因子 β1(TGF-β1)分泌的影响,以阐明毛蕊异黄酮对糖尿病肾病的保护作用.方法:人脐静脉内皮细胞系(ECV-304)常规细胞培养传代,用于实验.细胞分为5组:高糖组:葡萄糖(GS)(4.25％);毛瑞异黄酮组低剂量组:高糖(4.25％GS)+毛蕊异黄酮(0.1 mg/L);毛瑞异黄酮组中剂量组:高糖(4.25％GS)+毛蕊异黄酮(1 mg/L);毛蕊异黄酮组高剂量组:高糖(4.25％GS)+毛蕊异黄酮(10 mg/L);正常对照组:培养液中不加任何处理因素.各组加入干预因素后,在5％CO2和37℃ 条件下孵育48 h,分别收集细胞进行检测.荧光相差显微镜观察细胞形态学变化,Western印迹方法检测细胞 α-SMA蛋白表达水平.ELISA法检测细胞培养上清液中TGF-β1的含量.结果:与正常对照组相比,高糖组细胞从原有典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞形态,高糖明显促进 α-SMA蛋白的表达(P<0.01)和TGF-β1分泌(P<0.05);毛蕊异黄酮与高糖共培养后可明显抑制高糖诱导的细胞形态学改变及 α-SMA表达(P<0.05)和TGF-β1分泌(P<0.05),并呈浓度依赖性.高剂量组比低、中剂量组有更强的抑制效应,低剂量组抑制效应弱.结论:毛蕊异黄酮以浓度依赖性抑制内皮细胞转分化,这种效应可能与抑制TGF-β1分泌有关,从而为毛蕊异黄酮防治糖尿病肾病提供了依据.
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汉防己甲素对马兜铃酸A诱导的人近端肾小管上皮细胞转分化的干预作用
目的:探讨汉防已甲素(tetrandrine,Tet)时马兜铃酸A(aristolochic acid I,AAI)诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2)转分化的拮抗效应.方法:将正常培养的HK-2随机分组:正常组、模型组、汉防已甲素高浓度组、汉防己甲素中浓度组、汉防己甲素低浓度组、泼尼松龙对照组(糖皮质激素组).48 h后观察各组细胞形态的变化,逆转录-聚合酶链式反应方法检测各组E-cadherin、TGF-β1、α-SMA mRNA表达水平,双抗体夹心酶联免疫吸附法测定各组细胞培养液中TGF-β1浓度,流式细胞技术测定各组E-cadherin阳性表达细胞的百分率.结果:汉防己甲素干预组及泼尼松龙对照组E-cadherin mRNA表达水平明显高于模型组(P<0.05),相反,其TGF-β1、α-SMA mRNA表达水平明显低于模型组(P<0.05);汉防己甲素干预组及泼尼松龙对照组TGF-β1浓度亦明显低于模型组(P<0.05);汉防己甲素干预组(中、低浓度)E-cadherin阳性表达细胞的百分率明显高于模型组(P<0.05),但汉防己甲素高浓度组和泼尼松龙对照组E-cadherin阳性表达细胞的百分率较之模型组增高不明显(P>0.05).结论:一定浓度(10μg/ml)的AAI能诱导体外培养的HK-2转分化,适当浓度的Tet对AAI诱导的HK-2转分化具有明显的拮抗作用;AAI亦能上调TGF-β1的表达,而适当浓度的Tet能拮抗AAI引起的TGF-β1的高表达.
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非经典型蛋白激酶C在尿蛋白诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用
目的:探讨非经典型PKC同工酶(PKC-ζ和PKC-)在尿蛋白诱导的肾小管上皮细胞(RTECs)转分化中的作用.方法:首先免疫组化法检测PKC-ζ和PKC-ι在人正常及不同类型肾小球疾病患者肾组织的表达并分析其表达量的变化.接着应用不同浓度的尿蛋白(0 mg/ml、0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml、4.0 mg/ml及8.0 mg/ml)处理体外培养的HK-2细胞,应用免疫细胞化学法检测HK-2细胞E-cadherin和α-SMA的表达以观察HK-2细胞转分化情况,选择诱导HK-2细胞转分化适宜的尿蛋白浓度进行后续试验.将HK-2细胞分对照组和尿蛋白组,分别给予无血清培养基和尿蛋白(4.0 mg/ml)刺激,分别用免疫荧光及Western Blot法检测各组细胞内PKC-ζ和PKC-ι在细胞膜及细胞浆的活化易位情况.结果:(1)两种非经典型PKC同工酶PKC-ζ和PKC-ι在正常和肾小球疾病肾组织肾小球和RTECs均有表达,在肾间质均无表达,表达量不尽相同.PKC-ζ在肾小球疾病肾组织肾小球中的表达量均较正常肾组织显著减少(P＜0.05),在MCD和FSGS的RTECs中的表达量较正常肾组织显著减少(P＜0.05).PKC-ι在FSGS的肾小球和RTECs中的表达量均显著减少(P＜0.05),在IgAN肾组织RTECs中表达显著增高(P＜0.05),在肾小球表达无明显差别.(2)不同浓度的尿蛋白刺激HK-2细胞48 h后,当尿蛋白的浓度逐渐升高时,HK-2细胞随之转变为类似成纤维细胞形态,细胞E-cadhefin表达下调及α-SMA表达上调.尿蛋白浓度为4.0 mg/ml诱导HK-2细胞转分化明显.(3)尿蛋白诱导HK-2细胞转分化时,PKC-ζ和PKC-ι无明显活化易位.结论:两种非经典型PKC同工酶均在人类肾组织表达,提示PKC-ζ和PKC-ι均参与肾脏的生理过程,但PKC-ζ和PKC-ι在尿蛋白诱导的肾小管上皮细胞转分化中并未发挥相关作用.
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重视凝血酶在肾间质纤维化中的地位及中医虫类药的干预作用
慢性肾脏病( chronic kidney disease,CKD)患病率在全球范围内呈持续增长趋势,2012年我国的一项调查研究发现中国慢性肾病发病率为10.8%[1],CKD已成为严重危害公众健康的议题。而肾小管间质病变较肾小球病变在慢性肾脏疾病进展中的意义更为重要[2],这显然已成为国内外学术界的共识,并因此开展了一系列有关肾间质纤维化( renal interstitial fi-brosis,RIF)的发病机制及防治研究。我们可以看到,近二十年来现代医学应用细胞分子生物学对RIF的发病机制进行了广泛的研究,研究表明多种细胞因子及相互间复杂的信号级联转导参与了RIF炎症、氧化应激、细胞凋亡、成纤维细胞增殖和活化等过程的发生发展,而具有放大级联效应的核转录因子-κB ( nu-clear factor kappa B,NF-κB)、TGF-β/Smads信号通路、肾素-血管紧张素系统( renin -angiotensin sys-tem,RAS)、及肾小管上皮细胞间充质转分化( epitheli-al to mesenchymal transition,EMT)在肾间质纤维化中的作用,日益得到广泛的重视。其中,肾小管上皮细胞间充质转分化为RIF的发病机制提供了合理的解释而成为我们研究的新宠,大多学者认为在RIF的发生发展过程中,无论是血管紧张素Ⅱ( angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)抑或其他致纤维化因素,几乎都可作为EMT相关细胞信号转导的上游分子,介导EMT的发生,并以此为理论基础,提出抑制或逆转EMT是防治肾纤维化的有效途径。然而近年来国外学者对EMT与肾脏纤维化的传统观点提出挑战,新研究未能发现EMT参与肾间质纤维化的直接证据[3~5],可以说, EMT与肾间质纤维化的关系还需要更加严密的研究来明确。因此,无论是基础实验还是临床研究,我们急需努力挖掘新的切入点,从多方位、多视角深入研究RIF的病变机制,从而为RIF的防治研究提供新的思路和靶点。
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红景天对AOPPs诱导小鼠足细胞转分化的影响
目的:探讨红景天(salidroside)对晚期氧化蛋白产物(AOPPs)诱导小鼠足细胞转分化的影响.方法:以小鼠永生性足细胞系为研究对象.给予200 μg/ml的AOPP刺激小鼠足细胞24 h,同时加入红景天(浓度分别为0.1 μmol、1 μmol、10 μmol、100 μmol、200 μmol)进行干预,采用Western blot 检测内质网应激标志性蛋白Grp78、CHOP以及平滑肌激动蛋白(α-SMA)、nephrin、podocin的表达水平.结果:200 μg/ml AOPP条件下小鼠足细胞表达高水平的Grp78、CHOP及α-SMA,表达低水平的nephrin和podocin;予不同浓度红景天作用后,足细胞中Grp78、CHOP及α-SMA的表达水平降低,nephrin和podocin的表达水平升高.结果表明红景天可部分逆转AOPPs的作用,且存在一定的剂量依赖性.结论:红景天对AOPPs诱导的足细胞Grp78、CHOP过度表达有很好的抑制作用,这可能是它减轻肾脏纤维化的机制之一.
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肝细胞生长因子对高糖环境下肾小管上皮细胞增殖及转化生长因子β1表达的影响
糖尿病肾病(DN)是糖尿病的常见微血管慢性并发症之一,是导致慢性肾功能不全的重要原因.转化生长因子β1(TGF-β1)被认为是DN中促小管间质病变的重要的因子之一,TGF-β1可促进肾小管细胞向成纤维细胞的转分化.肝细胞生长因子(HGF)是一种多效性生长因子,它介导上皮-间质和内皮-间质之间相互分化,不仅与器官发育形成和再生修复有关,而且也可作为负性调节因子,在肝硬化、肺纤维化中起重要的抗纤维化作用;HGF还是一种促细胞修复因子,在DN肾修复过程中可能起着一定的作用.本研究通过体外细胞模型,探讨HGF对高糖环境下肾小管上皮细胞的作用.
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环孢素A对糖尿病肾病大鼠肾脏转化生长因子-β1及E-钙黏素表达的影响
糖尿病是一种常见的由内分泌系统代谢障碍引起的慢性终身疾病，而糖尿病肾病是其严重的微血管病变之一。肾脏纤维化的基本病理改变是细胞外基质（ECM）的过度沉积，进而取代了肾脏固有细胞，破坏肾脏正常结构。转化生长因子（TGF）-β1是上皮细胞-间充质转分化（EMT）过程主要的促进因子和启动因子［1］，E-钙黏素是肾小管上皮细胞特有的标志物，参与了EMT的主要过程。本研究利用环孢素治疗链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病肾病大鼠，观察环孢素对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β1以及E-钙黏素表达，为免疫抑制剂治疗糖尿病肾病提供新的理论依据。
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激活素A及卵泡抑素对肾小管上皮细胞转分化的作用
目的 探讨激活素A(ACT A)对大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)转分化的影响及卵泡抑素(FS)的干预作用.方法 NRK-52E细胞生长于达氏修正伊氏培养基(DMEM)/F12培养基.实验A:将培养的NRK-52E细胞按rh-ACT A浓度不同分为4组:ACT A浓度分别为0,1,10,100 ng/ml.实验B:分为4组:对照组；ACT A组(A组),rh-ACT A浓度10 ng/ml；rh-FS组(F组),rh-FS浓度为100 ng/ml; ACT A+FS组(A+F组):rh-ACT A浓度10 ng/ml,rh-FS浓度为100 ng/ml.24 h后收集各组细胞及细胞上清液.蛋白印迹法检测各组细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤维连接蛋白(FN)的表达；酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞上清液转化生长因子-β(TGF-β)的含量.结果 ACT A能剂量依赖性刺激肾小管上皮细胞α-SMA及FN的表达(P＜0.05),而对TGF-β的表达没有影响.FS能抑制ACT A的上述效应,而单纯FS对肾小管上皮细胞α-SMA及FN的表达无影响(P＞0.05).结论 ACT A能刺激NRK-52E细胞转分化及FN的合成；FS可通过阻断ACT A的上述效应产生有效的肾脏保护作用.
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中医药对肾小管上皮细胞转分化影响研究进展
肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化(EMT)是肾间质纤维化的重要发病机制之一,在此基础上,出现间质区细胞外基质(ECM)大量产生和沉积,导致间质区扩展加宽,肾小管萎缩,形成问质纤维化.
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锌离子对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响及机制
目的 研究锌离子对转化生长因子-β1 (TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞转分化(EMT)的影响.方法 常规培养肾小管上皮细胞、传代、分组:①正常对照组;②TGF-β1组(10ng/ml TGF-β1作用48h);③ZnSO4作用组(30μM ZnSO4作用24h后,加10ng/ml TGF-β 1作用48h).采用相差显微镜观察各组细胞表型改变,免疫荧光及Western blotting方法检测波形蛋白(vimentin)、上皮钙黏素(E-cadherin)、I型胶原酶(collagen I)蛋白表达.应用Western blotting检测p-Akt蛋白表达.结果 TGF-β1可以导致肾小管上皮细胞vimentin、collagen I和p-Akt蛋白表达增高,使E-cadherin蛋白表达降低.ZnSO4作用后可有效降低由TGF-β1导致的肾小管上皮细胞vimentin、collagenI及p-Akt的高表达,同时使E-cadherin蛋白表达增多.结论 ZnSO4阻抑TGF-β1所致的肾小管上皮细胞的EMT,其作用可能与PI-3K/Akt信号通路相关.
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间充质干细胞对慢性间质性肾炎大鼠转分化相关细胞因子表达的影响
目的 观察慢性间质性肾炎大鼠模型纤维化相关细胞因子的变化,以及间充质干细胞对其表达的影响.方法 雌性Wistar大鼠随机分为3组:对照组(尾静脉注射生理盐水)、模型组、间充质干细胞组.关木通水煎剂灌胃12周后尾静脉注射间充质干细胞,注射后第8周末处死大鼠,留取血、尿、肾组织标本.肾组织连续切片,分别用免疫组化、免疫印记及RT-PCR方法检测平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白和mRNA的表达情况.结果 模型组病理改变明显,肾损伤严重、肾小管萎缩及间质纤维化明显,间充质干细胞组肾损伤明显改善,间质纤维化明显减轻.模型组肾脏α-SMA蛋白和mRNA阳性表达水平高于对照组,间充质干细胞组较模型组表达量明显减少(P＜0.01).结论 间充质干细胞减少慢性间质性肾炎大鼠肾小管上皮细胞转分化与降低α-SMA的表达相关.
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小檗碱对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化及TGF-β/Smad通路的影响
目的 研究小檗碱(BBr)对转化生长因子-β1 (TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞(NRK-52E)转分化(EMT)及TGF-β/Smad通路的影响.方法常规培养肾小管上皮细胞、传代、分组:①正常对照组;②TGF-β1组(10ng/ml TGF-β1作用48h);③小檗碱作用组(30μM小檗碱作用24h后加10ng/ml TGF-β1作用48h).采用相差显微镜观察各组细胞表型改变,免疫荧光及Western Blot方法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏素(E-cadherin)、Smad2、Smad3、磷酸化的Smad2、3(P-Smad2、3)蛋白表达;应用流式细胞术,采用活性氧自由基(ROS)检测试剂盒检测各组别的ROS蛋白表达情况.结果TGF-β1处理可导致NRK-52F胞的α-SMA蛋白表达明显升高,E-cadherin蛋白表达降低.而小檗碱处理能够减少肾小管上皮细胞α-SMA的高表达,提高E-cadherin蛋白的表达;同时,小檗碱可有效降低由TGF-β 1引起的NRK-52E细胞中ROS的过多产生.此外,小檗碱可有效抑制Smad2/3的活化.结论小檗碱可逆转TGF-β 1所致的肾小管上皮细胞的EMT,其作用机制可能是通过抑制氧化应激及TGF-β/Smad信号通路而发挥作用.
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二甲基亚砜诱导成年大鼠骨髓基质细胞转分化为胰岛样细胞
背景:已有报道,二甲基亚砜可使骨髓基质细胞分化为神经元,那么可否用二甲基亚砜诱导骨髓基质细胞向nestin阳性细胞分化,继而向胰岛分化.目的:探讨二甲基亚砜对成年大鼠骨髓基质细胞定向诱导分化为胰岛样细胞团的作用.设计:以细胞为观察对象,随机对照,体外实验.单位:河北北方学院医学院组织学与胚胎学教研室.材料:实验于2006-05/2007-07在河北北方学院组胚教研室细胞审完成.选取6～8周龄Wistar大鼠10只,性别不拘,由解放军军事医学科学院实验动物中心提供.实验用分析纯二甲基亚砜购自北京市化学试剂厂,反转录聚合酶链反应系统为Promega公司产品(A3500),Taq酶和DNA marker DL2000购自北京天为时代生物技术有限公司,鼠抗人胰岛素单克隆抗体(ZM20155)、兔抗人胰高血糖素多克隆抗体(zA20119)购自北京中杉金桥生物技术有限公司,兔抗人nestin多克隆抗体(与大鼠组织有良好的交叉反应,可用于检测人、大鼠等哺乳动物组织)、SABC试剂盒购自武汉博士德公司,大鼠胰岛素放射免疫试剂盒,购自美国Linco公司.方法:骨髓基质细胞以含体积分数0.1胎牛血清的H-DMEM培养60 min,收集未贴壁细胞以含10 g/L二甲基亚砜的无血清H-DMEM作为诱导液,以109/cm2密度接种于6孔板,诱导3 d,继之用体积分数0.1胎牛血清的H-DMEM培养7 d.主要观察指标:用DTZ染色观察诱导细胞团的形态,免疫细胞化学染色检测巢蛋白、胰岛素、胰高血糖素、生长抑索的定位:反转录聚合酶链反应检测诱导细胞团的内分泌基因表达;放免分析检测细胞团的胰岛素分泌量.结果:①骨髓基质细胞分化的细胞团形态:骨髓基质细胞为典型的成纤维细胞样或葡萄样贴壁细胞,经二甲基亚砜诱导3 d后,出现胰岛样细胞团,经DTZ染色显示了和胰岛同样的特性.②免疫细胞化学染色显示:二甲基亚砜诱导后1 d骨髓基质细胞表达nestin蛋白,诱导10 d表达胰岛素和胰高血糖素;未经二甲基哑砜诱导的骨髓基质细胞则不表达胰岛素和胰高血糖素.③反转录聚合酶链反应结果显示:骨髓基质细胞经二甲基亚砜诱导后胰岛样细胞团表达insulin1,insulin2,glucagon和somatostain基因.④细胞团的胰岛索分泌量:胰岛样细胞团对葡萄糖刺激敏感,低糖(3.3 mmol/L)和高糖条件下(16.7 mmol/L)胰岛素分泌量分别为5.56和24.5μU/mL.结论:体外经二甲基亚砜诱导的大鼠骨髓基质细胞可定向分化为胰岛样细胞.
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转化生长因子β1对肾小管上皮细胞转分化和细胞外基质成分的调节与阿魏酸钠的干预效果
背景:细胞外基质在肾间质的积聚是肾小管间质纤维化的主要特征.肾小管上皮细胞一肌成纤维细胞转分化在肾间质纤维化发病机制中起了重要作用.目的:从细胞水平观察阿魏酸钠对转化生长因子β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化及细胞外基质主要成分Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤维粘连蛋白的影响.设计:以细胞为观察对象,随机对照实验.单位:四川大学华西医院肾脏科.材料:大鼠肾小管上皮细胞株NRK52E来源于American Type Culture Collection(ATCC),由澳大利亚Monash医学中心肾内科实验室提供,本实验所用细胞株为第36代.阿魏酸钠为白色晶体,可溶于水,纯度>98.0%,由成都亨达药业有限公司提供.实验时终浓度分别125,250,500μmol/L.兔抗大鼠α平滑肌肌动蛋白多克隆抗体为武汉博士德产品;EUSA试剂盒为上海森雄公司产品;人重组转化生长因子β1为R&D公司产品:DNA Engine OpticonTM实时荧光定量聚合酶链反应仪为MJResearch产品.方法:将体外培养的细胞株NRK52E分为5组;空白对照组:仅加入含血清的DMEM培养基;转化生长因子β1刺激组:培养液中加入终质量浓度为5ng/L的转化生长因子β1;阿魏酸钠低、中、高浓度组:培养液中加入终质量浓度为5 ng/L转化生长因子β1和125,250,500μmol/L的阿魏酸钠.主要观察指标:应用相差显微镜、实时荧光定量聚合酶链反应、酶联免疫吸附法观察阿魏酸钠对转化生长因子β1诱导的NRK52E细胞转分化的作用及对细胞外基质主要成分胶原Ⅰ胶原Ⅲ和纤维粘连蛋白的影响.结果:①NRK52E细胞形态:与空白对照组相比,转化生长因子β1刺激组细胞在培养3 d后,细胞株NRK52E从原有典型的铺路石样上皮细胞形态转变为长梭形类似成纤维细胞的形态.阿魏酸钠3个浓度组细胞受转化生长因子β1的刺激而出现的形态学改变得到不同程度的改善,并呈剂量依赖性.②α-平滑肌肌动蛋白mRNA表达:转化生长因子β15 ng/L诱导6 h后α-平滑肌肌动蛋白mRNA较空白对照组上升,在72 h达高峰;经过不同剂量阿魏酸钠干预72 h后α-平滑肌肌动蛋白mRNA显著下调并呈剂量依赖性(P<0.05).③细胞外基质变化:经转化生长因子β15 ng/L诱导72h后,细胞培养上清中Ⅰ型胶原,Ⅲ型胶原和纤维粘连蛋白含量明显增加(P<0.05).经过不同剂量的阿魏酸钠干预后,不同程度地抑制了转化生长因子β1促Ⅰ型胶原、Ⅲ犁胶原和纤维粘连蛋白增多的作用,并呈剂量依赖性(P<0.05).结论:转化生长因子β1可以诱导大鼠肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化,刺激细胞外基质成分Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤维粘连蛋白的升高.阿魏酸钠可剂量依赖性地抑制转化生长因子β1所导致的肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化作用.
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单核细胞向淋巴管内皮细胞诱导分化的潜能
背景:有研究报道,在包括血管内皮生长因子在内的多种因子诱导下,单核细胞能够转化成血管内皮细胞;而在体外条件下,单核细胞能否转化成淋巴管内皮细胞,至今未见报道.目的:观察单核细胞存炎症环境中转分化成淋巴管内皮细胞的可能性.方法:采用Ficoll密度梯度离心法分离成人新鲜外周血单核细胞,用细胞培养基培养,然后分别用纤维连接蛋白、肿瘤坏死因子α诱导24 h.用RT-PCR和免疫细胞化学方法检测单核细胞对淋巴管内皮特异性标志物LYVE-1、Podoplanin、Prox1、血管内皮生长因子受体3以及内皮细胞抗原vWF、内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子受体2的摹因和蛋白表达.结果与结论:单核细胞在诱导之前,对LYVE-1表达阳性,对Podoplanin、Prox1、血管内皮生长因子受体3、vWF、内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子受体2表达均为阴性;经上述因子刺激后,单核细胞对Podoplanin、Prox-1、血管内皮生长因子受体3表达阳性,vWF、内皮型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子受体2表达仍呈阴性.提示纤维连接蛋白、肿瘤坏死因子α均能有效刺激单核细胞表达淋巴管内皮标志物.
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转化生长因子β1在白细胞介素1β诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化及大黄素干预中的作用
目的:大黄素对白细胞介素1β诱导NRK52E细胞转分化有显著抑制作用.实验拟进一步观察转化生长因子β1在白细胞介素1β诱导大鼠肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化及大黄素抑制作用中的意义.方法:实验于2006-10/2007-05在泸州医学院附属医院免疫实验室完成.(1)实验材料及分组:以培养的大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)为观察对象,按如下分组分别添加不同处理因素:①对照组:仅加入体积分数为0.05小牛血清的高糖DMEM培养基.②白细胞介素1β诱导组:加含白细胞介素1β终浓度为10 μg/L的高糖DMEM培养基.③SB431542阻断组:加含白细胞介素1β终浓度为10 μg/L及SB431542终浓度为10 μmol/L的高糖DMEM培养基.④白细胞介素1β+大黄素组:同时加分别含白细胞介素1β终浓度为10 μg/L及大黄素终浓度为25 mg/L的高糖DMEM培养基.(2)实验评估:培养48 h后用倒置相差显微镜观察细胞形态,细胞免疫化学染色法检测肌酸激酶、α-平滑肌肌动蛋白及转化生长因子β1的表达.结果:①白细胞介素1β可诱导部分细胞由卵圆形转变为梭形,且肌酸激酶表达减弱(P＜0.01),α-平滑肌肌动蛋白及转化生长因子β1表达显著增强(P＜0.01).②SB431542特异性抑制转化生长因子β1作用后,白细胞介素1β诱导的细胞形态改变受抑,同时肌酸激酶表达增强(P＜0.01),α-平滑肌肌动蛋白表达减弱(P＜0.01),但转化生长因子β1的表达却无明显变化.③大黄素对白细胞介素1β诱导的细胞形态改变及肌酸激酶、α-平滑肌肌动蛋白的表达有明显抑制作用,其抑制作用与SB431542的作用相比无显著差异;同时,大黄素对白细胞介素1β诱导的转化生长因子β1的表达也有明显抑制作用(P＜0.01).结论:转化生长因子β1可能介导了白细胞介素1β诱导大鼠肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化,并参与了大黄素抑制白细胞介素1β诱导大鼠肾小管上皮细胞转分化的作用.
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白细胞介素1β诱导肾小管上皮细胞的转分化
目的:观察白细胞介素1β对肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化及细胞分泌功能的影响.方法:实验于2005-06/2006-01在泸州医学院附属医院传染免疫研究室完成.以体外培养的正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)为研究对象,给予白细胞介素1β(10 μg/L)刺激,12,24,48,72 h后在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化;免疫双标法检测α-平滑肌肌动蛋白和E-钙粘连素的表达;ELISA法测定培养细胞分泌的纤维连接蛋白含量.结果:白细胞介素1β刺激48 h后肾小管上皮细胞转变为明显类似成纤维细胞形态;刺激12 h即可见α-平滑肌肌动蛋白的表达由64.80±2.19增加到83.23±2.71(P＜0.05),E-钙粘连素的表达由81.77±1.27减少到64.50±1.31(P＜0.05),随刺激时间延长上述变化越明显,72 h α-平滑肌肌动蛋白表达增加到170.53±3.94;E-钙粘连素表达减少到26.20±2.32.细胞培养上清液中纤维连接蛋白含量随时间延长增加(P＜0.05),白细胞介素1β刺激72 h时纤维连接蛋白增加1倍.结论:白细胞介素1β可诱导肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化,增加纤维连接蛋白的分泌.
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人皮肤源性间充质干细胞体外诱导向淋巴细胞分化的可能性
背景:研究发现真皮组织中存在间充质干细胞,存在自体移植的可能性.如能在一定条件下将皮肤来源的间充质干细胞诱导分化为淋巴细胞,则可解决许多免疫系统损伤疾病.目的:探讨人皮肤源性间充质干细胞经体外诱导向淋巴细胞转分化的可能性.方法:体外培养人皮肤源性间充质干细胞至第14代,流式细胞仪检测细胞表面标志的表达.诱导人皮肤源性间充质干细胞转分化的条件培养基由人淋巴细胞培养上清液和新鲜人皮肤源性间充质干细胞培养液以7:3比例组成.倒置显微镜观察诱导后细胞形态学变化.流式细胞仪检测诱导后1-8d细胞表面淋巴细胞标志的表达.流式细胞仪检测诱导后3,6,9 d人皮肤间充质干细胞自身标记表达的变化.结果与结论:人皮肤源性间充质干细胞稳定表达自身特异性标志CD73,Vimentin等,不表达造血系统特异性标志CD34.CD45等,且低表达HLA-1.完全不表达HLA-DR.诱导3 d后,细胞体积明显增大,细胞增殖速度明显低于诱导前,细胞内和细胞间存在许多折光性强的囊胞样颗粒.除CD45淋巴细胞标志的表达无明显变化外,诱导后1-4 d人皮肤源性间充质干细胞CD3,CD19,CD16,CD4,CD8的表达率均随诱导时间的延长呈线性升高趋势.诱导后5-8 d处于平台期.诱导后3,6,9d人皮肤源性间充质干细胞自身标记CD73,CD34,Vimentin,HLA-DR的表达无变化,HLA-l的表达率随诱导时间的延长逐渐上升.提示在体外人皮肤源性间充质干细胞可以被诱导向淋巴细胞转分化,具有参与免疫系统损伤修复的潜能.
