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贯叶连翘提取物对TGF-β1诱导肺成纤维细胞胶原合成影响的体外研究
目的 研究贯叶连翘提取物对TGF-β1诱导高体肺成纤维细胞胶原合成的影响.方法 离体成纤维细胞分别加入TGF-β1(10ng/ml)、贯叶连翘提取物(250 mg/L)以及TGF-β1+贯叶连翘提取物共培养48h,设为TGF-β1组,贯叶连翘组,TGF-β1+贯叶连翘组,取DMEM培养液为对照组.应用SP免疫细胞化学法,免疫荧光细胞化学法及平均光密度(MOD)分析,观察在TGF-β1作用下,肺成纤维细胞α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达及贯叶连翘提取物的干预.结果 TGF-β1诱导肺成纤维细胞α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性染色表达均显著高于对照组.贯叶连翘提取物干预48小时后,α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性染色表达明显下降,仍高于空白对照组.结论 贯叶连翘提取物可抑制TGF-β1诱导肺成纤维细胞转分化及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的合成.
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SLE肾脏细胞转分化为肌成纤维细胞在LN肾损伤中的病理作用
目的 通过免疫组化的方法研究狼疮肾炎肾活检组织中α-SMA(α-平滑肌动蛋白)的表达,从而探讨细胞转分化为肌成纤维细胞,表达α-SMA在LN肾组织损伤中的作用.方法 采用免疫组化的方法对26 例狼疮肾炎患者肾活检组织中α-SMA的表达水平,并与5例正常肾组织比较.结论 细胞转分化为肌成纤维细胞,表达α-SMA在狼疮肾炎的发展及肾损伤进入慢性化、纤维化阶段起重要作用.
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共培养的角膜上皮细胞诱导人羊膜上皮细胞分化为角膜上皮样细胞
目的 探讨体外培养人羊膜上皮细胞(HAEC)并定向诱导分化为角膜上皮样细胞的可行性.方法 采用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化分离培养HAEC,通过TranswellTM非接触共培养系统与人角膜上皮细胞(CEC)进行共培养2周,诱导HAEC分化;通过免疫荧光细胞化学染色法检测诱导后HAEC中细胞角蛋白3+12(CK3+ 12)、CK14、CK19、增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测分化细胞CK12、CK14、CK19、P63 mRNA水平,Western blot法检测HAEC诱导前后CK3+ 12、CK14、CK19、P63的蛋白水平.结果 体外培养的HAEC和CEC形态相似,免疫荧光细胞化学染色检测到HAEC诱导分化细胞CK3 +12、CK14、CK19、PCNA呈阳性表达,诱导后HAEC中P63、CK12、CK19、CK14 mRNA相对表达量分别为共培养前的3.35、6.76、2.42、1.06倍.结论 在与CEC共培养2周后,HAEC可以转分化为角膜上皮样细胞,HAEC可用作组织工程角膜重建的种子细胞.
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瘦素促进肺成纤维细胞向肌纤维母细胞的转分化
目的 探讨瘦素对肺成纤维细胞向肌纤维母细胞转分化的影响及其作用机制.方法 体外培养HFL-1人胚肺成纤维细胞,用(0～200) ng/mL重组人瘦素(rHL)干预或联合转化生长因子β1(TGF-β1)处理HFL-1细胞,Western blot法测定α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化的AKT(p-AKT)的表达.CCK-8法测定细胞增殖,ELISA测定细胞上清液1型胶原蛋白含量.结果 (50、100、200) ng/mL的rHL处理HFL-1细胞48 h,α-SMA的蛋白表达水平均较对照组明显上调;与200 ng/mL rHL或5 ng/mL TGF-β1单独处理的细胞相比,200 ng/mL rHL和5ng/mL TGF-β1联合处理HFL-1细胞48h,HFL-1细胞α-SMA蛋白表达水平显著上调.rHL能够上调HFL-1细胞p-AKT的表达,LY294002可抑制rHL对HFL-1细胞α-SMA表达的诱导作用.与对照组相比,(12.5、25、50、100、200) ng/mL作用72 h,细胞存活率无显著性差异.(50～200) ng/mL rHL作用48 h,细胞上清液中1型胶原蛋白含量明显升高.结论 瘦素能够促进肺成纤维细胞向肌纤维母细胞转分化,其作用机制与激活PI3K/AKT信号通路有关.
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人羊膜上皮细胞的诱导分化
目的:建立体外培养及标记人羊膜上皮细胞(HAECs)的方法并应用原子力显微镜(AFM)从细胞形貌变化上探讨人羊膜上皮细胞向角膜上皮细胞转分化的可视性研究.方法:取足月产人羊膜,采用酶消化法获得HAECs进行原代和传代培养,对培养的细胞进行形态学观察和鉴定；HAECs与兔角膜基质细胞共培养2周,采用CK3+ 12免疫荧光细胞化学染色鉴定诱导后的细胞；应用AFM分别对共培养前后的人羊膜上皮细胞的表面超微结构进行观察,并与人角膜上皮细胞( HCECs)对比,分析细胞形貌的变化.结果:HAECs体外培养呈铺路石样外观,核/质比率小,连接成片.细胞形态为多角形,角蛋白keratin表达阳性,不表达CK3+12；免疫荧光显示共培养2周的HAECs表达CK3+ 12；AFM观察,共培养2周后HAECs细胞核中央由山谷样外观转变成类似HCECs的山峰样外观.结论:HAECs可成功进行原代和传代培养,在兔角膜基质细胞诱导培养条件下可向角膜上皮细胞转分化.
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肾小管上皮细胞转分化过程中ILK的表达变化及大黄素对其的干预效应
目的:研究信号蛋白ILK在IL-1β诱导的肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化(TEMT)中的表达变化以及大黄素是否是通过抑制ILK的表达而影响IL-1β诱导的肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化.方法:以体外培养的正常大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)为研究对象,分为空白对照组、大黄素对照组、IL-1β诱导组、IL-1β加大黄素组.在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化;免疫双标法检测a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)和E-钙黏连素(E-cadherin)的表达;免疫单染检测ILK的表达;ELISA法测定培养细胞分泌的纤维连接蛋白(FN)含量.结果:IL-1β诱导细胞转变为明显类似成纤维细胞形态,增加a-SMA的表达[(65.5±1.7)vs(140.4±3.0),P<0.05],减少E-cadherin的表达[(82.5±1.0)vs(36.0±2.8),P<0.05),促进ILK的表达[(36.1±3.1)vs(82.4±1.2),P<0.05],促进FN的合成[(54.6±3.1)mg/Lvs(124.8±3.2)mg/L,P<0.05],加入大黄素后上述变化受到明显抑制.结论:在IL-1β诱导的TEMT中ILK的表达是明显上调的,大黄素可能通过下调ILK的表达而抑制IL-1β诱导的TEMT.
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高氧对早产大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞转分化的影响
目的: 探讨高氧对早产鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(type II alveolar epithelial cells, AECⅡ)转分化的影响.方法: 原代培养早产大鼠的AECⅡ, 建立高氧细胞损伤模型.利用倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞的形态变化.用免疫细胞化学染色法检测AECⅡ特异性肺泡表面活性蛋白-C(surfactant protein C, SP-C)及Ⅰ型肺泡上皮细胞(typeⅠ alveolar epithelial cells, AECⅠ)特异性水通道蛋白5(aquaporin5, AQP5)的表达.用RT-PCR和流式细胞术分别检测SP-C、 AQP5 mRNA及蛋白的表达.结果: 随着给氧时间的延长, 原代培养的AECⅡ伸展变平, 失去其板层体及微绒毛, 丧失AECⅡ的特性, 获得AECⅠ样外观.伴随其形态学改变, AECⅡ逐渐停止表达其特异性蛋白SP-C, 开始表达AECⅠ特异性蛋白AQP5.高氧组给O2后24、 48及72 h, SP-C mRNA、 SP-C+细胞的表达率及荧光指数(fluorescence index, FI)较同时间点的空气组明显降低, AQP5的上述指标在24 h和48 h则较空气组明显增加.高氧组给O2后72 h, AQP5的表达开始减弱, 与同时间点的空气组相比较无明显差异.结论: 高氧诱导的早产大鼠AECⅡ转分化在肺泡上皮细胞损伤的修复中起重要作用.
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体外诱导人羊膜上皮细胞分化为结膜上皮样细胞
目的 将人羊膜上皮细胞(HAEC)和兔结膜上皮细胞共培养,观察是否能将HAEC诱导分化为结膜样上皮细胞.方法 分别采用酶消化法和组织块法获得HAEC和兔结膜上皮细胞,并对培养的细胞进行形态学观察;运用TranswellTM非接触共培养系统将HAEC和兔结膜上皮细胞共培养2周,诱导HAEC分化;通过免疫荧光组织化学染色法检测诱导后HAEC中细胞角蛋白4(CK4)、黏蛋白Muc4、Muc5AC的表达,实时定量PCR(qRT-PCR)检测分化细胞Muc4、Muc5AC mRNA的表达.结果 体外培养的人羊膜上皮细胞和兔结膜上皮细胞形态较为相似,免疫荧光组织化学染色法检测到诱导后HAEC中CK4、Muc4、Muc5AC呈阳性表达,qRT-PCR检测分化细胞Muc4、Muc5ACmRNA表达阳性.结论 HAEC在与兔结膜上皮细胞共培养的诱导条件下,可以向结膜上皮样细胞和产黏蛋白细胞转分化.
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胰岛素样生长因子-Ⅰ对人肾小管上皮细胞转分化及胶原合成的作用
目的:探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)在人肾小管上皮细胞转分化及胶原合成中的作用.方法:将体外培养的人肾小管上皮细胞HK2分为2组: (1)对照组; (2)IGF-Ⅰ组: 培养液中加入终浓度分别为25、50、100、200 μg/L的IGF-Ⅰ.用倒置显微镜观察细胞形态变化,以RT-PCR检测HK2细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原Ⅰα和胶原Ⅲα mRNA表达的变化.ELISA方法检测培养上清中胶原Ⅰ的浓度.结果:IGF-Ⅰ刺激使HK2 细胞由椭圆形变为梭形.不同浓度的IGF-Ⅰ作用于HK2 细胞48 h后,α-SMA、胶原Ⅰα和胶原Ⅲα mRNA水平显著升高(P＜0.05); ELISA结果显示,100及200 μg/L IGF-Ⅰ组中HK2 细胞分泌的胶原Ⅰ显著增加(P＜0.05).结论:IGF-Ⅰ在体外能够诱导人肾小管上皮细胞转分化,并促进其胶原的合成.
关键词： 胰岛素样生长因子-Ⅰ 肾小管上皮细胞 转分化 胶原 -
甲状旁腺素对人肾小管上皮细胞转分化和TGF-β1表达的影响
目的:通过观察甲状旁腺素(PIH)对体外培养的人肾小管上皮细胞转分化和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响,以探讨PTH在肾间质纤维化发病机制中的作用.方法:体外培养人近端肾小管上皮细胞(HK-2),分别用不同浓度的PTH(10-12、10-11、10-10、10-9、10-8 mol/L)作用于HK-2细胞48 h,以及10-8 mol /L作用于HK-2细胞不同时间(12、24、48、72 h).应用RT-PCR法检测HK-2细胞内α-SMA、TGF-β1 mRNA表达水平,免疫细胞化学法检测HK-2细胞表达α-SMA阳性细胞百分数,Western blot法检测细胞内α-SMA的蛋白表达水平.结果:(1)RT-PCR结果表明,PTH呈剂量和时间依赖性地促进HK-2细胞α-SMA、TGF-β1 mRNA的表达(P＜0.01),且两者之间呈正相关(P＜0.05).(2)免疫细胞化学结果表明,PTH可增加表达α-SMA阳性的HK-2细胞百分数,且呈剂量和时间依赖性(P＜0.05).(3)Western blot结果表明,PTH 可增加HK-2细胞α-SMA的蛋白表达量,也呈剂量和时间依赖性(P＜0.01).结论:PTH可通过促进肾小管上皮细胞转分化以及TGF-β1的表达促进肾小管间质纤维化.
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诱导多能干细胞与转分化在心肌再生中的研究进展
以往认为,心肌受损后,心肌细胞不能再生,常由瘢痕组织修复,从而使心脏失去结构与功能上的完整性.随着心肌再生机制研究的不断深入和转化医学的发展,已证实在一定条件下,心肌能够再生并产生正常的心肌细胞,并已逐渐成为临床上心肌损伤修复的研究热点.本文对诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)与转分化在心肌再生领域的研究进展做一综述,旨在为心肌再生的临床治疗提供新的思路.
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PI3K/AKT信号通路在CTGF促人增生性瘢痕成纤维细胞转分化中的作用
目的:探讨磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路是否介导结缔组织生长因子促人增生性瘢痕成纤维细胞转分化.方法:体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞,实验分3组:①空白对照组;②结缔组织生长因子(10ng/ml)刺激组;③磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002(10μmol/L)预处理后结缔组织生长因子刺激组.应用免疫印迹技术检测48h后a-平滑肌肌动蛋白的表达,应用流式细胞术检测a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率.结果:和空白对照组相比,结缔组织生长因子刺激组细胞a-平滑肌肌动蛋白表达和阳性细胞百分率升高;经磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002预处理后,再以结缔组织生长因子刺激,细胞a-平滑肌肌动蛋白表达和阳性细胞百分率升高水平下降,经统计学分析,差别具有显著性(P＜0.05).结论:结缔组织生长因子能够促进人增生性瘢痕成纤维细胞转分化,磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路介导该效应,磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002可抑制此效应.
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星形胶质细胞转分化为神经元在神经再生中的研究进展
星形胶质细胞是广泛存在于中枢神经系统内的一类胶质细胞,在建立和维持正常脑功能以及脑损伤后修复中具有重要作用.近几年发现,特定区域脑损伤后星形胶质细胞发生活化,甚至转分化为神经元谱系,表现出类似于神经前体细胞的特性,这一重要的潜能使得星形胶质细胞成为神经再生领域研究的焦点.本文就星形胶质细胞的基本特性、其转分化为神经元的模型以及介导转分化发生的细胞与分子学机制等综述如下.
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胸腺素β4对细胞迁移和转分化的影响及在眼科的研究进展
胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4)作为一种主要的G-肌动蛋白偶联蛋白存在于绝大多数哺乳动物细胞,具有促进细胞迁移、干细胞分化、血管形成,并抗细胞凋亡、调节免疫功能等多种生物学作用,在创伤修复、肿瘤转移、控制炎症等过程中发挥重要作用.我们就Tβ4对细胞迁移和转分化的影响及其在眼科的研究进展进行综述.
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CTGF siRNA转染对体外培养人晶状体上皮细胞株B3转分化的抑制作用
目的:研究脂质体介导CTGF siRNA 转染对人晶状体上皮细胞(HLEC)株B3 CTGF和α-SMA表达的影响.方法:5`-异硫氰酸荧光素标记的CTGF siRNA与脂质体混合,并转染HLECs,通过荧光转染评估转染率.我们用CCK-8来评价转染组和对照组的细胞活力并使用实时定量RT-PCR,细胞免疫化学和Western blot来分析CTGF和α-SMA在转染后的表达改变.结果:脂质体介导的CTGF siRNA转染呈现出高效的转染率.转染率在24h高达95%.CTGF siRNA 72h转染能有效抑制HLECs的增殖.CTGF siRNA转染24h后CTGF和α-SMA的表达量都显著下降,而对照组则无类似效应.结论:CTGF siRNA 能够有效降低CTGF和α-SMA的表达.
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溶血磷脂酸对人类视网膜色素上皮细胞生物学功能的影响研究
目的:研究溶血磷脂酸(Iysophosphatidic acid,LPA)对体外培养人类视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelialium,hRPE)细胞增殖活力、分化特性及免疫活性等生物学功能的影响.方法:采用MTT法检测体外培养hRPE细胞增殖活力;角蛋白及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)免疫细胞化学染色方法分析体外培养hRPE细胞分化特性;流式细胞术检测hRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、ICAM-l的表达.结果:加药后第2d开始LPA组吸光度明显高于对照组(P＜0.001);角蛋白18表达对照组较LPA组强(uc=-12.683,P＜0.001),α-SMA表达对照组较LPA组弱(uc=10.402,P＜0.001);hRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、ICAM-1的阳性细胞率和平均荧光强度组间差异无统计学意义(各指标均P＞0.05).结论:LPA明显促进hRPE的增殖活力,促进hRPE转分化,在PVR形成过程中起潜在的促进作用,但对hRPE免疫活性无影响.
关键词： 人类视网膜色素上皮细胞 溶血磷脂酸 细胞增殖 转分化 免疫活性 -
外源性结缔组织生长因子对人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成的作用
目的:探讨外源性结缔组织生长因子(CTGF)在人肾小管上皮细胞转分化及细胞外基质合成中的作用.方法:将体外培养的人肾小管上皮细胞HK2分为三组:对照组;CT-GF小剂量组(终浓度为2.5 μg/L);CTGF大剂量组(终浓度为20 μg/L).用倒置显微镜观察细胞形态学变化;噻唑蓝(MTr)法检测细胞增殖活性;RT-PCR检测HK2细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),纤连蛋白(FN)和胶原ⅠαmRNA水平的变化;免疫组织化学方法观察HK2细胞FN和胶原Ⅰ的表达.结果:CTGF刺激使HK2细胞由椭圆形变为梭形,同时促进HK2细胞增殖.不同浓度的CTGF作用于HK2细胞48 h后,α-SMA和FN mRNA水平显著升高(P＜0.05),E-钙黏蛋白mRNA的表达显著下降(P＜0.05);大剂量CTGF刺激HK2细胞48 h后胶原ⅠαmRNA水平显著升高(P＜0.05).小剂量CTGF组HK2细胞胞质FN表达水平显著增加(P＜0.05),大剂量CTGF组HK2细胞胞质表达FN和胶原Ⅰ均显著增加(P＜0.05).结论:CTGF在体外能够诱导人肾小管上皮细胞转分化,并促进FN的合成,大剂量的CTGF可以增加其胶原Ⅰ的合成.
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毛蕊异黄酮对TGFβ1诱导的内皮细胞转分化相关细胞因子的影响
目的 探讨毛蕊异黄酮对转化生长因子β1(TGFβ1)诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)转分化相关细胞因子的影响.方法 TGFβ1(10μg/L)刺激生长良好的HUVECs,用毛蕊异黄酮(25、50、100μmol/L)进行干预;MTT法检测毛蕊异黄酮对HUVEC的细胞毒性作用;实时定量PCR法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Gremlin、CD31、骨形态发生蛋白7(BMP7)mRNA的表达水平.结果 ①TGFβ1(10μg/L)、25、50、100μmol/L浓度的毛蕊异黄酮对HUVECs无细胞毒性作用(P>0.05).②用TGFβ1刺激HUVECs后,细胞中 α-SMA、Gremlin mRNA的表达水平显著升高,CD31、BMP7 mRNA的表达水平显著降低(P<0.05);毛蕊异黄酮(25、50、100μmol/L)进行干预后,α-SMA、Gremlin mRNA的表达水平显著降低,CD31、BMP7 mRNA的表达水平显著升高,并且表现出一定的浓度依赖性(P<0.05).结论 毛蕊异黄酮能抑制TGFβ1诱导的内皮细胞转分化,具有内皮细胞保护作用.
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肾病肾组织中α-平滑肌肌动蛋白的表达及其意义
目的:研究特发性膜性肾病(IMN)肾组织内α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达及意义.方法:对15例IMN肾活检组织进行α-SMA免疫组化染色,染色结果半定量评分,并与相应肾小球及间质损伤程度比较.结果:各期IMN肾小球及间质α-SMA表达均增高,并分别与肾小球损伤程度正相关(r=0.628,P＜0.05),与间质损伤程度显著正相关(r=0.932,P＜0.01).结论:肾组织固有细胞-肌成纤维细胞转分化在IMN进行性进展中具有重要意义.
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深Ⅱ度烧伤创面汗腺干细胞标志物的变化规律
目的 了解深Ⅱ度烧伤创面愈合过程中汗腺上皮细胞增殖并向表皮细胞转化的规律,探讨其机制.方法 选择2004年1月-2007年12月,江苏省泰州市第四人民医院和山东大学第二医院收治的四肢与躯干烧伤患者28例.收集患者深Ⅱ度烧伤创面组织标本37块、浅Ⅱ度烧伤创面组织标本21块、正常皮肤标本10块.采用免疫组织化学双染色法,观察细胞角蛋白10(CK10)、CK14、CK19、bel-2和P63在深、浅Ⅱ度烧伤创面及正常皮肤汗腺分泌部上皮细胞中的表达情况.结果 正常皮肤汗腺分泌部上皮细胞中等强度表达CK19、CK14和CK10,基底层肌上皮细胞微弱表达P63和CK14,CK10表达阳性的终末分化细胞不表达bcl-2和P63.浅Ⅱ度烧伤创面修复过程中,其汗腺分泌部结构及上述蛋白表达未见异常.深Ⅱ度烧伤后7 d创面汗腺分泌部上皮细胞P63和bcl-2表达增强;伤后8～10 d创面基底细胞增殖、迁移和鳞状上皮化,形成bcl-2、P63、CK19和CK14表达强阳性的实心岛状上皮结构,并随肉芽组织向创面浅层迁移,经鳞状上皮增殖完成创面再上皮化.深Ⅱ度烧伤创面愈合后13～30 d,超常增殖的表皮基底层和基底上层细胞仍强烈表达bcl-2、CK14、CK19和P63. 结论干细胞和短暂扩充细胞逆分化过程导致上皮生长滞后和肉芽组织过度增殖,这种失衡现象可能是导致深Ⅱ度烧伤创面修复失控的重要机制之一.
