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DegraPol支架上培养人气管软骨细胞体外合成组织工程软骨
目的 探讨以人气管软骨细胞(HTC)为种子细胞在新型生物材料DegraPol泡沫支架上体外合成组织工程气管软骨的可行性.方法 从肺移植供体(9例)取人气管软骨片段,胶原酶消化,将所获软骨细胞传代培养,将传代至6～8代的HTC种植到DegraPol支架上体外静态培养.种植前行Ⅱ型胶原免疫组织化学染色.于体外静态培养第2小时末和第3、7、21、42天取HTC-DegraPol复合物用噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖活性;培养3周后取HTC-DegraPol复合物制备组织学检测标本行阿辛蓝染色观察硫酸软骨素分泌情况,并制备扫描电镜标本观察HTC在DegraPol支架中培养后的超微结构.结果 HTC在传代培养中显示稳定的增殖活性并分泌Ⅱ型胶原.种植到DegraPol支架中后培养2 h和3、7、21、42 d时MTT法测定的A值分别为0.112±0.004、0.151±0.021、0.170±0.035、0.176±0.023和0.213±0.023(每个时点n=4).培养21、42 d与培养2h比较,活性HTC数量差异均有统计学意义(P＜0.05).阿辛蓝染色显示HTC-DegraPol复合物的基质分泌硫酸软骨素,证实HTC-DegraPol复合物具有软骨样结构.扫描电镜观察显示新生软骨在DegraPol材料表面和中央均有形成,但以表面为主.结论 HTC可以在体外良好扩增并以多孔生物材料DegraPol为支架体外合成组织工程气管软骨,但培养条件应进一步优化.
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人脱细胞软骨细胞外基质对异种软骨种子细胞的影响
目的观察人脱细胞软骨细胞外基质（hACAM）对异种兔软骨种子细胞增殖和表型的影响。
方法将差速梯度离心法制作的人脱细胞软骨细胞外基质，配制成0.5%的浆料，分别铺于6孔细胞培养板和96孔细胞培养板，形成1 mm 厚的薄膜，以此培养板为实验组。空白对照组培养板仅使用单纯培养液培养。在培养板上培养兔关节软骨细胞。通过 hochest33258染色验证人软骨细胞外基质脱细胞完全与否；分别在第5、15天两个时间点，通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色观察两种培养方法的兔软骨细胞的生长形态、细胞表型和增殖情况，用 CCK-8细胞增殖实验比较两种培养方法在第1、3、7、10天的增殖情况。结果通过 hochest33258染色发现差速梯度离心的人软骨细胞外基质脱细胞完全。通过倒置显微镜观察第5和15天的实验组细胞增殖情况优于空白对照组，甲苯胺蓝染色的结果也证明这个观点；CCK-8细胞增殖试验显示第7天hACAM 组在细胞增殖方面明显地优于单纯培养液的对照组（P=0.0298），hACAM 组的软骨细胞与空白组的软骨细胞在第10天的增殖情况相比没有统计学差异。
结论 hACAM 免疫原性低，无细胞毒性，能够很好地促进异种软骨细胞的增殖。 -
旋转生物反应器培养对组织工程气管软骨力学强度的影响
目的 研究旋转生物反应器培养对组织工程气管软骨力学强度的影响,探索适宜的组织工程气管软骨培养方法 .方法 分离2周龄Lewis大鼠剑突软骨细胞传代培养,收集第3代软骨细胞种植到DegraPol管状支架上,静态培养7 d,然后将软骨细胞-支架复合物分别置于旋转生物反应器内培养(生物反应器组)或继续静态培养培养3周(静态培养组).取出软骨细胞-支架复合物,以噻唑蓝(MTT)法测定软骨细胞增殖活性,结果 以吸光度(A)值表示(每组n=6);以Zwick1445型材料试验机测定软骨细胞一支架复合物的大应变值和应力值(每组,n=4);并制备扫描电镜标本,观察软骨细胞在DegraPol支架中培养后的超微结构变化.结果 不同条件下培养3周,生物反应器组和静态培养组A值分别0.17±0.05、0.12±0.01,大应力值分别为(0.33±0.04)和(0.26±0.01)MPa,大应变值分别为(3.53±0.91)和(1.71±0.13)mm/mm,2组间3项指标的差异均有统计学意义(均P<0.05).扫描电镜观察显示生物反应器组获得更好的软骨样结构和更多的细胞外基质.结论 旋转生物反应器能够提供更好的体外培养条件,有利于组织工程气管软骨的形成.
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早期体内力学刺激促进藻酸钙复合自体软骨细胞修复羊关节负重区软骨缺损的实验研究
目的 观察膝关节持续被动活动仪(CPM)体内力学刺激对组织工程软骨修复大动物关节负重区软骨缺损效果的影响.方法 研究、设计和制造能够适用于体内力学刺激羊膝关节软骨缺损修复的膝关节连续被动活动仪(CPM);将实验动物(山羊膝关节双髁负重区制造直径6 mm软骨缺损)分为三组:空白组:单纯缺损未植入修复组织;藻酸钙+骨膜+细胞组:藻酸钙复合自体软骨细胞凝胶植入软骨缺损区,自体骨膜覆盖缺损区;藻酸钙+骨膜+细胞+CPM组:藻酸钙复合自体软骨细胞凝胶植入软骨缺损区,自体骨膜覆盖缺损区,术后早期接受CPM锻炼.分别于术后3个月、6个月、12个月(12个月组仅包括CPM力学刺激组)取材,通过修复组织的大体、组织学观察及其评分比较3组软骨修复效果.结果 藻酸钙复合软骨细胞能够较好地修复羊负重区关节面软骨缺损,将缺损修复的大体观察、组织学等结果进行单因素统计学分析,发现接受体内CPM力学刺激组效果好,其修复组织中透明软骨比例多,其次为藻酸钙+骨膜+细胞组.结论 膝关节持续被动活动仪(CPM)体内力学刺激能够促进组织工程软骨修复大动物关节负重区软骨缺损的效果.
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临床用间充质干细胞的质量控制研究
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞.间充质干细胞(MSCs)是属于中胚层的一类多潜能干细胞,主要存在于结缔组织和器官间质中,如骨髓、脂肪、脐带、羊膜组织,间充质干细胞具有强大的增殖能力和免疫调节功能,在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力.间充质干细胞由于具备多向分化和免疫调节功能,因此在治疗一些退行性和自身免疫性疾病等方面具有广阔的临床应用前景.
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瘦素在肿瘤坏死因子-α介导的软骨细胞死亡中的效应
目的：明确瘦素对肿瘤坏死因子-α（TNF -α）介导的软骨细胞死亡是否具有保护作用。方法从大鼠膝关节中分离关节软骨细胞后，采用 TNF -α诱导软骨细胞死亡。将细胞采用瘦素处理3 h 后采用 TNF -α诱导细胞死亡。采用流式细胞术、细胞形态观察、凋亡及坏死蛋白水平检测及荧光染色分析细胞死亡。结果瘦素对 TNF -α诱导细胞死亡具有保护作用，其能够通过部分影响软骨细胞的死亡及坏死发挥保护效应。JNK 信号通路对 TNF -α大鼠关节软骨细胞死亡具有保护作用。结论瘦素对由机械负荷及不利应激导致的软骨细胞损伤具有保护作用，其可能作为一种保护剂在骨关节炎患者治疗中应用。
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买朱尼含药血清对IL-1β作用下兔软骨细胞增殖和凋亡的影响
目的 研究买朱尼·阿扎拉克含药血清对兔关节炎性软骨细胞的增殖和凋亡的调控作用.方法 10只新西兰白兔平均分为五组,分别灌胃生理盐水、买朱尼药液1.1 g、买朱尼药液2.2 g、买朱尼药液4.4 g及塞来昔布药液11.0 mg/(kg·d),用于制备含药血清.细胞学实验分组及处理分别为:正常组(空白血清);模型组(空白血清+10 ng/ml IL-1β);生理盐水组(空白血清+10 ng/ml IL-1β+生理盐水);买朱尼低剂量组(买朱尼低剂量血清+10 ng/ml IL-1β);买朱尼中剂量组(买朱尼中剂量血清+10 ng/ml IL-1β);买朱尼高剂量组(买朱尼高剂量血清+10 ng/ml IL-1β);阳性对照药组(塞来昔布血清+10 ng/ml IL-1β).EdU法检测细胞增殖;Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白(Caspase-3,Caspase-7和Caspase-8)的表达水平.结果 与模型组相比,买朱尼各剂量组显著增加软骨细胞增殖(P ＜0.001),中和高剂量组显著减少软骨细胞的早期凋亡(P ＜0.05),各剂量组Caspase-3,Caspase-7和Caspase-8表达水平显著下降,且均具有剂量依赖性.结论 买朱尼·阿扎拉克通过减少凋亡蛋白表达对兔关节炎性软骨细胞具有保护作用.
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自噬活化在软骨细胞中对线粒体失调的保护作用
目的：明确自噬活化在人软骨细胞线粒体功能失调中的保护作用。方法采用线粒体呼吸链抑制剂 oli-gomycin 处理人软骨细胞，通过分析 LC3- II 分析自噬体活化。通过采用自噬激活剂 Rapamycin 和 Torin 处理人软骨细胞，分析自噬对 oligomycin 介导的线粒体功能失调的保护作用。结果 oligomycin 处理能够导致人软骨细胞线粒体功能失调，从而导致凋亡和死亡的显著增加。此外，细胞自噬的激活也在 oligomycin 处理的细胞中被观察到。采用自噬激活剂 Rapamycin 和 Torin 处理人软骨细胞，能够对线粒体功能起到保护作用。结论自噬在人软骨细胞线粒体功能失调中具有保护作用。自噬相关药物的介入可能对软骨细胞具有保护作用。
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重组人生长激素在儿童生长方面的应用进展
人体的生长激素是脑垂体前叶分泌的一种蛋白质激素,它是体内重要的促进生长的激素.儿童身高的增长主要是通过长骨的骨干与骨骺之间的软骨板中的细胞分裂增殖实现的,生长激素正是对这种软骨细胞的分裂增殖具有显著的促进作用.
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电针对兔膝骨关节炎软骨细胞基质金属蛋白酶-13表达的影响
探讨电针对兔膝骨关节炎(KOA)模型软骨细胞基质金属蛋白酶-13(MMP-13)表达的影响.方法:30只新西兰大耳兔随机分为正常组、模型组及电针治疗组.正常组不造模,模型组和电针治疗组均采用左膝关节伸直位管型石膏固定法,建立KOA模型.喂养6周后,电针组电针治疗10d.各组均取股骨内侧髁软骨,观察软骨细胞及MMP-13的变化.结果:按Mankin评分比较软骨结构,各组间差异有显著性(P＜0.05).正常组MMP-13未检出,模型组MMP-13检出率较高,电针治疗组MMP-13检出率下降.MMP-13在KOA软骨细胞中的表达与正常组差异有显著性意义,电针治疗组与模型组差异有显著性意义(P＜0.01).结论:电针治疗促使兔骨关节炎模型软骨细胞重新排列,减少软骨细胞中MMP-13表达,对OA治疗有一定作用.
关键词： 电针 骨关节炎 软骨细胞 基质金属蛋白酶-13 -
压应力下兔软骨细胞的凋亡和IL-1β、TNF-α的相关性研究
目的:观察持续及间歇压应力下关节软骨的组织学变化、软骨细胞的凋亡并测定关节液中细胞因子(IL-1β、TNF-α),探讨压应力下软骨细胞凋亡和关节软骨退变的相互关系及压应力下软骨细胞凋亡的相关机制.方法:在活体新西兰大白兔左后肢的髌股关节间造成持续及间歇的不同压应力模型,60只新西兰大白兔,随机分为7组:A组,对照组;B组,持续伸直位;C组,持续屈曲80°位;D组,持续屈曲140°位;B1组,间歇伸直位;C1,间歇屈曲80°位;D1组,间歇屈曲140°位.持续组于1周、2周、4周、6周、8周,间歇组于4周、8周、12周先进行髌股关节间压应力测试,然后取材利用HE染色、甲苯胺蓝染色、TUNEL法等方法观察关节软骨细胞及关节软骨的组织学变化,并采用酶联免疫检测方法测定关节液中细胞因子的含量.结果:关节间持续及间歇的较高压应力可以引起关节软骨细胞凋亡并伴有关节软骨退变,并同时伴有关节液中细胞因子含量的升高;持续的压应力引起的变化大于间歇的压应力;较长时间的关节制动也可以引起上述变化.结论:关节间持续及间歇的较高压应力可以引起软骨细胞凋亡,并继而出现软骨退变,IL-1β和TNF-α在软骨细胞凋亡过程中可能起重要作用.
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低强度脉冲超声波对软骨细胞中金属蛋白酶-13与Ⅱ型胶原的影响
目的:研究低强度脉冲超声波(LIPUS)对体外培养软骨细胞中金属蛋白酶-13(MMP-13)与Ⅱ型胶原的影响.方法:选用6只1月龄的新西兰大白兔膝关节软骨进行体外培养,传至第二代,分为对照组与4个LIPUS辐射组,LIPUS强度分别是20mW/cm2、30mW/cm2、40mW/cm2、50mW/cm2.每天辐射20min,连续10d,每天细胞计数;分别在第5天及第10天收集细胞,采用Western-blot技术、qRT-PCR技术检测软骨细胞中MMP-13、Ⅱ型胶原的含量,并分析两者之间的相关性.结果:①与对照组相比,各LIPUS辐射组软骨细胞数均明显增高(P<0.05),其中40mW/cm2组软骨细胞数高,与其他各辐射组比较有显著性差异(P<0.05);②细胞培养5d和10d后,MMP-13含量均较第0天明显升高(p<0.05).但各辐射组MMP-13含量均较其对照组显著降低(P<0.05);其中40mW/cm2组MMP-13含量低(P<0.05);③细胞培养5d和10d后,Ⅱ型胶原表达量均较第0大明显降低(P<0.05).但各辐射组Ⅱ型胶原表达量均较其对照组显著升高(P<0.05).其中40mW/cm2组Ⅱ型胶原表达量高(P<0.05);④MMP-13与Ⅱ型胶原含量呈负相关(r=-0.757,P<0.05).结论:不同强度的LIPUS体外辐射可促进软骨细胞增殖,抑制MMP-13的表达,延缓Ⅱ型胶原的降解.
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脂肪组织来源的基质细胞向神经细胞分化及其在脑缺血疾病治疗中的应用进展
近年来,细胞移植治疗脑缺血疾病已成为研究热点,多种细胞已被用于基础研究及临床治疗中.目前常用的种子细胞是骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),它在一定的条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌母细胞和神经细胞[1-5].
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楔形鞋垫配合盐酸氨基葡萄糖胶囊对膝关节骨性关节炎的影响
膝关节骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)是一种以膝关节软骨变性、破坏和骨质增生为主要病理改变的疾病.主要症状是膝关节的疼痛、红肿、活动受限及行走困难,严重时可影响日常生活.目前治疗KOA的方法有很多,可分为非手术治疗,包括功能锻炼、物理疗法、运动疗法、药物口服或关节腔注射、中医疗法、矫形辅助器具;手术治疗,包括关节腔冲洗、关节镜下清理、胫骨高位截骨术及膝关节置换术等.国际上新的进展是综合疗法、基因疗法及细胞因子疗法.但这些疗法都只能进行增值修复治疗,但由于软骨细胞的破坏比修复快,无法彻底根治.但大多数学者通过研究证实:通过早期的诊断及有效的治疗可以缓解症状,将病程控制在一定程度内,改善患者的生存质量,延缓骨性关节炎的进展[1].我科于2011年8月-2012年5月间对门诊诊治的64例KOA患者采用楔形鞋垫配合盐酸氨基葡萄糖胶囊疗法,加快软骨细胞修复的同时减轻软骨细胞的破坏,临床观察疗效确切.
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司坦唑醇对体外培养雌激素受抑的青春期大鼠生长板软骨细胞胶原合成的影响
目的 探讨司坦唑醇(stanozolol,ST)对离体培养的促性腺激素释放激素拟似物(gonad0-tropin releasing hormone agonist,GnRHa)处理后青春期大鼠生长板软骨细胞的Ⅱ、X型胶原合成的影响.方法 将6只经GnRHa处理后的雌鼠原代软骨细胞分为时效组(观察ST干预时限的影响)、量效组(观察ST干预剂量的影响).采用免疫组化法检测ST对软骨细胞Ⅱ、X型胶原的表达.结果 ST作用3 d后胶原Ⅱ的表达明显高于对照组(P<0.05),但至第5天却表达下降;而3 d内胶原X分泌量与对照组比较无差异,4天起显著递增(P=0.000).ST各个浓度的软骨细胞胶原Ⅱ表达较基值均明显增加(P<0.01),并以10-9显;10-11 M～10-8 M的ST不增加胶原X表达,至10-7 M始随剂量增加而增,10-5 M时达高值(P<0.01).结论 ST对Ⅱ、X胶原的量效和时效影响存在"错峰"改变,时效影响的差异较量效差异为显著.对保持细胞生长/成熟正平衡,时效影响更需关注.
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不同力学刺激对骨关节炎软骨细胞MMP-13表达作用的实验研究
目的：在细胞水平，观察不同力学刺激对骨关节炎软骨细胞MMP-13表达作用的实验研究。方法利用木瓜蛋白酶关节腔注射法制造骨关节炎模型，模型组对月龄3个月的雄性新西兰大白兔在第1、3、5天行右膝关节4%木瓜蛋白酶注射，0.1 ml/kg，空白对照组注射等量生理盐水，2周后造模成功。将分离培养的兔膝关节软骨细胞随机分为空白对照组、骨关节炎模型组和周期性张应力（CTS）作用组，CTS分别作用6、12、24 h，共5组，每组有15个样本，24 h后留取细胞培养液测定MMP-13变化并比较各组数据。结果兔膝关节正常软骨细胞表达合成一定的MMP-13，骨关节炎模型组MMP-13表达合成明显升高，二者相比差异有统计学意义（P<0.05）；CTS作用组MMP-13含量明显降低，同模型组相比，各组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论周期性生物力学刺激降低了膝关节透明软骨细胞在炎性环境中MMP-13的表达，为骨性关节炎的进一步研究和治疗提供了实验依据。
关键词： 软骨细胞 基质金属蛋白酶-13 应力 -
生长激素对大鼠胫骨生长板软骨细胞胶原Ⅱ表达的影响
目的 探讨生长激素(growth hormone,GH)对离体培养的大鼠胫骨生长板的软骨细胞Ⅱ型胶原(collagen Ⅱ,Col Ⅱ)表达的影响.方法 采用两步酶消化法分离培养5～8只三周龄大鼠生长板的软骨细胞,用RT-PCR和免疫组化的方法分别检测不同浓度GH对软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达.结果 GH能促进软骨细胞ColⅡ的表达并呈浓度依赖性,GH在10～500 ng/ml之间能促进ColⅡ的表达,与对照组比较差均有统计学意义(P＜0.05),并且以100 ng/ml时表达强,随着GH浓度的加大,其促ColⅡ表达的效应逐渐减弱,1000 ng/ml与对照组比较无差异(P＞0.05).结论 GH通过促进软骨细胞ColⅡ的表达能维持软骨细胞的表型,GH在使用过程中不会导致骨龄的增加.
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参芪合剂对羊软骨细胞一氧化氮合成的调节作用研究
目的 探讨参芪合剂(SQHJ)对脂多糖(LPS)诱导的羊软骨细胞一氧化氮(NO)合成的调节作用,了解其治疗类风湿关节炎(RA)和骨关节炎(OA)的机制.方法 取健康小尾寒羊左后膝关节软骨,分离出软骨细胞进行体外培养.用脂多糖刺激软骨细胞分泌一氧化氮,同时加入3种不同浓度的参芪合剂,分别于24、48 h和72 h收集培养细胞上清液,用化学比色法测一氧化氮含量.结果 3种不同浓度的参芪合剂对软骨细胞的一氧化氮合成均有抑制作用(P＜0.01)且以剂量依赖方式发挥作用.浓度为0.5 g/ml的参芪合剂对软骨细胞一氧化氮合成的抑制作用强稳定.结论 丹参与黄芪以一定比例组成的参芪合剂可以抑制软骨细胞一氧化氮的合成,从而控制一氧化氮作为炎性介质造成的软骨损伤.此作用是其治疗RA、OA的作用机制之一.
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芹菜素对实验室兔膝关节软骨缺损的影响观察
目的 研究芹菜素对于转骨形态发生蛋白(BMP-7)软骨细胞修复关节软骨缺损的作用.方法 IL-1β体外诱导兔软骨细胞分泌白细胞介素-8(IL-8)和可溶性细胞黏附因子-1(sICAM-1).在培养系统中加入不同浓度芹菜素(10 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L),采用酶联免疫吸附法检测芹菜素对诱导兔软骨细胞分泌IL-8和sICAM-1的影响.将软骨细胞种植于Matrigel胶支架上,将体外培养出的软骨膜块植入家兔关节软骨缺损模型中,采用随机数字表法分为3组(n=4):假手术组、转BMP-7组和转BMP-7+芹菜素组.5周后进行组织学观察和Wakitani评分.结果 10 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L芹菜素能显著抑制IL-1β诱导兔软骨细胞分泌IL-8和sICAM-1的作用[(6803.63±162.31) ng/g、(6005.74±201.49) ng/g、(5202.34 ±271.67) ng/g比(10011.84±239.29)ng/g,P=0.00],并促进软骨细胞增殖.转BMP-7组和转BMP-7+芹菜素组的Wakitani评分显著低于假手术组[(3.68±0.86)比(8.25 ±0.90),P=0.00；(3.21 ±0.78)比(8.25 ±0.90),P=0.00].另外,还发现芹菜素可减少修复过程中的炎症反应发生.结论 芹菜素可促进转BMP-7软骨细胞膜块构建以及关节软骨缺损的修复.
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成骨细胞与软骨细胞在骨性关节炎中的相互作用综述
骨性关节炎是当前世界范围内常见的关节疾病,常侵犯膝关节、髋关节、手和脊柱等.是老年人群致残的常见病因之一,并严重影响老年人的生活质量.当前普遍的观点认为骨关节炎(0A)影响受累关节内的所有结构,并终导致软骨的退化.当前软骨下骨的变化受到更多的关注,因为随着疾病的进展及软骨细胞的缺失,软骨下骨也会发生结构性的改变.关节软骨和软骨下骨的变化受软骨细胞和成骨细胞的调节,这两种细胞在维持这些组织的完整性和功能方面扮演着重要角色.有证据表明,软骨细胞和骨细胞之间存在化学串扰,骨细胞能通过细胞间信号传导促进软骨细胞代谢.这些疾病发展过程中细胞功能的改变将使我们获得新的疾病标志物.的确,如果软骨和软骨下骨表现为一个相互联系的功能单位,那么对于这两种细胞研究的深入以及骨性关节炎的诊断和治疗将能得到巨大的推动.
