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bFGF对人关节软骨细胞增殖和凋亡的影响
目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外单层培养的人负重关节软骨细胞的增殖和凋亡的影响.方法:对8例来自人负重关节软骨细胞系进行体外单层传代培养,从第2代起试验组培养液中加入bFGF,观察细胞的倍增时间(DT)、流式细胞分析细胞增殖周期和凋亡指数,并与无bFGF组相比较.结果:与未加bFGF相比较,加用10μg/ml bFGF后,DT缩短,S期细胞数升高,细胞凋亡无变化.结论:bFGF能促进培养的人关节软骨细胞生长,不引起细胞凋亡.
关键词： 软骨细胞 碱性成纤维细胞生长因子 增殖 凋亡 关节软骨 -
转化生长因子β1及血管内皮细胞因子在颈椎病椎体软骨终板中的表达变化
目的:研究TGF-β1、VEGF在终板软骨细胞中的表达,探讨椎间盘退变的发病机理.方法:应用免疫组化SP染色法检测TGF-β1、VEGF在15例颈椎病及13例正常椎体软骨终板中的表达,并对其阳性表达结果进行比较.结果:TGF-β1在正常终板软骨细胞表达的阳性细胞数为39.0%±1.96%,与颈椎病终板软骨细胞表达的阳性细胞数28.2%±2.18%相比,差异有统计学意义 (P＜0.05).VEGF在正常的终板软骨细胞表达的阳性细胞数为22.2%±2.13%,与颈椎病终板软骨细胞表达阳性细胞数14.3%±1.68%相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:TGF-β1和VEGF共同参与了椎间盘退变的形成和发展,在椎间盘退变的发病中可能起重要的作用.调节细胞因子(TGF-β1、VEGF)在终板软骨细胞中的表达,可能为椎间盘退变的治疗提供一种新的途径.
关键词： 终板 软骨细胞 转化生长因子 血管内皮细胞生长因子 -
单层培养的人关节软骨细胞生物学行为研究
目的:研究单层培养的人关节软骨细胞生物学行为的改变.方法:对来自8例手术切除负重关节非负重区的软骨细胞在10%DMEM中进行单层传代培养,观察细胞形态学、增殖细胞倍增时间(DT)、细胞Ⅱ型胶原免疫组织化学染色以及流式细胞分析细胞增殖指数(PI)和细胞凋亡.结果:随着传代次数的增加,(1)细胞形态由原代的多角形转变为第3、4代的短梭形、第8、9代的成纤维细胞形态;(2)DT在逐渐延长,PI在逐渐减小;(3)细胞分泌的Ⅱ型胶原逐渐减少;(4)细胞凋亡指数未见明显的改变(P＞0.05).结论:体外单层培养的关节软骨细胞存在着失分化和老化,但第3、4代能较好地保持软骨细胞的生物学行为,可作为种子细胞的来源.
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ANK、 ENPP1及TGF-β1基因在大鼠终板软骨细胞传代培养中的表达变化及意义
目的:通过大鼠终板软骨细胞体外自然传代的退变模型,探讨传代过程中钙化相关基因ANK、ENPP1及内源性生长因子TGF-β1表达的变化及其意义.方法:取大鼠腰椎终板软骨细胞,采用酶消化法及自然传代法分离培养,选取P1、P5及P7代,均在体外培养6 d,分别用HE染色、甲苯胺蓝染色及Real-time RT-PCR法检测软骨标志性基因Ⅱ型胶原、蛋白多糖、转录因子Sox9变化,对终板软骨细胞表型进行鉴定.用Real-time RT-PCR及Western blot检测钙化相关基因ANK、ENPP1的变化,Real-time RT-PCR及ELISA检测生长因子TGF-β1的变化.结果:随着细胞传至P7代,细胞形态上有梭形变趋势.茜素红染色无明显变化.软骨标志性基因Ⅱ型胶原、蛋白多糖及转录因子Sox9表达均明显下调(P＜0.05),钙化相关基因ANK、ENPP1表达均明显下调(P＜0.05),内源性生长因子TGF-β1表达明显下调(P＜0.05).结论:终板软骨细胞传至P7代,终板软骨细胞发生退变,终板软骨细胞内未见钙盐沉积,钙化相关基因ANK、ENPP1下调可能由内源性TGF-β1下调引起,提示调节内源性TGF-β1及钙化相关基因ANK、ENPP1在终板软骨中的表达有可能会阻止椎间盘的退变.
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纤维蛋白凝胶与几丁质对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响
目的 比较纤维蛋白凝胶与几丁质对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向软骨细胞分化的影响,探讨三维支架与软骨组织工程种子细胞BMSCs分化的关系. 方法 BMSCs与几丁质、纤维蛋白凝胶形成复合物,分别体外培养及植入大鼠关节软骨缺损部位.体外培养14d后,进行HE染色、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色;体内培养2周、4周、6周后,对移植物进行形态学观察,表达软骨特异蛋白分析及BMSCs体内示踪.统计学分析BMSCs向软骨分化情况. 结果 体外培养部分,BMSCs-纤维蛋白凝胶组和BMSCs-几丁质组的Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性率与对照组无显著差异;体内移植部分,BMSCs-纤维蛋白凝胶组的甲苯胺蓝染色与Ⅱ型胶原免疫组织化学染色积分吸光度(IA)变化率与对照组有显著差异,其他组别软骨分化与对照组无显著差异. 结论 在体外纤维蛋白凝胶或几丁质诱导BMSCs向软骨细胞分化的作用很弱,在体内BMSCs-纤维蛋白凝胶可促进BMSCs分化成类软骨细胞.
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酸敏感离子通道1a在大鼠椎体终板软骨细胞的表达及其意义
目的 探讨大鼠椎体终板软骨细胞酸敏感离子通道1a (ASIC1a)的表达及其意义.方法 选用成年SD大鼠10只.分离、培养椎体终板软骨细胞以及传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态,甲苯胺蓝染色对终板软骨细胞进行鉴定.利用PT-PCR和Western blotting检测ASIC1a在大鼠椎体终板软骨细胞mRNA及其蛋白的表达,免疫荧光双标观察ASIC1a在终板软骨细胞的细胞定位.结果 形态学及甲苯胺蓝染色阳性显示,培养的细胞为软骨细胞,PT-PCR和Western blotting显示,大鼠椎体终板软骨细胞存在ASIC1a mRNA及其蛋白的表达,免疫荧光显示,ASIC1a在终板软骨细胞膜有阳性表达.结论 ASIC1a在大鼠椎体终板软骨细胞的表达,对认识ASIC1a功能及寻找新抗椎间盘退变靶点有重要意义.
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筋骨痹痛汤药物血清对白细胞介素-1β诱导的兔软骨细胞凋亡的保护作用
目的 观察筋骨痹痛汤药物血清对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的兔软骨细胞Bcl-2、Bax表达及细胞凋亡的影响,探讨筋骨痹痛汤治疗骨性关节炎的机制.方法 随机取雄性成年新西兰兔8只分成4组,分别灌服生理盐水、补肝肾中药(骨碎补、续断和淫羊霍)、独活寄生汤和筋骨痹痛汤,制得空白血清和药物血清.分离制备幼兔软骨细胞,采用甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫荧光法鉴定软骨细胞.取第3代软骨细胞,随机分5组实验:空白组(A组)、模型组(B组)、补肝肾中药对照组(C组)、独活寄生汤对照组(D组)、筋骨痹痛汤组(E组).A组用含10％空白血清的DMEM培养36h,其余各组均先采用含IL-1 β的DMEM诱导培养12h,然后B、C、D、E组分别给予含10％空白血清、10％补肝肾中药药物血清、10％独活寄生汤药物血清、10％筋骨痹痛汤药物血清的DMEM培养24h.实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和免疫印迹法检测兔软骨细胞Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡比例.结果 经鉴定分离制备的细胞为软骨细胞.软骨细胞培养24h后,C、D、E组Bcl-2mRNA和蛋白表达高于B组,D、E组高于C组,E组高于D组,差异均有统计学意义(P＜0.05);BaxmRNA和蛋白表达,以及软骨细胞凋亡率,C、D、E组低于B组,D、E组低于C组,E组低于D组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 筋骨痹痛汤药物血清对IL-1β诱导的兔软骨细胞凋亡具有明显保护作用,其机制可能是通过促进Bcl-2表达和抑制Bax表达,调节Bcl-2与Bax的比例来实现.
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压应力对体外培养的软骨细胞产生细胞因子的影响
目的观察持续及低频间歇压应力对体外培养软骨细胞产生细胞因子(IL-1、IL-6、TNF)的影响,探讨压应力在骨性关节炎发病中可能的作用机制. 方法利用气相静压力装置对原代软骨细胞施压,采用酶联免疫检测方法测定细胞因子的含量. 结果持续压应力可明显诱导软骨细胞产生IL-1、IL-6、TNF;间歇压应力可诱导软骨细胞产生IL-1、IL-6. 结论压应力作用于软骨细胞产生的细胞因子可能在骨关节炎发病过程中起重要作用.
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弹性纤维研究进展
弹性纤维是一种主要存在于结缔组织中的细胞外间质成分,由成纤维细胞、平滑肌细胞、某些软骨细胞等产生,赋予所在器官(如皮肤、肺、动脉、黄韧带、耳廓软骨等)以良好的弹性.在形态学上弹性纤维的结构很简单,光镜下呈现为分支成网的细丝状,直径介于0.2～1.0μm.
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转染白细胞介素1受体拮抗剂与转化生长因子β1软骨细胞和致炎软骨块共培养后炎性因子的变化
目的 观察重组人白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1Ra)和转化生长因子β1(TGF-β1)双基因在体外对兔骨关节炎(OA)的治疗效果.方法 取新西兰大白兔关节软骨经酶消化分离原代培养软骨细胞,并采用特异性细胞外基质Ⅱ型胶原免疫细胞染色进行鉴定.软骨细胞分为转染IL-1Ra组(A组)、转染TGF-β1组(B组)、转染IL-1Ra+TGF-β1双基因组(C组)、未转染组(D组)、空白组(E组).A、B、C 3组均以LipofectamineTM 2000 Reagent脂质体为转染媒介.各组加入软骨块与软骨细胞共培养,除E组外,其余各组均加入20 ng IL-1β,转染共培养后分别在12、24 h、2、4、6 d通过荧光显微镜观察软骨细胞转基因的表达.于共培养第2,4、6天后应用放射免疫分析(RIA)分别检测各组IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量.结果 成功分离培养软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞染色显示细胞胞质染成棕黄色.胞核基本不着色.荧光显微镜下A、B、C组均有绿色荧光蛋白的表达,转染后24 h,3组细胞的转染率高分别为(16.16+2.71)%、(16.54±2.91)%、(17.20±2.39)%,第2天后随时间的延长转染率逐渐降低.同时间点IL-1β水平D组＞B组＞A组＞C组＞E组;而第2、6天TNF-α水平D组＞A组＞B组＞C组＞E组,第4天E组＞A组＞B组＞C组＞D组,其中A组虽然略高于B组,但差异没有统计学意义,其余各组间差异均有统计学意义.A、B、C组的IL-1β和TNF-α在第6天的水平明显低于第2、4天,D、E组IL-1β水平不随时间的延长而改变,TNF-α水平D组在第4天时低,E组则高.结论 转染IL-1Ra和TGF-β1基因均有降低炎性因子水平的作用.联合应用转染IL-1Ra和TGF-β1基因可能控制炎性反应,为体外OA的基因治疗提供实验基础.
关键词： 白细胞介素1受体拮抗蛋白质 转化生长因子β1 软骨细胞 骨关节炎 转染 -
力学刺激对体外软骨细胞的生长与重构影响研究进展
物体处于外力和内部相互作用力构成的复杂力学系统中。力学刺激通过影响细胞内基因表达和蛋白的合成来调节细胞功能，进而调节生物体细胞的分化和生长发育。机体组织中，骨组织容易受周围力学环境变化的影响。体外研究中，软骨细胞容易培养，分化快，容易观察，是生物力学与组织分化关系研究的理想材料。研究表明，周围力学与软骨细胞的形态结构、分化和增殖及改建都有相关性。通过模拟体内软骨组织生长所处微环境动力学特征，构建软骨组织工程的培养系统和培养方法，为体外的软骨细胞生长提供理想的体外培养的力学环境，促进软骨组织生物力学特性的改善，是软骨组织研究与发展的新方向［1］。软骨组织对生物力学的适应性保证了口腔组织的生长发育和正常的生理活动，力学因素对软骨细胞改建的影响对口腔医学的正畸、修复、外科治疗等具有重要的指导意义，对口腔来源的各类软骨细胞培养体系施加力学干预以研究其改建及调控机制。
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交联羧甲基甲壳素三维支架用于软骨组织工程的细胞实验
目的：制备交联羧甲基甲壳素三维支架，并用于兔耳软骨细胞的共同体外培养，讨论此三维支架用于组织工程的可行性。方法交联法制备交联羧甲基甲壳素三维支架；分离、培养的兔耳软骨细胞，接种于三维支架浸泡的培养基上，倒置显微镜观察软骨细胞形态。通过II型胶原免疫荧光染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色来鉴定Ⅱ型胶原含量；甲苯胺兰和阿利新蓝染色进行鉴定蛋白聚糖含量。结果组织染色显示兔耳软骨细胞在交联羧甲基甲壳素三维支架膜浸泡培养基中生长良好，形态正常，增殖旺盛。结论成功制备交联羧甲基甲壳素三维支架；兔耳软骨细胞与交联羧甲基甲壳素三维支架有良好相容性，无毒性，可以用于进一步构建组织工程软骨。
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张力刺激对关节软骨细胞β-肌动蛋白mRNA表达的影响
目的 观察张力刺激对关节软骨细胞β-肌动蛋白(β-aetin)mRNA表达的影响.方法 分别获取正常和骨关节炎关节软骨细胞,给予3%、6%和15%的张力刺激,运用实时定量PCR方法检测不同张力刺激强度下关节软骨细胞β-actin mRNA表达的变化.结果 6%和15%的张力刺激均可明显提高lE常关节软骨细胞β-actinmRNA表达(1.34±0.05,1.36±0.04,P＜0.05),而只有15%的张力刺激才能明显增加骨关节炎关节软骨细胞β-actin mRNA表达.结论 关节软骨细胞β-actin mRNA表达量随张力刺激强度不同而变化,不同内外环境使关节软骨细胞对张力刺激的反应不同,故在其相关生物力学研究中不能应用β-actin作为内参.
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胶原复合梯度磷酸三钙负载软骨细胞的体外培养
目的 观察新型三维支架材料胶原复合梯度磷酸三钙在体外与软骨细胞的相容性和黏附性,评价其作为软骨组织工程支架的可行性.方法 取8周龄新两兰大白兔膝关节软骨,以酶消化法获得高纯度软骨细胞,培养3代后与三维支架材料胶原复合梯度磷酸三钙在体外复合培养.用倒置相差显微镜、HE染色、免疫组织化学及扫描电镜观察软骨细胞形态、Ⅱ型胶原表达及成软骨能力,同时观察支架材料与软骨细胞的相容性.结果 扫描电镜观察显示支架材料具有疏松多孔结构,孔隙结构规则,孔径100～150 μm,材料内部孔与孔之间贯通良好.支架亲水性好.软骨细胞吸附于支架表面,增殖并逐渐顺孔隙迁徙至支架内部,在孔壁贴附良好,表型维持稳定,可分泌细胞外基质.结论 胶原复合梯度磷酸三钙三维支架具有良好的细胞相容性.
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胰岛素样生长因子I与透明质酸对人关节软骨细胞的作用
目的探讨胰岛素样生长因子I(IGF-I)和透明质酸(HA)联合培养对人关节软骨细胞增殖及其生物学行为的影响.方法分离培养人关节软骨细胞,分4组,分别为对照组、IGF-I组、HA组和IGF-I+HA组.加入不同浓度的IGF-I、HA、IGF-I和HA,用四氮甲基唑蓝(MTT)法测定不同时间点软骨细胞增殖活性的变化.从第4代开始,用IGF-I和HA联合培养,通过电镜观察、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原和软骨蛋白聚糖(aggrecan)免疫组化及RT-PCR判断联合培养第8代软骨细胞表型的变化.自然传代的第6代细胞为对照组.结果 IGF-I在10μg/L浓度时即可明显促进软骨细胞的增殖,当IGF-I浓度为50μg/L时,其促增殖作用达大值.单独应用不同浓度的HA对人关节软骨细胞的促增殖作用不明显.联合应用IGF-I与HA对软骨细胞的增殖具有协同效应并使促增殖作用时间后延.IGF-I和HA联合培养的第8代细胞胞质内含有丰富的粗面内质网和分泌小泡;RT-PCR显示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性而Ⅰ型胶原mRNA表达阴性;甲苯胺蓝染色显示细胞质内有大量的紫色异染颗粒;Ⅱ型胶原和aggrecan免疫组化见92%的细胞染色呈阳性或强阳性,平均灰度分别为85.92±9.71和116.23±16.69.而对照组的平均灰度值分别为105.12±12.20和135.68±10.65,二者均显著低于对照组(P<0.01).结论 IGF-I明显促进软骨细胞的增殖;HA对软骨细胞的增殖无影响;二者联合培养促增殖能力更强,并且能有效地保持软骨细胞表型的稳定.
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受体MDA5介导poly Ⅰ∶C诱导软骨细胞焦亡的机制研究
目的 探讨受体MDA5介导poly Ⅰ∶C诱导软骨细胞焦亡的分子机制,为临床治疗骨关节病提供参考. 方法 采用CCK-8法检测细胞增殖;采用流式细胞术分析细胞周期、细胞线粒体膜电位及细胞凋亡率;采用Real Time-PCR测定软骨细胞经poly Ⅰ∶C作用后相关炎性基因的表达水平. 结果 poly Ⅰ∶C抑制软骨细胞的增殖并呈时间及剂量依赖性,其中24 h、48 h的IC50分别为1.1 μg/ml和0.7 μg/ml;将细胞阻滞在sub-G0期,引起线粒体膜电位下降;显著诱导炎性细胞因子IL-6、IL-8、IL-33、TNF-α基因高表达,表达差异具有统计学意义(P＜0.05);激活细胞炎性死亡相关Caspase-1、NLRP3、IL 1β、IL-18基因表达显著升高(P＜0.05);poly I:C作用后,胞内受体MDA5高表达,为对照组的118倍,提示其可能参与软骨细胞的增殖调控及细胞焦亡过程. 结论 poly Ⅰ∶C转染软骨细胞后与MDA5受体结合,激活其下游的信号通路,促进炎症因子的转录,降低线粒体膜电位、阻滞细胞周期,进而抑制软骨细胞增殖、诱导细胞焦亡.
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兔脂肪干细胞与软骨细胞微球共培养成软骨分化适诱导比例的实验研究
通过间接共培养ADSC与软骨细胞微球,得出使ADSC发生软骨向分化的佳比例.体外分离培养新西兰大白兔ADSC和软骨细胞,制成微球分置于Tranwell上下室,实验分为阳性对照组,阴性对照组,生长因子对照组及不同比例(0.5∶1;1∶1;1∶2;1∶3;1∶5;1∶7)的ADSC和软骨细胞共培养组,培养28天后分别行组织形态学观察,GAG、COL-Ⅱ和COL-X的定性定量检测.阿利新蓝-核固红染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色显示比例为0.5∶1和1∶1的阳性较弱,而X型胶原在生长因子对照组的表达为强烈.DMMB法显示总GAG含量在共培养组较阴性对照组均有所增加(P＜0.05),且增加量与软骨细胞的比例呈正相关,但是在ADSC∶AC比例达到1∶5之后有所下降.OHP检测总胶原蛋白的变化同上,且1∶5组中沉积的胶原量比阴性对照组高出7.3倍.能够使ADSCs大程度的表达软骨特异性细胞外基质,同时使COL-X等软骨肥大标志无明显上调的ADSC与软骨细胞的比例为1∶5,共培养诱导较生长因子能够抑制ADSC软骨向分化后的肥大问题.
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压应变作用下组织工程软骨的构建
在压应变作用下构建组织工程化软骨.以大鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)为种子细胞,以壳聚糖海绵为支架材料.利用压应变加载装置对细胞-壳聚糖海绵支架材料的复合物进行体外动态加载,7d后植入大鼠背部皮下,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白的分泌,甲苯胺蓝染色检测酸性糖胺多糖的分泌;利用材料试验机对组织块进行生物力学性能检测,从弹性模量方面对比工程化软骨与正常软骨的差异.在大小为1%、频率为1Hz的压应变条件下,构建的组织工程化软骨经体内移植后,分泌软骨基质Ⅱ型胶原及酸性糖胺多糖,其弹性模量较植入前显著增强.在压应变作用下,细胞复合壳聚糖支架材料可以形成初级的组织工程化软骨.
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旋转生物反应器用于提高组织工程气管软骨力学强度的实验研究
针对体外静态培养方法的缺点,采用旋转生物反应器培养组织工程气管软骨,探讨工程化软骨合适的体外培养条件.选用大鼠剑突软骨细胞种植到DegraPol管状支架上,然后分别于传统静态培养和生物反应器内培养.于体外培养3周和6周后,取出软骨细胞-DegraPol支架复合物,以噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖活性,GAG浓度测定细胞外基质分泌情况,应力-应变机械力学方法测定大应变和应力的变化,并制备扫描电镜标本观察软骨细胞在DegraP01支架中培养后的超微结构.体外培养3周应用MTT法测定A值分别为:静态培养的细胞-支架复合物组0.12±0.01,生物反应器组0.17±0.05(每组n=6).GAG浓度测定静态培养组为(0.14±0.03) μg/mg,生物反应器组为(0.22±O.03) μg/mg(每组n=6).应力-应变机械力学测定结果为,体外培养3周应变值:生物反应器组为(3.53±0.91),静态培养组为(1.71±0.13).应力值生物反应器组为(0.33±0.04) MPa,静态培养组为(0.26±0.01) MPa.体外培养6周应变值:生物反应器组为(0.57±0.10),静态培养组为(0.48±0.07),应力值生物反应器组为(0.16±0.02) MPa,静态培养组为(0.09±0.02) MPa(每组n=4).扫描电镜观察显示生物反应器组获得更好的软骨样结构和更多的细胞外基质.应用旋转生物反应器能够提供适宜的机械应力刺激,可作为体外构建组织工程化气管软骨的可行的培养方法.
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组织工程软骨培养的细胞自动机算法模型与优化
建立一个基于细胞自动机算法的软骨细胞和干细胞体外动态培养数学模型,并进行模拟计算与优化,为组织工程软骨的体外培养控制软件的编写提供理论依据.建立细胞自动机算法模型,采用软骨细胞和软骨干细胞作为研究对象进行Matlab仿真实验.实验分为3组,每组各自设置空白对照组、快速扩增组、力学刺激组、扩增与力学刺激复合培养组.空白对照组的结果显示,软骨细胞和干细胞诱导软骨细胞的细胞占空间区域分别为51％和45％;综合考虑细胞生长情况,软骨细胞培养佳压强施加大小为100 kPa;干细胞诱导培养佳压强施加大小为15 kPa.运用细胞自动机算法建立的数学模型来动态培养软骨细胞,可以为体外生物反应器控制软件的编写提供理论依据,对于组织工程培养软骨组织及其他器官培养是一种有效的可供参考的方法.
